Biorilevamento ottico

I biosensori ottici sono sensori che rilevano un bersaglio biologico o bersagli di interesse utilizzando la luce. Questi dispositivi hanno trovato applicazioni nel settore sanitario, farmaceutico, monitoraggio ambientale, sicurezza nazionale e persino sul campo di battaglia. I biosensori ottici sono ampiamente suddivisi in sensori basati su etichette e senza etichette. Un esempio di rilevamento basato su etichette è la reazione a catena della polimerasi, o PCR, che utilizza etichette fluorescenti, o fluorofori, per quantificare il DNA bersaglio amplificato. Un esempio di metodo senza etichetta è Surface Plasmon Resonance, o SPR. Qui, l'interazione inalterata delle biomolecole con la superficie del sensore viene quantificata misurando una caratteristica fondamentale del sensore, come l'angolo di riflessione. Questo video esamina le basi di entrambi questi tipi di tecniche di biorisensamento ottico e dei suoi componenti critici, i principi di funzionamento e le applicazioni comuni dei biosensori ottici.

In primo luogo, diamo un'occhiata ai principi generali del biorisensamento ottico basato su etichette. In genere, una sonda o un elemento di bioriconoscimento, come un anticorpo complementare, è attaccato sulla superficie del sensore utilizzando la tradizionale chimica di immobilizzazione. La soluzione campione viene quindi portata sulla superficie dei sensori. La molecola bersaglio, che è complementare all'elemento di biorisognizione immobilizzato, viene catturata selettivamente dalla complessa soluzione campione. Quindi la soluzione campione in eccesso viene lavata via con tampone o acqua. Successivamente, per aiutare a visualizzare e quantificare la quantità di bersaglio legato, una molecola secondaria che è complementare al bersaglio e attaccata a un fluoroforo, viene fluita attraverso il sistema. Dopo un po 'di tempo, quando si è verificato il legame della molecola secondaria al bersaglio, il fluoroforo non legato in eccesso viene lavato via. L'intensità del fluoroforo legato può quindi essere quantificata utilizzando un microscopio fluorescente. Questa intensità viene prima tracciata per varie concentrazioni target note per creare una curva di calibrazione, che consente quindi la misurazione diretta di una quantità sconosciuta di bersaglio catturato. Pertanto, le tecniche basate su etichette utilizzano l'intensità di fluorescenza di fluorofori estremamente sensibili per quantificare la concentrazione della biomolecola di interesse.

Ora che abbiamo esaminato i principi dei biosensori ottici basati su etichette, diamo un'occhiata a un esempio comunemente usato, l'attuale standard per l'amplificazione del DNA, la PCR quantitativa o la qPCR. La miscela di reazioni qPCR include una sonda etichettata per la quantificazione della reazione in tempo reale. La sequenza della sonda è attaccata sia a molecole fluorescenti reporter che a molecole quencher e si lega a una specifica sequenza di DNA. La molecola di quencher spegne l'emissione del fluoroforo mentre entrambi sono attaccati alla sonda. Durante la reazione PCR, l'enzima polimerasi degrada il DNA della sonda e separa fisicamente il reporter del fluoroforo, impedendo così la tempra e determinando un aumento della fluorescenza. Per eseguire la qPCR, aggiungere prima tutti i componenti della reazione, comprese le sonde etichettate, in un tubo PCR o in un pozzo. Quindi, posizionare i pozzetti PCR in un termociclatore specializzato e inserire i parametri per ciascun ciclo e il numero di cicli. Il termociclatore utilizzato per la qPCR include una sorgente luminosa con i componenti ottici necessari per selezionare una lunghezza d'onda e un rilevatore per misurare l'intensità della fluorescenza in tempo reale durante la reazione PCR. Alla fine di ogni ciclo termico, l'intensità fluorescente dovuta ai fluorofori rilasciati viene registrata e tracciata. L'intensità fluorescente è direttamente proporzionale al logaritmo della concentrazione target nel pozzo di reazione, e quindi, per una fluorescenza nota, è possibile calcolare la concentrazione target sconosciuta.

Vediamo ora come il rilevamento può essere ottenuto senza alcun reporter, come i fluorofori, utilizzando tecniche di rilevamento ottico prive di etichette. Per le tecniche label-free, l'immobilizzazione dell'elemento bioriconoscimento è la stessa della tecnica label-based. Qualsiasi attacco di biomolecola alla superficie di questi sensori modifica l'indice di rifrazione nelle immediate vicinanze del dispositivo ottico. Le molecole bersaglio si legano alla superficie del dispositivo ottico funzionalizzato formando uno strato sottile e modificando ulteriormente l'indice di rifrazione. Questi cambiamenti nell'indice di rifrazione possono essere monitorati monitorando il cambiamento nella frequenza naturale della vibrazione o nella frequenza di risonanza del sistema. La differenza nelle frequenze di risonanza prima e dopo il legame del bersaglio, chiamato f shift, è direttamente proporzionale alla concentrazione del bersaglio catturato.

Ora diamo un'occhiata ai principi di base di una tecnica di rilevamento ottico senza etichetta comunemente usata, Surface Plasmon Resonance o SPR. Un tipico strumento SPR combina una sorgente laser mobili, un rilevatore ottico per misurare lo spostamento dell'intensità e un chip sensore con un prisma di vetro rivestito su un lato con oro. Il prisma rivestito in oro è integrato con un sistema fluidico che consente un funzionamento a flusso continuo. In un esperimento, la molecola della sonda, o elemento di biorisognizione, è attaccata alla superficie d'oro. L'elemento bersaglio scorre quindi sulla superficie e si lega alla sonda immobilizzata. Il rilevamento utilizza il fenomeno SPR. Ciò si verifica quando la luce polarizzata viene mostrata sulla superficie del metallo, come l'oro, con un angolo specifico, theta SPR. Ciò si traduce nella generazione di plasmoni di superficie che sono oscillazioni elettroniche coerenti che esistono all'interfaccia di due materiali che hanno permittività di segni opposti. Quando la massa attaccata alla superficie del sensore cambia, la condizione di risonanza dei plasmoni di superficie viene alterata. Di conseguenza, quando solo l'elemento di bioriconoscimento è legato sulla superficie, il raggio viene riflesso ad un angolo, theta uno. Quindi, quando più massa è attaccata alla superficie, come il bersaglio catturato, una riduzione dell'intensità della luce riflessa all'angolo specifico, si osserva theta SPR, poiché l'angolo di riflessione cambia in theta due. La variazione di intensità della luce riflessa all'angolo di risonanza, theta SPR, è quindi una funzione dell'angolo della luce riflessa, e può essere misurata come la differenza di angoli, theta uno e theta due.

Ora che abbiamo coperto i principi e la procedura alla base dei biosensori ottici, vediamo come i ricercatori stanno applicando queste tecniche oggi. Il citometro a cellule a flusso è un sistema di biorisensamento ottico comunemente usato per contare le cellule e misurare una varietà di altre proprietà e componenti cellulari. Un campione composto da più tipi di cellule, ciascuno etichettato con un fluoroforo unico, viene preparato in una sospensione. Quindi, il campione viene eseguito attraverso il citometro a flusso in modo tale che le cellule scorrano oltre un raggio laser una alla volta. Mentre ogni cellula passa attraverso il raggio laser, la luce fluorescente diffusa ed emessa dai diversi fluorofori viene quantificata separatamente, il che fornisce un conteggio diretto dei vari tipi di cellule nel campione. Un'altra applicazione dei biosensori ottici è il rilevamento di batteri nei campioni. Un modo per farlo è utilizzare sensori di risonatore ad anello ottico. Sono composti da un circuito chiuso accoppiato a guide d'onda di ingresso e uscita della luce. Quando la luce di lunghezza d'onda risonante viene applicata alla guida d'onda in ingresso, viene fatta passare attraverso il loop e accumula un'intensità su più viaggi di andata e ritorno a causa di interferenze costruttive e viene emessa alla guida dell'onda di uscita. Gli anticorpi specifici delle proteine di superficie batterica vengono immobilizzati sulla superficie del risonatore ad anello e si ottiene uno spettro di assorbimento basale. Quindi il campione batterico viene fatto scorrere sulla superficie del risonatore per consentire il legame batterico al corpo immobilizzato, a seguito del quale si ottiene un secondo spettro di assorbimento. Se il batterio di interesse si lega, si osserva uno spostamento visibile nei picchi risonanti, che è direttamente proporzionale alla concentrazione dei batteri bersaglio.

Hai appena visto il video di JoVE sul biosensing ottico. Abbiamo discusso i principi di base del rilevamento ottico sia basato su etichetta che privo di etichette insieme a due esempi importanti di questi metodi e alcune applicazioni delle tecniche. Grazie per l'attenzione.