Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio dei meccanismi di crisi epilettica, ad esempio quali sottopopolazioni neurali sono responsabili dell'insorgenza e della terminazione delle convulsioni elettrografiche. Il principale vantaggio di questa tecnica, è che può riprodurre eventi di crisi elettrografica, su richiesta, e modelli in vivo e in vitro che ricordano quelli osservati clinicamente. Questa tecnica può anche essere utilizzata per cercare potenziali terapie anti-crisi, tentando di innescare eventi di crisi elettrografica durante l'applicazione di diversi candidati anti-sequestro.

Per preparare le fette corticali, incollare il tessuto cerebrale preclinico sullo stadio Vibratome, utilizzando colla adesiva istantanea. Posizionare delicatamente il supporto della specimina nel vassoio tampone. Assicurarsi che la porzione dorsale del cervello sia rivolta verso la lama del Vibratome.

Affettare il cervello in sezioni spesse 450 micrometri, nella direzione dorsale-ventrale. Fai il primo taglio nel cervello animale preclinico per rimuovere il bulbo olfattivo. Quindi, effettuare tagli successivi fino a quando non si osserva l'area motoria somatosensoriale.

Utilizzare una pipetta a foro largo. Trasferire le fette coronali mirate in una piastra di Petrie contenente soluzione di dissezione fredda. Per le fette coronali, fare un taglio trasversale appena sotto la commissure neo corticale, e quindi, tagliare alla linea mediana per separare gli emisferi.

Quindi, utilizzare una nuova lama di rasoio per tagliare qualsiasi tessuto in eccesso dalle fette. È fondamentale eseguire la procedura di affezione cerebrale in modo efficiente. Ogni momento in cui il tessuto cerebrale non è immerso in ACSF, è dannoso per la sua qualità.

Il tessuto cerebrale danneggiato e di scarsa qualità ha meno probabilità di generare eventi di crisi elettrografica. Trasferire la porzione dorsale delle fette coronali, che contengono la neo corteccia, in una seconda piastra di Petrie riempita con 35 gradi Celsius ACSF, per un momento. Quindi, trasferire prontamente le fette in una camera di incubazione, contenente 35 gradi Celsius carbogenated ACSF.

Lasciare le fette cerebrali leggermente immerse nella camera di incubazione a 35 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, rimuovere la camera di incubazione dal bagno d'acqua e consentirgli di tornare a temperatura ambiente. Attendere un'ora che le fette cerebrali si riprendano, prima di eseguire registrazioni elettrofisiopatiche.

In questa procedura, ritaglia la carta dell'obiettivo che è leggermente più grande della fetta cerebrale. Utilizzare una pipetta a foro largo o un pennello per dettagli per trasferire una fetta cerebrale sulla carta dell'obiettivo ritagliata che viene tenuta in posizione utilizzando una pinzetta dentale. Quindi, trasferire la carta dell'obiettivo con una fetta cerebrale alla camera di registrazione e fissarla in posizione con uno schermo arpa.

Successivamente, abbondante la fetta cerebrale nella camera di registrazione con ACSF carbogenato a 35 gradi Celsius ad una velocità di tre millilitri al minuto. Utilizzare un termometro digitale per assicurarsi che la camera di registrazione sia da 33 a 36 gradi Celsius. Quindi, riempire gli elettrodi di vetro con 10 microlitri di ACSF, usando una siringa Hamilton.

Sotto lo stereomicroscopio 20 volte, guidare l'elettrodo di vetro di registrazione nello strato corticale superficiale, due, tre, utilizzando manipolatori manuali. Visualizza l'attività elettrica della fetta cerebrale con il software standard. Per indurre attività elettrografiche simili a convulsioni, abbondante la fetta cerebrale con ACSF contenente 4-AP a 100 micromolari.

Visualizza l'attività elettrica della fetta cerebrale con il software standard. Per generare eventi elettrografici simili a convulsioni, utilizzando una strategia optogenetica sulle fette cerebrali dei topi optogenetici, utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 micron di diametro del cavo direttamente sopra la regione di registrazione. Applicare un breve impulso di luce blu per avviare un evento ictal.

Un programma intuitivo basato su MATLAB è stato specificamente sviluppato per rilevare e classificare i vari tipi di eventi epileptiformi che si verificano nei modelli di crisi in vitro e in vivo 4-AP. Questo programma di rilevamento è disponibile presso il repository Valiante Labs GitHub. L'applicazione di 4-AP micromolare a fette cerebrali corticali di buone dimensioni di 450 micron da un topo di channelrhodopsina VGAT giovanile, ha indotto in modo affidabile eventi ricorrenti simili a ictal entro 15 minuti.

L'applicazione di 4-AP micromolare 100 micromolare a fette di scarsa qualità, ha comportato eventi di scoppio o attività di spiking. In media, il 40% delle fette di ogni cervello preclinico sezionato, ha generato con successo eventi simili all'ictal. Inoltre, l'83% dei topi sezionati ha provocato almeno una fetta cerebrale che ha generato con successo eventi simili all'ictal.

Nelle fette cerebrali con eventi simili all'ictal che si verificano spontaneamente, l'applicazione di un breve impulso luminoso di 30 millisecondi sulla fetta cerebrale, ha innescato in modo affidabile un evento simile all'ictal che era identico nella morfologia. Gli stessi risultati sono stati fatti in fette cerebrali da Thy one Channelrhodopsin due topi. Così, indipendentemente dalla sottopopolazione neuronale attivata, ogni breve evento di sincronizzazione nella rete neurale corticale isolata, ha portato all'inizio di un evento simile all'ictal.

Questi eventi simili all'ictal erano costituiti da un picco sentinella, fuoco tonico, fuoco simile a un clonico e attività simile a una raffica verso la fine. Erano di natura simile alle firme elettrografiche associate alle convulsioni cliniche. Seguendo questa procedura, altri tipi di transizioni dello stato cerebrale possono essere eseguite per affrontare domande come, quali sono i meccanismi neuro biologici alla base delle transizioni dello stato cerebrale?

E come possiamo regolare queste transizioni per impedire l'ingresso in vari stati patologici del cervello?