Iniziazione di generazione e On-Demand di attività Ictal acuta nel tessuto umano e del roditore
19 gennaio 2019
Modelli di sequestro acuta sono importanti per studiare i meccanismi alla base di eventi epileptiform. Inoltre, la capacità di generare eventi epileptiform su richiesta fornisce un metodo altamente efficiente per studiare l'esatta sequenza degli eventi alla base la loro iniziazione. Qui, descriviamo i modelli di sequestro corticale acuta 4-aminopiridina stabiliti nel tessuto umano e del mouse.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio dei meccanismi di crisi epilettica, ad esempio quali sottopopolazioni neurali sono responsabili dell'insorgenza e della terminazione delle convulsioni elettrografiche. Il principale vantaggio di questa tecnica, è che può riprodurre eventi di crisi elettrografica, su richiesta, e modelli in vivo e in vitro che ricordano quelli osservati clinicamente. Questa tecnica può anche essere utilizzata per cercare potenziali terapie anti-crisi, tentando di innescare eventi di crisi elettrografica durante l'applicazione di diversi candidati anti-sequestro.
Per preparare le fette corticali, incollare il tessuto cerebrale preclinico sullo stadio Vibratome, utilizzando colla adesiva istantanea. Posizionare delicatamente il supporto della specimina nel vassoio tampone. Assicurarsi che la porzione dorsale del cervello sia rivolta verso la lama del Vibratome.
Affettare il cervello in sezioni spesse 450 micrometri, nella direzione dorsale-ventrale. Fai il primo taglio nel cervello animale preclinico per rimuovere il bulbo olfattivo. Quindi, effettuare tagli successivi fino a quando non si osserva l'area motoria somatosensoriale.
Utilizzare una pipetta a foro largo. Trasferire le fette coronali mirate in una piastra di Petrie contenente soluzione di dissezione fredda. Per le fette coronali, fare un taglio trasversale appena sotto la commissure neo corticale, e quindi, tagliare alla linea mediana per separare gli emisferi.
Quindi, utilizzare una nuova lama di rasoio per tagliare qualsiasi tessuto in eccesso dalle fette. È fondamentale eseguire la procedura di affezione cerebrale in modo efficiente. Ogni momento in cui il tessuto cerebrale non è immerso in ACSF, è dannoso per la sua qualità.
Il tessuto cerebrale danneggiato e di scarsa qualità ha meno probabilità di generare eventi di crisi elettrografica. Trasferire la porzione dorsale delle fette coronali, che contengono la neo corteccia, in una seconda piastra di Petrie riempita con 35 gradi Celsius ACSF, per un momento. Quindi, trasferire prontamente le fette in una camera di incubazione, contenente 35 gradi Celsius carbogenated ACSF.
Lasciare le fette cerebrali leggermente immerse nella camera di incubazione a 35 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, rimuovere la camera di incubazione dal bagno d'acqua e consentirgli di tornare a temperatura ambiente. Attendere un'ora che le fette cerebrali si riprendano, prima di eseguire registrazioni elettrofisiopatiche.
In questa procedura, ritaglia la carta dell'obiettivo che è leggermente più grande della fetta cerebrale. Utilizzare una pipetta a foro largo o un pennello per dettagli per trasferire una fetta cerebrale sulla carta dell'obiettivo ritagliata che viene tenuta in posizione utilizzando una pinzetta dentale. Quindi, trasferire la carta dell'obiettivo con una fetta cerebrale alla camera di registrazione e fissarla in posizione con uno schermo arpa.
Successivamente, abbondante la fetta cerebrale nella camera di registrazione con ACSF carbogenato a 35 gradi Celsius ad una velocità di tre millilitri al minuto. Utilizzare un termometro digitale per assicurarsi che la camera di registrazione sia da 33 a 36 gradi Celsius. Quindi, riempire gli elettrodi di vetro con 10 microlitri di ACSF, usando una siringa Hamilton.
Sotto lo stereomicroscopio 20 volte, guidare l'elettrodo di vetro di registrazione nello strato corticale superficiale, due, tre, utilizzando manipolatori manuali. Visualizza l'attività elettrica della fetta cerebrale con il software standard. Per indurre attività elettrografiche simili a convulsioni, abbondante la fetta cerebrale con ACSF contenente 4-AP a 100 micromolari.
Visualizza l'attività elettrica della fetta cerebrale con il software standard. Per generare eventi elettrografici simili a convulsioni, utilizzando una strategia optogenetica sulle fette cerebrali dei topi optogenetici, utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 micron di diametro del cavo direttamente sopra la regione di registrazione. Applicare un breve impulso di luce blu per avviare un evento ictal.
Un programma intuitivo basato su MATLAB è stato specificamente sviluppato per rilevare e classificare i vari tipi di eventi epileptiformi che si verificano nei modelli di crisi in vitro e in vivo 4-AP. Questo programma di rilevamento è disponibile presso il repository Valiante Labs GitHub. L'applicazione di 4-AP micromolare a fette cerebrali corticali di buone dimensioni di 450 micron da un topo di channelrhodopsina VGAT giovanile, ha indotto in modo affidabile eventi ricorrenti simili a ictal entro 15 minuti.
L'applicazione di 4-AP micromolare 100 micromolare a fette di scarsa qualità, ha comportato eventi di scoppio o attività di spiking. In media, il 40% delle fette di ogni cervello preclinico sezionato, ha generato con successo eventi simili all'ictal. Inoltre, l'83% dei topi sezionati ha provocato almeno una fetta cerebrale che ha generato con successo eventi simili all'ictal.
Nelle fette cerebrali con eventi simili all'ictal che si verificano spontaneamente, l'applicazione di un breve impulso luminoso di 30 millisecondi sulla fetta cerebrale, ha innescato in modo affidabile un evento simile all'ictal che era identico nella morfologia. Gli stessi risultati sono stati fatti in fette cerebrali da Thy one Channelrhodopsin due topi. Così, indipendentemente dalla sottopopolazione neuronale attivata, ogni breve evento di sincronizzazione nella rete neurale corticale isolata, ha portato all'inizio di un evento simile all'ictal.
Questi eventi simili all'ictal erano costituiti da un picco sentinella, fuoco tonico, fuoco simile a un clonico e attività simile a una raffica verso la fine. Erano di natura simile alle firme elettrografiche associate alle convulsioni cliniche. Seguendo questa procedura, altri tipi di transizioni dello stato cerebrale possono essere eseguite per affrontare domande come, quali sono i meccanismi neuro biologici alla base delle transizioni dello stato cerebrale?
E come possiamo regolare queste transizioni per impedire l'ingresso in vari stati patologici del cervello?
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'uso di modelli di crisi acute, utilizzando specificamente la 4-aminopiridina, per indagare i meccanismi delle attività epilettiformi nei tessuti corticali sia murini che umani. La possibilità di indurre su richiesta eventi elettrografici di crisi permette un esame dettagliato del comportamento neuronale associato all'insorgenza e alla cessazione delle crisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Ricerca sull'epilessia
Sfondo
- Comprendere i meccanismi alla base delle crisi epilettiche è fondamentale per sviluppare trattamenti efficaci.
- I modelli di crisi acute permettono l'osservazione in tempo reale della dinamica delle crisi.
- Le registrazioni elettrofisiologiche forniscono informazioni sull'insorgenza e la propagazione delle crisi.
- La tecnica ha potenziali applicazioni nella sperimentazione di farmaci anticonvulsivanti.
Scopo dello studio
- Studiare le sottopopolazioni neurali responsabili dell'insorgenza e della cessazione delle crisi epilettiche.
- Valutare l'efficacia di potenziali terapie anticonvulsivanti in modo controllato.
- Indagare la caratterizzazione di eventi simili alle crisi in fette cerebrali corticali.
Metodi Utilizzati
- Lo studio ha utilizzato fette cerebrali corticali acute preparate da tessuti di topo e umani.
- Sono state effettuate registrazioni elettrofisiologiche per misurare attività simili a crisi indotte da 4-aminopiridina.
- Sono stati impiegati protocolli dettagliati di sezionamento e incubazione per garantire la vitalità del tessuto.
- Sono state integrate strategie optogenetiche per indurre eventi ictali mediante stimolazione luminosa precisa.
- È stato sviluppato un software basato su MATLAB per rilevare e classificare gli eventi epilettiformi.
Risultati principali
- Il protocollo ha indotto in modo affidabile eventi di tipo ictale in sezioni cerebrali di alta qualità entro 15 minuti dall'applicazione di 4-AP.
- È stato osservato che il 40% delle sezioni ha generato con successo tali eventi, indicando un'efficace preparazione del tessuto.
- Le risposte includevano uno spike sentinella caratteristico e varie fasi di attivazione indicative di attività epilettica.
- Risultati simili sono stati osservati in diversi modelli murini, evidenziando la robustezza della tecnica.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un metodo affidabile per indurre e studiare le crisi elettroencefalografiche, fornendo informazioni sui meccanismi neuronali coinvolti nell'epilessia.
- I risultati supportano l'esplorazione della dinamica delle crisi in vivo e in vitro.
- Comprendere questi meccanismi potrebbe portare a strategie terapeutiche migliori per l'epilessia e altre patologie correlate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
L'induzione su richiesta di eventi di crisi elettroencefalografici in modelli corticali acuti permette un'analisi precisa dei meccanismi neuronali alla base dell'insorgenza e della cessazione delle crisi. Questa capacità supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci antiepilettici, consentendo una valutazione riproducibile e quantitativa degli effetti dei composti anticonvulsivanti su fenotipi elettrofisiologici definiti. La rilevanza traslazionale è potenziata dalla possibilità di applicare il modello sia a tessuti di roditore che umani, facilitando la validazione interspecie delle ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di specifiche sottopopolazioni neurali responsabili dell'insorgenza e della cessazione delle crisi elettrografiche mediante attivazione optogenetica o farmacologica.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma riproducibile per valutare se la modulazione di specifiche vie neuronali previene o modifica eventi di tipo ictale, supportando il test di ipotesi mirate.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera eventi elettrografici simili a crisi epilettiche quantificabili con morfologia definita (picco sentinella, scarica tonico-clonica, attività a raffica), adatti per schermature ad alto contenuto informativo.
- Valore operativo: Permette l'induzione standardizzata di eventi ictali mediante 4-AP, impulsi optogenetici o puff di neurotrasmettitori, consentendo test coerenti di composti in diversi laboratori.
- Valore scientifico: Facilita la valutazione di potenziali farmaci anticonvulsivanti misurandone l'impatto sulla frequenza, durata o caratteristiche elettrografiche delle crisi durante un'induzione su richiesta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Utilizza tessuto corticale umano per generare eventi clinicamente rilevanti simili a quelli ictali, migliorando la previsione dell'efficacia terapeutica.
- Valore operativo: Permette una transizione continua dai test acuti ai modelli cronici di epilessia, confermando che gli eventi indotti riproducono le firme elettrografiche cliniche.
- Valore scientifico: Consente una riduzione del rischio meccanicistica collegando specifiche manipolazioni neuronali a modifiche della dinamica delle crisi, fornendo indicazioni per la selezione di bersagli nell’ambito dello sviluppo preclinico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della scoperta precoce fornendo un saggio fisiologicamente rilevante per la validazione dell'obiettivo e lo screening di composti prima dell'ottimizzazione del capostipite.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi neuronali alla base dell'insorgenza delle crisi attraverso l'induzione precisa e su richiesta di eventi ictali in reti corticali.
- Screening: Fornisce letture elettrofisiologiche quantitative e riproducibili (frequenza, morfologia e durata degli eventi), essenziali per la standardizzazione dei saggi e il confronto tra composti.
- Analisi: Permette il rilevamento e la classificazione di eventi epilettiformi mediante software basato su MATLAB, fornendo metriche oggettive per valutare gli effetti dei composti sulla dinamica delle crisi.
- Ricerca traslazionale: Utilizza tessuto umano per garantire la rilevanza per la malattia, collegando i risultati della scoperta alla ricerca preclinica e clinica sull'epilessia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata e scalabile per valutare diversi meccanismi anticonvulsivanti in progetti multipli e diverse modalità terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità nei meccanismi neuronali di generazione e propagazione delle crisi epilettiche.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità dell'induzione delle crisi in preparati di tessuto di roditore e umano, sostenendo campagne di screening multicentriche.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di proseguimento o interruzione sviluppando valutazioni rapide e quantitative degli effetti dei composti anti-crisi su endpoint elettrofisiologici definiti.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei composti corretta rispetto al rischio, in base alla loro capacità di sopprimere o modificare eventi simili alle crisi in modelli clinicamente rilevanti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia, sezionamento dei tessuti e tecniche di induzione di crisi mediante optogenetica o farmacologia.
- Dipende da strumentazione per la registrazione elettrofisiologica, perfusione precisa di soluzioni (ad esempio 4-AP, ACSF) e stimolazione ottica (per l'attivazione optogenetica).
- Necessita di protocolli standardizzati di preparazione del tessuto per garantire la vitalità delle sezioni e una generazione consistente di eventi ictali, poiché la qualità del tessuto influisce direttamente sulle percentuali di successo.
- Richiede l'adattamento dei parametri di induzione (ad esempio concentrazione di 4-AP, durata dell'impulso luminoso, volume della puffetta di neurotrasmettitore) nel passaggio da modelli di tessuto di roditore a quelli umani.
- I limiti pratici includono la variabilità nella qualità delle sezioni e la necessità di un'abilità elevata nel manipolare il tessuto per mantenerne la salute durante la preparazione e le registrazioni.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Preparation of Cortical Slices from the Somatosensory-motor Cortex
2:40
Electrophysiological Recordings of the Superficial Cortical Layer and Seizure Induction
4:43
Results: Acute In Vitro 4-AP Cortical Seizure Model and Ictal Events Generated by Optogenetics
6:19
Conclusion
