Name: Microscopia spettrale riflettometrica su assoni Myelinated In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Scopri la riflettometria spettrale per l'imaging senza marcatori di assoni mielinizzati in tessuto nervoso intatto. Questo metodo fornisce informazioni nanostrutturali quantitative con dosi di luce inferiori rispetto alla microscopia confocale convenzionale.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto di scienze fondamentali (IBS-R015-D1) e dal programma di base scienza ricerca attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'istruzione (2017R1A6A1A03015642).

Tutte le procedure chirurgiche sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Sungkyunkwan University.
1. preparazione del campione
Nota: Autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima di movimentazione degli animali. Condurre tutte le prestazioni chirurgiche in una sala dedicata alle procedure chirurgiche. Guanti e camici chirurgici sterili devono essere indossati per tutto il personale nella sala chirurgica in ogni momento.
<ol><li>
Fissazione del tessuto
	<ol>
<li>Preparare due siringhe da 10 mL che ciascuno riempito con tampone fosfato salino (PBS) e paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS.</li>
		<li>Anestetizzare un mouse week-old 7-12, (C57BL/6J o qualsiasi mouse linee con entrambi i sessi) con la somministrazione di una miscela di zoletil e xilazina (1:1, 20 mg/kg ogni) o un regime di anestesia adatto alternativo (ad es., miscela di 80 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xilazina) con un'iniezione intraperitoneale.</li>
		<li>Una volta che il mouse ha raggiunto un aereo chirurgico di anestesia (uso il metodo di pizzico-risposta di punta), è possibile esporre il cuore, tagliando la pelle e la gabbia toracica con le forbici.</li>
		<li>Praticare l'atrio destro con piccole forbici per drenare il sangue e irrorare la soluzione PBS e PFA in sequenza attraverso il ventricolo sinistro con un ago (tasso di perfusione = 4 mL/min, volume = 10 mL per ogni soluzione). Nota: Il mouse si irrigidisce se la procedura è completata. L'uso dell'unguento oculare o la sterilizzazione non è necessaria in quanto la procedura è terminale. La procedura di fissazione può essere ignorata. Tuttavia, questo passaggio è consigliato per minimizzare le deformazioni strutturali, compresi i danni di meccanica del tessuto e gonfiore axonal ischemico. Per ulteriori dettagli sulla fissazione del tessuto, fare riferimento all'articolo di Gage, G. J. et al. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della fetta del cervello
	<ol>
<li>Decapita il mouse con forbici chirurgiche attraverso il ventrale torace e l'addome.</li>
		<li>Rimuovere il cuoio capelluto e il periostio utilizzando un opportunamente piccole forbici fino ad esporre completamente il cranio.</li>
		<li>Rompere l'osso frontale e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale dall'osso occipitale utilizzando piccole forbici con cura di non per danneggiare il cervello.</li>
		<li>Rimuovere delicatamente il cranio e il mater di dura in modo sequenziale utilizzando una pinzetta.</li>
		<li>Estrarre il cervello utilizzando un cucchiaio di plastica morbido, facendo attenzione a non per danneggiare il tessuto.</li>
		<li>Sciacquare e mettere a bagno il cervello Estratto in una soluzione PFA 4% per 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Affettare il cervello fisso in 100 – 150 µm sezioni utilizzando un vibratomo. Nota: Per ulteriori dettagli sulla preparazione del tessuto, vedere l'articolo di Segev et al. 11. per le procedure successive, il tessuto deve essere affettato in sezioni più sottile rispetto allo spessore del distanziale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaggio della fetta del cervello
	<ol>
<li>Preparare 1 vetrino e 2 quadrati vetrini coprioggetto (22 × 22 × 0,17 mm) per ogni sezione del tessuto.</li>
		<li>Uno dei bicchieri coperchio quadrati tagliato a metà (due pezzi rettangolari) utilizzando un tagliavetro.</li>
		<li>Collegare i due degli occhiali copertina dimezzati utilizzando una colla super sul vetro dello scivolo. Nota: Lo spazio tra i due cristalli dimezzati dovrebbe essere leggermente più grande rispetto alla dimensione della fetta del tessuto.</li>
		<li>Raccogliere la fetta di cervello con una spazzola o una pipetta e posare il tessuto sul vetro scorrevole tra il distanziale. Fare attenzione a non per piegare il tessuto.</li>
		<li>Pipettare 100 μL di PBS sulla superficie del tessuto.</li>
		<li>Posizionare il vetro di copertura altri quadrato sopra il tessuto. Evitare l'inclusione di bolle d'aria durante questa fase.</li>
		<li>Guarnizione intorno al vetro di copertura usando uno smalto per unghie (o in alternativa apposito collante) per evitare l'evaporazione di PBS e la contaminazione da polvere durante la successiva sessione di imaging. Nota: Lo sperimentatore può mettere in pausa in questa fase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. taratura
<ol><li>Accendere il microscopio almeno 1 h prima l'imaging per consentire la stabilizzazione termica del laser source (Vedi Tabella materiali). Quindi, attivare il software per l'analisi spettrale (Vedi Tabella materiali) e fare clic sul pulsante Acquisisci sulla cima di GUI (Figura 3a).
</li>
	<li>Attivare l'otturatore di software per il bianco-luce laser (WLL) e tubo di fotomoltiplicatore (PMT) (Figura 3a).</li>
	<li>Selezionare la modalità di xyΛ nell'elenco a discesa in Modalità di acquisizione, quindi, la modalità di input del laser viene automaticamente modificata da costante per cento a Potenza costante. Deselezionare la casella di controllo di Movimento automatico SP. E quindi impostare la finestra spettrale del laser ingresso 470 – 670 nm e le dimensioni di passaggio spettrale a 4 nm su Λ-eccitazione Lambda Scan Impostazioni (Figura 3b).</li>
	<li>IMPOSTARE l'intervallo spettrale di PMT a 450-690 facendo doppio clic o spostando la barra di regolazione per la gamma spettrale (Figura 3C). Nota: Questo intervallo spettrale dovrebbe includere la larghezza di banda completa sorgente di ingresso.</li>
	<li>Selezionare un obiettivo di immersione in acqua, opportunamente con un'apertura numerica elevata (NA > 0.7) e dare qualsiasi valore alla potenza PMT e laser per attivare il pulsante di configurazione AOBS e Live Scan . Passare il percorso ottico controllando riflesso nella Configurazione AOBS (figura 3d).</li>
	<li>Montare uno specchio di riferimento (Vedi Tabella materiali) sulla fase di microscopio. La superficie a specchio dovrebbe essere affrontata contro la lente dell'obiettivo. Se non è facile mettere lo specchio sopra il tavolino del microscopio, legame uno specchio sul piatto piatto (es. vetro diapositiva).</li>
	<li>Controllo il tavolino del microscopio per allineare il piano focale per la superficie a specchio.</li>
	<li>Regolare il guadagno PMT e la potenza del laser considerando la gamma dinamica del sensore e quindi modificare la modalità di input di laser da costante per cento a Potenza costante. Nota: Come è tipico, un PMT guadagno di 500 (V) e una potenza del laser relativa dello 0,1% sono utilizzati a 570 nm.</li>
	<li>Confermare in modo pseudo-colore per verificare che non esiste nessuna saturazione su tutta la gamma di lunghezza d'onda. Se si osserva la saturazione, abbassare la potenza del laser (Figura 3a).</li>
	<li>Eseguire l'acquisizione Lambda Scan .</li>
	<li>Rimuovere lo specchio dal palco e ripetere l'acquisizione stessa senza un campione al fine di ottenere il riferimento scuro (cioè, offset scuro).</li>
	<li>Salvare i dati in un formato TIF Multistacked .</li>
</ol>3. SpeRe Image Acquisition
<ol><li>Posizionare il tessuto montato sul tavolino del microscopio. Per allineare approssimativamente il tessuto per il piano focale della lente dell'obiettivo, è necessario utilizzare la modalità di fluorescenza grandangolari attraverso un oculare.</li>
	<li>Con il Live Scan , controllo il tavolino del microscopio per allineare il piano focale nella regione di interesse per il tessuto. Per evitare il rumore di fondo dal vetrino coprioggetto, seleziona la regione di destinazione di almeno 15 μm profondità dall'interfaccia vetro-tessuto.</li>
	<li>Acquisire lo stack di immagine spettrale per la regione di destinazione utilizzando la stessa procedura come descritto ai punti 2.1 – 2,10.</li>
	<li>Salvare i dati per il tessuto e l'offset scuro in formato TIF Multistacked . Nota: Lo sperimentatore può mettere in pausa in questa fase.</li>
</ol>4. elaborazione ed analisi di immagini
<ol><li>Aprire i dati spettrali (multistacked TIF) per lo specchio di riferimento e il tessuto cerebrale in ImageJ.</li>
	<li>Selezionare il ROIs (regioni di interesse) per gli stack di immagine aperto — zona centrale per lo specchio di riferimento e il segmento di una fibra di assone per il tessuto cerebrale.</li>
	<li>Acquisire gli spettri raw per il ROIs selezionati da in esecuzione immagine → pile → trama asse z profilo dal menu ImageJ.</li>
	<li>Aprire i dati offset scuri, una presa per lo specchio di riferimento e le altre scattate per il tessuto cerebrale.</li>
	<li>Acquisire gli spettri per gli offset scuri di esecuzione immagine → pile → trama asse z profilo dal menu ImageJ.</li>
	<li>Salvare tutti gli spettri acquisiti utilizzando le opzioni di copia e incolla . Nota: Per l'imaging di SpeRe, uso del campo di formazione immagine centrale per ridurre al minimo le aberrazioni ottiche fuori asse è consigliabile. Le fibre dell'assone possono essere strutturalmente eterogenee lungo la loro lunghezza. Quindi, selezionando il ROI su un segmento piccolo assone, tipicamente < 5 µm, per ridurre al minimo il volume parziale artefatto raccomanda.</li>
</ol>5. baseline correzione e analisi del segnale di SpeRe
<ol><li>Sottrarre gli spettri offset da spettri dello specchio di riferimento e i tessuti del cervello.</li>
	<li>Normalizzare ogni spettro dividendo l'intensità massima dello spettro.</li>
	<li>Dividono lo spettro normalizzato dell'assone dallo spettro normalizzato dello specchio di riferimento e sottrarre offset DC lo spettro normalizzato.</li>
	<li>Misurare la frequenza di wavenumber inserendo lo spettro acquisito a un sinusoidale curva (Vedi Tabella materiali) e poi convertire il numero d'onda acquisito alla periodicità per prendendo reciproco.</li>
	<li>Convertire la periodicità wavenumber al diametro dell'assone usando l'equazione in Figura 4c.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li>
<li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li>
<li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832(2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27341060">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024(2016).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li>
<li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano concorrenti interessi finanziari: Kwon J. e M. Choi sono gli inventori della tecnologia in attesa di brevetto descritto in questo articolo.

Bullonerie è una nuova modalità imaging privo di etichetta basata su interferometria spettrale, che per la prima volta, offre le informazioni su scala nanometrica in assoni myelinated dal vivo. L'attuale protocollo di acquisizione, la risoluzione spaziale per il diametro dell'assone è dell'ordine di 10 nm. Inoltre, SpeRe utilizza gli ordini di grandezza più bassa dose di luce rispetto ad altri microscopie di Super-risoluzione; così, è esente da fototossicità e photobleaching. Bullonerie fornirebbe una nuova strada per st...

Nel sistema nervoso dei mammiferi, mielina fornisce integrità assonale e conduzione nervosa rapida avviluppando le fibre dell'assone con guaine membranose multistrate. La sua struttura multistrato è composto da alternando film sottili su scala nanometrica composto da membrane plasmatiche (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm) e spazi extracellulari (7 ~ nm)1,2. Microscopia ottica, compreso il recente microscopia di Super-risoluzione, non sono adatti per l'osservazione delle dinamiche di mielina su scala nanometrica a causa della loro risoluzione insufficiente a causa della diffrazione ottica3,4,5. Sebbene la microscopia elettronica può fornire dettagli della nanostruttura mielina, non è compatibile con i sistemi biologici viventi a causa della preparazione del campione altamente invasive che coinvolgono la fissazione chimica e ultrasectioning6,7 . Fino a poco tempo, c' non è stata nessuna tecnica applicabile per osservare la dinamica su scala nanometrica di assoni myelinated in situ.
Schain et al ha segnalato in precedenza che gli assoni myelinated esibiscono la riflessione della luce colorata8. Adottando l'analisi spettroscopica sulla luce riflessa, abbiamo messo a punto una nuova modalità di imaging per l'imaging su scala nanometrica di assoni myelinated, denominata riflettometria spettrale (isotropi)9. Bullonerie si basa sull'interferenza di film sottile che si verificano nella struttura multistrata della guaina mielinica (Figura 1). Di simulazione ottica su vari assoni, abbiamo rivelato che lo spettro di riflettanza è una funzione periodica del numero d'onda e la sua periodicità (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) è inversamente proporzionale al diametro dell'assone (d). Questa semplice relazione (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) offre facile quantificazione del diametro dell'assone dai dati isotropi. Utilizzando questo, abbiamo rivelato l'assone prevalente sporgenti sotto la ferita traumatica delicata del cervello nella nostra precedente relazione.
Il sistema di SpeRe si basa su microscopia confocal e consiste di una sorgente laser specializzate e filtri (Figura 2). La sorgente di ingresso è un laser a luce bianca, fornendo a banda larga output spettrale visibile alle regioni a infrarossi. Per l'analisi spettrale, il sistema è dotato di due dispositivi acusto-ottico: un filtro sintonizzabile acusto-ottico (AOTF) per la distribuzione una lunghezza d'onda selezionata la sorgente di ingresso a banda larga e un divisore di fascio acusto-ottico (AOBS) per guidare il selezionato riflette lunghezza d'onda al rivelatore. Il software per microscopia confocale iperspettrale (Vedi Tabella materiali) offre un'opzione di analisi spettrale personalizzabile di acquisire in sequenza le immagini di riflettanza a varie lunghezze d'onda di input. Inoltre, l'aberrazione cromatica criticamente possono interferire nella misurazione spettrale; Pertanto, l'uso di un obiettivo apocromatico è raccomandato.
Della nota, bianco-luce laser produce un output spettrale irregolare e i componenti ottici influiscono anche sul profilo spettrale. Di conseguenza, gli spettri acquisiti devono essere calibrate per la successiva analisi quantitativa. Uno specchio d'argento protetto viene in genere utilizzato come riferimento, che fornisce un grado di riflessione quasi costante (&gt; 97%) sopra la regione piena e visibile. Gli spettri acquisiti sono poi diviso per gli spettri di riferimento dallo specchio.
Le dimensioni di passaggio spettrale per l'analisi spettrale determinano la velocità di acquisizione; così, ha bisogno di essere ottimizzato. Come un assone più grande ha un maggiore periodo spettrale, richiede più fine spettrale campionamento. Ad esempio, un assone con un diametro di 10 µm, uno dei più grandi assoni fisiologici, ha un periodo spettrale di ~ 8 nm. Applicando criteri di campionamento di Nyquist, abbiamo impiegato l'intervallo di campionamento spettrale di 4 nm a coprire tutti gli assoni fisiologici nei tessuti nervosi del mouse. Questo approccio assume in genere alcuni secondi per una scansione completa spettrale e pertanto non è adatto per applicazioni in vivo , dove il movimento fisiologico (ad es. respirazione e battito cardiaco) interferisce stabile acquisizione spettrale. In precedenza abbiamo risolto questo problema tramite la strumentazione di un microscopio dritto su misura, progettato per acquisire l'intero spettro per ogni punto utilizzando uno spettrometro di matrice (acquisizione velocità ≈ 30 ms per ogni pixel).
In questo rapporto, descriviamo un protocollo dettagliato sull'imaging di SpeRe su una fetta di cervello fisso, che può essere eseguita in un microscopio commerciale iperspettrale (Vedi Tabella materiali). Così, il protocollo può essere completato da sperimentatori senza esperienza nella strumentazione ottica. Copriamo anche i potenziali problemi e risoluzione dei problemi per acquisizione e analisi dei dati di Bullonerie.

<table><tbody><tr><td>Tagliavetro</td><td>:</td><td></td> <td>può essere acquistato in un minimarket locale o nei negozi online.</td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>:</td><td></td> <td>può essere acquistato in un minimarket locale o nei negozi online.</td></tr><tr><td>Obiettivo apocromatico 40&times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Tipo ad immersione in acqua</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>In alternativa, è possibile utilizzare Fluoromyelin Red (F34652).</td></tr><tr><td>Microscopio Leica SP8 TCS</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla sezione "Configurazione del microscopio" nella sezione introduttiva.</td></tr><tr><td>Software di imaging</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X-Matlab</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Specchio</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Rivestito con argento protetto.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136-Paraformaldeide</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Spessore: #1 (da 0,13 a 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Vetrino scorrevole</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Spessore: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Utilizzare un'apparecchiatura di erogazione per evitare il contatto con la pelle o gli occhi.</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL-Vibratome</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Leica Biosystems</td><td></td> <td>VT1200S-Laser</td></tr> <tr><td>a luce bianca</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 è stato interrotto e sostituito da EXU-6.</td></tr></tbody></table>

microscopia spettrale riflettometrica su assoni myelinated in situ

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In un sistema nervoso dei mammiferi, mielina fornisce un isolamento elettrico da avviluppando le fibre dell'assone in una spirale multistrata. Ispirato dalla sua architettura subcellulare altamente organizzato, abbiamo recentemente sviluppato una nuova modalità di imaging, denominata riflettometria spettrale (isotropi), che permette l'imaging senza precedenti su scala nanometrica privo di etichetta degli assoni myelinated live in situ. Il principio di fondo è quello di ottenere informazioni nanostrutturale analizzando lo spettro di riflettanza della struttura subcellulare multistrato. In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato passo-passo per l'esecuzione di un imaging di SpeRe base dei tessuti nervosi utilizzando un sistema al microscopio confocale commerciale, dotato di un laser a luce bianca e un filtro sintonizzabile. Copriamo le procedure di preparazione del campione, acquisizione di dati spettrali e di elaborazione delle immagini per ottenere informazioni nanostrutturale.

Secondo il protocollo, una fetta di cervello fisso è stata preparata con un fluoroforo mielina-targeting la colorazione esogena (Vedi Tabella materiali). Bullonerie imaging è stata eseguita sulla fetta di cervello utilizzando un microscopio confocale commerciale iperspettrali in combinazione con fluorescenza confocale imaging (Figura 4a). Bullonerie, ingresso ottico intensità è stato impostato per 5 µW/µm2 con un tempo di sosta di ...

Qui, presentiamo un protocollo passo-passo per l'imaging di assoni myelinated in una fetta di cervello fisso utilizzando una scala nanometrica privo di etichetta tecnica basato su riflettometria spettrale di imaging.

Microscopia spettrale riflettometrica su assoni Myelinated In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Questa tecnica può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della mielina, come la plasticità della mielina e la demielinizzazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio della nanostruttura dell'assone mielinizzato nel tessuto cerebrale intatto senza alcuna marcatura complessa o preparazione del campione. Qui, dimostreremo l'applicazione in una fetta di cervello, ma questa tecnica può essere estesa agli animali vivi.Dopo aver fissato e affettato il tessuto cerebrale del topo secondo il protocollo di testo, preparare un vetrino e due vetrini di copertura per ogni fetta di tessuto. Usa un tagliavetro per tagliare a metà uno dei bicchieri quadrati di copertura. Quindi, crea un distanziatore usando la supercolla per attaccare i due pezzi sul vetrino.Usando un pennello o una pipetta, prelevare una fetta di cervello e adagiare il tessuto su un vetrino tra il distanziatore, facendo attenzione a non piegare il tessuto. Erogare 100 microlitri di PBS sulla superficie del tessuto. Quindi, posizionare il secondo vetro di copertura quadrato sulla parte superiore del fazzoletto evitando l'introduzione di bolle d'aria.Utilizzare lo smalto per unghie per sigillare intorno al vetro di copertura per evitare l'evaporazione del PBS e la contaminazione da polvere durante la successiva sessione di imaging. Almeno un'ora prima dell'imaging, accendere il microscopio per consentire la stabilizzazione termica della sorgente laser. Quindi accendi il software per la scansione spettrale e fai clic sul pulsante di acquisizione nella parte superiore della GUI.Attivare l'otturatore del software per il laser a luce bianca e il tubo fotomoltiplicatore. In modalità di acquisizione, selezionare la modalità lambda XY nell'elenco a discesa. La modalità di ingresso del laser viene quindi modificata automaticamente da percentuale costante a potenza costante.In eccitazione lambda, impostazioni di scansione lambda, deselezionare la casella di movimento SP automatico e impostare la finestra spettrale per il laser di input da 470 a 670 nanometri e la dimensione del passo spettrale a quattro nanometri. Impostare l'intervallo spettrale di PMT da 450 a 690 nanometri facendo doppio clic o spostando la barra di regolazione per l'intervallo spettrale. Scegliere un obiettivo a immersione in acqua adatto con un'apertura numerica elevata.Dai qualsiasi valore al PMT e alla potenza del laser per attivare la configurazione AOBS e il pulsante di scansione in tempo reale. Nella configurazione AOBS, passare al percorso ottico controllando la riflessione. Quindi, montare uno specchio di riferimento sul tavolino del microscopio con la superficie rivolta verso la lente dell'obiettivo.Se non è facile posizionare lo specchio sul tavolino del microscopio, far aderire uno specchio sulla piastra piana. Regolare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla superficie dello specchio. Quindi, regolare il guadagno PMT e la potenza del laser, considerando la gamma dinamica del rivelatore.Sotto uno pseudocolore, controlla che non ci sia saturazione in tutta la gamma di lunghezze d'onda. Se si osserva una saturazione, ridurre la potenza del laser. Quindi eseguire l'acquisizione della scansione lambda.Rimuovere lo specchio dal tavolino e ripetere la stessa acquisizione senza campione per ottenere il riferimento scuro. Quindi salvare i dati in un formato TIF multi-stack. Per eseguire l'acquisizione dell'immagine SpeRe, posizionare il tessuto montato sul tavolino del microscopio.Per allineare approssimativamente il tessuto al piano focale della lente dell'obiettivo, attraverso un oculare utilizzare la modalità di fluorescenza ad ampio campo. Con la scansione dal vivo attivata, controllare il tavolino del microscopio per allineare il piano focale alla regione di interesse nel tessuto. Per evitare il rumore di fondo del vetrino coprioggetti, selezionare una regione target di almeno 15 micrometri di profondità dall'interfaccia del tessuto di vetro.Acquisire lo stack di immagini spettrali per la regione di destinazione utilizzando la stessa procedura illustrata in precedenza in questo video. Quindi salva i dati per il tessuto e l'offset scuro in formato TIF multi-stacked. Per elaborare le immagini in ImageJ, aprire i dati spettrali per lo specchio di riferimento e il tessuto cerebrale.Selezionare le ROI per le pile di immagini aperte, l'area centrale per lo specchio di riferimento e il segmento di una fibra assonale per il tessuto cerebrale. Quindi esegui l'immagine, impila, traccia il profilo dell'asse Z per acquisire gli spettri grezzi per le ROI selezionate. Le fibre degli assoni possono essere strutturalmente eterogenee lungo le loro lunghezze, quindi, si raccomanda di selezionare il ROI su un piccolo segmento di assone tipicamente inferiore a cinque micrometri per ridurre al minimo gli artefatti di volume parziale.Apri i dati di offset scuro, uno preso per lo specchio di riferimento e l'altro preso per il tessuto cerebrale, e traccia il profilo dell'asse Z come appena dimostrato. Quindi utilizzare le opzioni di copia e incolla per salvare tutte le opzioni acquisite. Per eseguire la correzione della linea di base e l'analisi del segnale SpeRe, sottrarre gli spettri di offset dagli spettri dello specchio di riferimento e dei tessuti cerebrali.Normalizza ogni spettro dividendo l'intensità massima dello spettro. Inserire il numero d'onda prendendo il reciproco della lunghezza d'onda utilizzata nell'esperimento, normalizzare lo spettro dell'assone dividendo quello dello specchio di riferimento e sottrarre l'offset CC dallo spettro normalizzato. E poi ottenere la frequenza del numero d'onda adattando lo spettro acquisito a una sinusoide.Converti la frequenza del numero d'onda acquisita in periodicità prendendo il reciproco e converti la periodicità del numero d'onda nel diametro dell'assone utilizzando l'equazione mostrata qui. In questo esperimento, fette fisse di cervello sono state colorate in fluorescenza contro la mielina e l'imaging SpeRe è stato effettuato con una dose di luce di un ordine di grandezza inferiore rispetto alla microscopia confocale a fluorescenza convenzionale. Il segnale SpeRe è stato localizzato lungo il centro degli assoni mielinizzati come previsto dalla geometria della riflessione ottica.Dallo spettro riflettente di un segmento di assone si otteneva la periodicità del numero d'onda, che veniva successivamente convertita in diametro dell'assone. Questo grafico illustra un profilo trasversale dell'intensità della fluorescenza dalla regione in scatola qui, e il diametro misurato da SpeRe è risultato essere in buon accordo con la misurazione basata sulla fluorescenza. L'imaging SpeRe si basa sulla riflessione ottica.Pertanto, un vetrino coprioggetti a base di silice può introdurre un rumore di fondo significativo. Nella configurazione ottica, il rumore di fondo era considerevole quando la profondità di imaging dal vetrino coprioggetti era inferiore a cinque micrometri, ma veniva evitato quando la profondità di imaging era maggiore di 15 micrometri. La fase di calibrazione non è richiesta per tutti gli esperimenti, ma è consigliata almeno una volta alla settimana.Una volta completata la calibrazione, la procedura di imaging può essere terminata in genere entro 20 secondi per ogni campo visivo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di considerare la latenza dinamica del rivelatore per la scansione dell'intero spettro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere la nanostruttura dagli assoni mielinizzati utilizzando le immagini di riflettanza.

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Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Fonte: Kwon, J., et al., Microscopia riflettometrica spettrale su assoni mielinizzati in situ.  J. Vis. Exp. (2018) Questo video dimostra l'uso della riflettometria spettrale con un microscopio confocale iperspettrale per analizzare i modelli di interferenza e determinare i diametri degli assoni mielinizzati in fette fisse di tessuto cerebrale.

Utilizzo della riflettometria spettrale per determinare i diametri degli assoni mielinizzati in una fetta fissa di cervello di topo

Fonte: McCullagh, E. A., et al. Applicazione coerente della spettroscopia Raman Anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione in fette di cervello. J. Vis. Exp. (2022)Il video mostra la fluorescenza e l'imaging della spettroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) per visualizzare l'architettura neuronale nel tessuto cerebrale dei roditori. La colorazione Nissl marca i corpi cellulari legandosi all'RNA ribosomiale, mentre l'imaging CARS prende di mira la mielina ricca di lipidi...

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Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

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Presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia time-lapse con eccitazione a due fotoni per visualizzare simultaneamente la dinamica delle lesioni degli assoni e della mielina in tempo reale. Questo protocollo proposto consente di studiare fattori sia intrinseci che estrinseci che possono influenzare il destino dell'assone mielinizzato centrale dopo una lesione e contribuire alla disabilità clinica permanente.

Un Ex Vivo Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.

Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero

Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l'acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.

Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

La microscopia A scattering Raman stimolato (SRS) consente l'imaging senza etichette di biomolecole in base alla loro vibrazione intrinseca di specifici legami chimici. In questo protocollo, viene descritta la configurazione strumentale di un microscopio integrato SRS e fluorescenza a due fotoni per visualizzare le strutture cellulari nel midollo spinale di topi vivi.

In vivo Imaging di tessuti biologici con fluorescenza combinata a due fotoni e microscopia a dispersione Raman stimolata

Visualizzare la mielinizzazione è un obiettivo importante per molti ricercatori che studiano il sistema nervoso. CARS è una tecnica compatibile con l'immunofluorescenza in grado di visualizzare nativamente i lipidi all'interno di tessuti come il cervello illuminando strutture specializzate come la mielina.

Applicazione coerente della spettroscopia Raman anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione nelle fette di cervello

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) funge da modello animale di sclerosi multipla. Questo articolo descrive un approccio per valutare l'infiammazione del midollo spinale, la demielinizzazione e la lesione assonale nell'EAE. Inoltre, viene presentato un metodo per quantificare i livelli di luce solubile dei neurofilamenti nel siero dei topi, facilitando la valutazione del danno assonale nei topi vivi.

Punteggio dell'infiammazione del sistema nervoso centrale, della demielinizzazione e della lesione assonale nell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Scopri la riflettometria spettrale per l'imaging senza marcatori di assoni mielinizzati in tessuto nervoso intatto. Questo metodo fornisce informazioni nanostrutturali quantitative con dosi di luce inferiori rispetto alla microscopia confocale convenzionale.

Microscopia spettrale riflettometrica su assoni Myelinated In Situ

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