Name: Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare lattività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri un metodo affidabile per misurare l'attività di sequestro autofagico bulk nelle cellule di mammifero tramite il dosaggio della lattato deidrogenasi (LDH). Questa tecnica quantifica il sequestro del carico endogeno senza sonde artificiali.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio norvegese della ricerca, dell'Università di Oslo, il Anders Jahre Foundation, la Fondazione di Nansen e l'eredità nella memoria di Henrik Homan. Ringraziamo il dottor Noboru Mizushima per il ATG5 + / + MEFs e ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu per il ATG7 + / + MEFs e ATG7-/-MEFs e Dr. Shizuo Akira per il ATG9A + + MEFs e ATG9A-/-MEFs. Ringraziamo Frank Sætre per assistenza tecnica e Dr. Per O. Seglen per discussioni costruttive metodologiche.

1. cellula semina e trattamento
<ol><li>
Cellule aderenti di cultura in recipienti di coltura del tessuto2 75 cm in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C, utilizzando il comodo mezzo di coltura per il tipo di cella in questione. Permettono alle cellule di crescere fino a raggiungere uno strato di cellule vicino-confluenti. Nota: Utilizzare RPMI 1640 supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) per LNCaP, HEK293, fibroblasti embrionali del mouse (MEFs), BJ, MCF-7 e cellule RPE-1.<ol>
<li>Lavare le cellule con soluzione da 3 mL Tampone fosfato 37 ° C (PBS), pH 7,4. Sostituire il PBS con 3 mL 0,25% (p/v) tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare la beuta in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C fino a staccano le cellule (2 – 5 min).</li>
		<li>Risospendere le cellule indipendente con 7 mL terreno di coltura contenente 10% FBS. Mescolare un'aliquota di sospensione cellulare 10 µ l con 10 µ l 0,4% Trypan Blue in un tubo del microcentrifuge, utilizzando un puntale di 0,5 – 20 µ l. Utilizzare la stessa punta della pipetta per riempire immediatamente una conteggio diapositiva di camera e contare le celle in un contatore di cellule automatizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare un'adeguata diluizione (Vedi nota sotto) della sospensione delle cellule dal punto 1.1.2 using cultura media contenente 10% FBS ed il seme di 1 mL di sospensione cellulare diluito in ciascun pozzetto di una piastra (superficie ~3.8 cm2) di coltura del tessuto 12-pozzetti utilizzando asettica tecnica. Consentono la crescita in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C fino a quando la densità di cella desiderata è stata raggiunta, ad esempio, 60 – 90% confluenza al momento del raccolto. Nota: La diluizione appropriata della sospensione delle cellule che darà il confluency di cella desiderata al momento del raccolto variano dal tipo delle cellule di tipo delle cellule, così come secondo la durata e il tipo di trattamenti sperimentali. Così, questo deve essere valutato empiricamente in ogni caso.<ol>
<li>Per gli esperimenti che devono essere entrambi trattati e raccolto 2 giorni dopo la semina, seme 2.5 x 105 LNCaP, HEK293, o MCF-7 celle, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ o 1.5 x 105 RPE-1 cellule in ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti.</li>
		<li>Per le cellule che aderiscono liberamente, ricoprire le piastre con il tipo di rivestimento consigliato per il tipo di cella in questione. Per le cellule di LNCaP (e HEK293) utilizzare piastre rivestite con poli-D-lisina (PDL).</li>
		<li>A tal fine, aggiungere 500 µ l PDL a 2,5 µ g/mL in sterile H2O ad ogni pozzetto e incubare le piastre in un ambiente sterile per 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C). Rimuovere il PDL con aspirazione e lavare ogni bene brevemente con 1 mL sterile H2O. Nota: In generale, punto 1.2.1 è fatto senza trattamenti sperimentali. Tuttavia, se si esegue RNAi, può essere conveniente per iniziare un transfection inverso con la semina9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire trattamenti sperimentali a wells duplicate o triplicate per condizione.
	<ol>
<li>Ad esempio, trattare le cellule con 50 nM di Torin1 l'inibitore di mTOR, che generalmente è un induttore efficiente del sequestro autofagica o sottoporre le cellule a acuta inedia dell'aminoacido e siero - lavando le cellule con 1 mL di amino acidi Earle di equilibrato Mezzo di soluzione (EBSS) di sale e successivamente Incubare le cellule in 1 mL di EBSS in un incubatore con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
		<li>Lasciare una serie di pozzi non trattata al fine di definire livelli di fondo di sedimentabili LDH.</li>
		<li>Aggiungere una quantità saturante del post-sequestro inibitore methyladenine A1 (Baf)3,13,16,18 nell'assenza o nella presenza dei trattamenti sperimentali, 3 – 4 h prima cella vendemmia. Incubare le cellule in un'incubatrice umidificata con 5% CO2 a 37 ° C.<ol>
<li>Uso 100 nM Baf per LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 e cellule RPE-1 e 10 nM Baf per MEFs.</li>
			<li>Per trattamenti sperimentali che hanno una durata di solo 3 – 4 h (come quelli esemplificati in punto 1.3.1 hanno in genere), aggiungere Baf simultaneamente con i trattamenti. Per trattamenti più sperimentali, attendere 3-4 ore prima della raccolta e aggiungere 2 µ l di una 500 x concentrato Baf stock direttamente nel terreno.</li>
			<li>Mescolare agitando la piastra immediatamente dopo l'aggiunta di Baf. A questo punto è anche raccomandabile per aggiungere gli inibitori macroautophagic sequestro come controlli, ad esempio, il pan-fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) inibitore della 3-metil adenina (3MA)19di 10 mM o 10 µM della classe selettiva di PI3K III inibitore di SAR-40520.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. raccolta e preparazione per Electrodisruption delle cellule
<ol><li>Alla fine del periodo di trattamento, aspirare il mezzo con aspirazione e aggiungere 200 µ l cella distacco di soluzione (pre-riscaldata a 37 ° C) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C fino a staccano le cellule (in genere circa 5 min). Nota: Considerando che 0,25% (p/v) tripsina-EDTA può essere usato anziché la soluzione di distacco delle cellule, quest'ultimo contiene DNasi, che aiuta a ridurre la viscosità delle cellule indipendente. Fino a quando il mezzo è accuratamente aspirato, non è necessario lavare le cellule prima dell'aggiunta della soluzione di distacco di tripsina-EDTA o cella.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l temperatura ambiente (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, contenente 2% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) in ciascun pozzetto e risospendere con la pipetta fino a quando non ciuffi di cella sono visibili. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare per provette per microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio. Nota: Se non diversamente specificato, è possibile eseguire tutti i passaggi successivi sul ghiaccio.</li>
	<li>Sedimenti le cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirare il supernatante (con aspirazione) per lasciare il pellet cellulare più asciutto possibile.</li>
	<li>Aggiungere 400 µ l 10% (p/v) di saccarosio (in ultrapura H2O) ad ogni provetta.</li>
</ol>3. membrana plasmatica Electrodisruption e separazione delle frazioni di totale-cellula e sedimentabili
<ol><li>Risospendere il pellet cellulare con una pipetta per ottenere una sospensione unicellulare nei pressi e trasferirlo in una cuvetta di elettroporazione di 4 mm. Nota: Pipettaggio altalenante ~ 10 – 15 volte, utilizzando una punta di pipetta 100 – 1.000 µ l, è in genere sufficiente.</li>
	<li>Disponga la provetta in un decadimento esponenziale onda electroporator e Scarica un singolo impulso elettrico a 800 V, 25 µF e 400 Ω; Queste impostazioni producono un impulso di durata ~ 8 ms.</li>
	<li>
Utilizzare un nuovo puntale per trasferire la disruptate di cella a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 400 µ l di soluzione ghiacciata saccarosio di tampone fosfato (monofosfato di sodio 100 mM, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA e 1,75% saccarosio, pH 7.5) e mescolare brevemente di pipettaggio.
	<ol>
<li>Facoltativo: Per verificare l'efficiente membrana plasmatica electrodisruption17, mescolare 10 µ l della disruptate cella diluito dal punto 3.3 con 10 µ l 0,4% Trypan blu in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Trasferire in una camera di conteggio e verificare che la percentuale di cellule positive Trypan Blue è &gt; 99%.<ol>
<li>Lasciare il campione nella camera di conteggio per 30 min a temperatura ambiente (20 – 25 ° C) e verificare che la percentuale di cellule positive tripan blu è rimasta &gt; 99%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Facoltativo: Per verificare che il electrodisruption non è stato troppo duro, che è, esso non ha perturbato organelli intracellulari, eseguire passaggi 1.1 – 3.3 come descritto sopra, ma utilizzare un materiale di partenza più grande (un bene da una piastra a 6 pozzetti con uno strato di cellule confluenti ~ 80%), e utilizzare 150 µ l 10% di saccarosio in passo 2.5 e 150 µ l tampone fosfato saccarosio soluzione senza DTT in fase 3.3.<ol>
<li>Utilizzare una pipetta a attentamente strato 200 µ l della soluzione diluita cella disruptate sopra un cuscino di densità 1,2 mL di mezzo gradienti di densità 8% (p/v) di tampone fosfato (ad es., 8% Nycodenz, fosfato di sodio di 50 mM, 2,2% saccarosio, 1 mM EDTA) in una centrifuga di 2 mL tubo. Centrifugare a 20.000 x g per 45 min a 4 ° C in una microcentrifuga con funzione soft-mode (per dolce accelerazione e decelerazione) e con attenzione mettere i tubi sul ghiaccio.</li>
			<li>Rimuovere delicatamente 60 µ l della frazione superiore ~ 200 µ l, facendo attenzione a non prendere qualsiasi soluzione di medio gradiente di densità e trasferire ad un tubo del microcentrifuge fresco. Nota: Questo dovrebbe contenere citosol di eccezionale purezza, definito "cella sap"21.</li>
			<li>Prova la purezza della frazione ottenuta nel passaggio precedente, eseguendo analisi western blot di proteine contenute organello, utilizzando tecniche standard e 4 – 20% gel gradiente16.</li>
			<li>Eseguire ad esempio immunoblotting per catepsina B21, citocromo c e isomerasi del bisolfuro della proteina, per verificare che l'elettroshock nel passaggio 3.2 non ha sconvolto i lisosomi, mitocondri o reticolo endoplasmico di massima, rispettivamente e immunoblot per LDH per verificare la presenza di una proteina citosolica nella linfa delle cellule.</li>
			<li>In parallelo, è possibile eseguire immunoblotting su estratti proteici fatti dal totale delle cellule disruptate soluzione16 per confermare che gli anticorpi utilizzati in grado di rilevare le proteine contenute in organelli che sono in fase di valutazione.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1-3.3 per ogni campione.</li>
	<li>Rimuovere 550 µ l da ogni soluzione di disruptate cella diluito (ottenuta al punto 3.3) per microcentrifuga 2 mL contenente 900 tampone di risospensione ghiacciata µ l (monofosfato di sodio di 50 mM, 1 mM DTT, 1 mM EDTA e 5,9% saccarosio, pH 7.5) completati con BSA 0.5% e 0,01% Tween-20 e mescolare brevemente di pipettaggio.</li>
	<li>Centrifuga a 18.000 x g per 45 min a 4 ° C per produrre il pellet contenente "sedimentato LDH". Aspirare il supernatante (con aspirazione) per lasciare i pellet più asciutto possibile. Posizionare i campioni in un congelatore a-80 ° C.</li>
	<li>Trasferire 150 µ l di ogni soluzione di disruptate cella diluito (ottenuta al punto 3.3) in nuove provette e posizionare i campioni in un congelatore a-80 ° C. Utilizzare questi esempi per determinare i livelli di "totale LDH" nelle cellule. Nota: A questo punto l'esperimento può essere sospeso per fino a quando lo si desidera.</li>
</ol>4. LDH estrazione e misurazione dell'attività enzimatica di LDH
<ol><li>Disgelo "LDH sedimentato" (dal punto 3.6) e "totale LDH" campioni (punto 3.7) sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 300 µ l di tampone di risospensione ghiacciata contenente 1,5% Triton X-405 a "LDH totale" campioni (producendo una concentrazione finale di Triton X-405 dell'1%). Ruotare i campioni su un rullo in una cella frigorifera (4 – 8 ° C) per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 750 µ l di tampone di risospensione ghiacciata con 1% Triton X-405 a "LDH sedimentato" campioni e risospendere il pellet con una pipetta, fino a quando non raggiunge una soluzione omogenea.</li>
	<li>Centrifugare i campioni dal punto 4.2 e 4.3 a 18.000 x g per 5 min a 4 ° C a detriti cellulari sedimento non disciolto.</li>
	<li>Mix 4 parti di imidazolo freddo 65 mM (piruvato di pH 7.5)/0.75 mM con una parte dell'imidazolo freddo 65 mM (pH 7,5) / 1,8 mM NADH per ottenere una soluzione di lavoro è stabile per almeno tre settimane a 4 ° C.</li>
	<li>Mescolare 3 – 30 µ l di surnatanti dal passaggio 4.4 con 200 µ l di soluzione di lavoro il passaggio 4.5.</li>
	<li>Determinare la quantità di LDH misurando l'attività enzimatica LDH come il calo di nicotinamide adenindinucleotide (forma ridotta) assorbanza (NADH) a 340 nm a 37 ° C, rispetto ad uno standard con una concentrazione nota di LDH. Eseguire misure di assorbanza fino a quando la reazione si è avvicinato completamento, cioè fino a quando l'assorbanza a 340 nm non cambia con il tempo. Nota: Questo è il metodo classico di biochimico per misurare l'attività LDH. Anche se l'attuale protocollo esegue la reazione a 37 ° C, può anche essere eseguita a temperatura ambiente (20 – 25 ° C), che è consigliabile se facendo manuale spettrofotometria. L'attuale protocollo utilizza uno strumento di multianalyzer robotico, che in modo automatico mescola campioni con soluzione di lavoro in una piastra a 96 pozzetti e misura l'assorbanza a 340 nm a 37 ° C ogni 20 s per 3 min. Da allora in poi, il software dello strumento calcola la concentrazione di LDH, espressa come unità (U) / L, confrontando la pendenza delle misurazioni assorbanza nel tempo rispetto ad una curva standard ottenuta attraverso la calibrazione con standard di LDH noto concentrazione. La gamma lineare di rilevamento di questo approccio è 30 – 1.500 U/L. In alternativa, esiste una vasta gamma di kit commercialmente disponibili per misurare LDH. Alcuni di loro sono basati sulla reazione enzimatica per la generazione di prodotti colorimetrici o fluorescente, che permette la rilevazione di altri mezzi di spettrofotometria UV e con altre gamme lineari di rilevazione di accoppiamento.</li>
</ol>5. calcolo del sequestro di LDH
<ol><li>Calcolare la percentuale di LDH sedimentato di LDH totale per ciascun campione, prendendo le diluizioni e campionamento in considerazione: Sedimentato LDH (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> Nota: Durante le fasi 3.1-3.3 circa 50 µ l è perso a causa di trasferimento dentro e fuori la cuvetta di elettroporazione. Così, calcolare da avere un totale di 750 µ l (invece di 800 µ l) di disruptate di cella diluito al punto 3.3.</li>
	<li>Sottrarre la percentuale di LDH sedimentato ottenuti nei campioni da cellule non trattate (punto 1.3.2) dalla percentuale di LDH sedimentato ottenuta nei campioni di cellule trattate sperimentalmente e dividere il tempo di trattamento con Baf per ottenere la percentuale di LDH sequestrato all'ora nel periodo di campionamento: Sequestrato LDH (% / h) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

In sintesi, il protocollo descritto qui rappresenta un metodo affidabile e ampiamente applicabile per monitorare l'attività di sequestro autofagica alla rinfusa in cellule di mammifero. Rispetto per l'originale metodo12,16, abbiamo rimosso una serie di passaggi inutili, semplificato molti dei passaggi rimanenti e presentare un downscaling sostanziale. Di conseguenza, il protocollo è notevolmente migliorato in relazione alla efficienza di costi e tempo, e la stess...

Autofagia (greco per "auto-eating") è un processo evolutivo conservato per vacuolar/lysosomal degradazione di materiale intracellulare. Al momento della scoperta dei geni autophagy-relative ("ATG"), che sono importanti per autofagia in lievito ed in esseri umani, e la realizzazione che autophagy svolge un ruolo significativo nella salute e nella malattia (riconosciuto dal premio Nobel 2016 in medicina o fisiologia di Yoshinori Ohsumi), l'autofagia è rapidamente diventato uno dei processi più intensamente studiati in biologia cellulare1,2.
Macroautophagy (in appresso denominato "autofagia") è caratterizzata dall'espansione e pieghevole di cisterne intracellulare membrana ("phagophores") in strutture sigillate, doppio - o multi - membrane ("autofagosomi") che sequestrano efficacemente il materiale avvolto dal resto del citoplasma. Al momento della fusione di autofagosomi con i lisosomi, membrana dell'autofagosoma interiore e il carico sequestrato è degradato e riciclato. Autofagosomi possono sequestrare materiale citoplasmico sia casuale (non-selettivi dell'autofagia) e le buone maniere selettiva (selective autofagia). Bulk autofagia molto probabilmente rappresenta un mix di autofagia selettivo e non selettivi.
Negli anni ' 60 e 70 ("la morfologica era" della ricerca di autofagia), sequestro autofagica principalmente è stato valutato attraverso analisi ultrastrutturali. Negli anni ottanta e inizio anni ' 90 ("l'era di biochimica") Per Seglen e colleghi di lavoro — che ha studiato l'autofagia in epatociti primari del ratto — ha sviluppato i primi metodi per misurare quantitativamente autofagica sequestro attività3. Utilizzando queste analisi, Seglen definito e caratterizzato diverse fasi del pathway autofagico-lisosomiale4,5, scoperto e coniato il amphisome6 (il prodotto della fusione di endosome-autofagosoma) e fu il primo a descrivere il ruolo della fosforilazione della proteina nell'autofagia regolamento7. Tuttavia, dopo la scoperta dell'ATG nel 1990 ("l'era molecolare") e la prima caratterizzazione di una proteina di ATG8 dei mammiferi, proteina microtubule-collegata 1A/1B-luce catena 3 (LC3) nel 20008, l'uso di proteine ATG come marcatori per la processo autofagico rapidamente guadagnato popolarità, e i più vecchi e più laboriosi metodi biochimici sono stati lasciati indietro. Infatti, sopra gli ultimi 18 anni, western blot e analisi di microscopia di fluorescenza di LC3 sono diventati di gran lunga più popolari (e in molti casi l'unico) mezzi di studiare l'autofagia in cellule di mammifero. Il vantaggio è la relativa facilità con cui questi metodi possono essere effettuati. Lo svantaggio è che uno sta studiando un componente carrello (LC3) piuttosto che di effettivo carico autofagico. Questo è uno svantaggio piuttosto grave, perché il rapporto tra gli Stati e/o flusso di LC3 attraverso la via contro il sequestro e il flusso di merci è molto chiaro. Infatti, abbiamo dimostrato che il flusso di merci alla rinfusa può essere mantenuta ad alti livelli in condizioni dove non c'è nessun flusso di LC3, nonostante la presenza di LC3 coniugati in cellule9. Inoltre, abbiamo dimostrato che autophagy di massa non è influenzato da efficiente LC3 svuotamento e quindi probabilmente è LC3-indipendente9. Ciò che trova è stata confermata più tardi da LC3 knock-out studi10,11, che inoltre indicano che mitophagy Parkin-dipendente (l'autofagia selettiva dei mitocondri) è indipendente di LC310,11 .
In sintesi, c'è una chiara esigenza di analisi del carico-based monitorare attività autofagica. In modo ottimale tali dosaggi dovrebbero essere ampiamente applicabili, ben definito e facile da eseguire. Negli ultimi anni abbiamo preso un particolare interesse nell'analisi di sequestro della LDH, che è stato sviluppato da Per Seglen nei12anni ' 80 e si basa sulla misurazione del transfer di LDH citosolico a sedimentabili, cella contenenti vacuolo autophagic frazioni. LDH è una proteina citosolica stabile, solubile che co-è prontamente sequestrata quando phagophores enwrap citoplasmico del carico. Sequestro di LDH è pertanto una misura generale di sequestro autofagico. LDH è esclusivamente degradata dalla via autofagica lysosomal12. Così, in presenza di inibitori di degradazione lisosomiale, ad es., methyladenine A1 (Baf)13, direttamente gli effetti del trattamento sperimentale riflettono le alterazioni nell'attività di sequestro autofagici. In assenza di inibitori di degradazione, l'effetto netto delle alterazioni nel sequestro di LDH e degradazione può essere misurata.
Il dosaggio di sequestro di LDH è largamente applicabile, poiché LDH è altamente e ubiquitariamente espressa in tutti i tipi di cellule, e livelli di LDH possono essere quantificati con precisione da un dosaggio enzimatico14,15. Tuttavia, l'originale protocollo12 — stabilito in epatociti primari del ratto — piuttosto che richiede tempo e necessitava di una quantità elevata di inizio materiale nonché un condensatore scarico elettrico su misura. In maniera graduale, abbiamo trasformato gradualmente il dosaggio in un metodo facile e versatile. In primo luogo, il protocollo originale è stato adattato per l'uso in cellule di mammifero linee16. In secondo luogo, il metodo era sostanzialmente ridimensionato3,9. Terzo, sono stati eliminati diversi passaggi nel protocollo, tra cui un cuscino di densità laborioso passo17. Questo permesso simultaneamente un downscaling ulteriormente del metodo, il punto di partenza originale di usando un piatto di 10 cm per esempio16 all'utilizzo di un singolo pozzo da una piastra 12-pozzetti per campione (vale a dire, circa 15 volte meno a partire materiale)17. In quarto luogo, abbiamo identificato un'apparecchiatura di elettroporazione commerciale che potrebbe sostituire il condensatore scarica elettrica su misura17.
Qui è presentato il nostro protocollo più aggiornata del dosaggio di sequestro di LDH, che comprende alcune ulteriori semplificazioni del metodo rispetto al precedentemente pubblicato il17 . Inoltre, viene presentata una serie di tipici risultati ottenuti in un certo numero di diversi tipi di cellule, e soprattutto, più righe di convalide sperimentali del metodo utilizzando farmacologica nonché genetica atterramento e knockout approcci sono forniti. Per uno schema globale di flusso del protocollo intero, Vedi Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL e 2 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>211-2130 e 211-2120</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 12 pozzetti&nbsp;</td>Soluzione di distacco cellulare <td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Tecnologie cellulari innovative</td><td>A7089</td><td>Mantenere le aliquote a -20 gradi C per anni, e in frigo per qualche mese</td></tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Enzo</td><td>BML-CM110-0100</td><td>Sciogliere in cellule DMSO</td></tr><tr><td>BJ</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>utilizzare al passaggio < 30</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Burker</td><td>Fisher Scientific</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>Countess Camera di conteggio delle cellule Vetrini</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess II</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura per la camera</td> <td>di conteggio BurkerFisher Scientific</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>Criterio Tris-HCl Gel, 4&ndash; 20%, 26 pozzetti, 15 &micro; L, 13,3 cm x 8,7 cm (L x L)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>contiene 0,1%</td></tr><tr><td>glucosio EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione (4 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore a onde di decadimento esponenziale</td><td>BTX Harvard Apparecchiatura</td><td>&nbsp; EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>10% concentrazione finale in RPMI 1640 cellule medie</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>Autoclave una soluzione da 65 mM e conservare in frigorifero per mesi</td></tr><tr><td>Incubatrice; Incubatore a CO2 a calore diretto IR Autoflow</td><td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>cellule LNCaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>utilizzo al passaggio < 30</td></tr><tr><td>3-metil adenina (3MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9281</td><td>Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Scorta di calore a 65 &deg; C per 10 minuti e utilizzare a concentrazione finale di 10 mM</td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata con funzione soft-mode</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Eppendorf 5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MRT67307 cloridrato (ULKi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0702</td><td>Inibisce l'attività chinasica ULK. Dissolvere in DMSO.</td></tr><tr><td>Strumento multianalizzatore MaxMat</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>Celle MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Siero ridotto Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette 3 (0,5-20 &; micro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART Puntali barriera</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1-200 &; L)</td><td>VWR</td><td>732-2207&nbsp;</td><td>Thermo Fischer ART Punte barriera</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (100-1.000 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2355&nbsp;</td><td>Thermo Fischer ART Punte barriera</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>ThermoFisher</td><td>4701070</td><td>Finnpipette F2 GLP Kit</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>Preparare una soluzione madre da 1 mg/mL in H2O sterile. Questa soluzione è stabile a -20 &deg; C per almeno 1 anno.</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Merck-Millipore</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>cellule RPE-1 (hTERT RPE-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp;</td><td>A8883</td><td>Inibisce la fosfoinositide 3-chinasi di classe III (PIK3C3). Dissolvere in DMSO.</td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona Controllo negativo #1 (siCtrl)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona siRNA mirato ATG9 (siATG9A)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona siRNA mirato FIP200 (siFIP200)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona siRNA mirato ULK1 (siULK1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona siRNA mirato a ULK2 (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAP (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAPL1 (siGABARAPL1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>Silenziatore Seleziona siRNA mirato a GABARAPL2 (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico diidrato (NaH2PO4 &bull; 2H2O)&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico diidrato (Na2HPO4 & 2H2O )&nbsp;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>10% concentrazione finale in acqua; filtrare 0,45 &; m filtrare e conservare in frigorifero per mesi</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Inibisce la pompa SERCA ER Ca2+. Dissolvere in DMSO.</td></tr><tr><td>Triton X-405&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>1% finale</td></tr><tr><td>Trypan colorazione blu 0,4%</td><td>Sonde molecolari</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25% p/v tripsina)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>0,01% finale</td></tr></tbody></table>

il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro bulk in cellule di mammifero

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

L'autofagia alla rinfusa è caratterizzato tramite il sequestro di grandi porzioni di citoplasma in doppio/multi-membrane strutture definite autofagosomi. Qui è descritto un semplice protocollo per monitorare questo processo. Inoltre, sono disponibili i risultati tipici e validazione sperimentale del metodo in condizioni che inducono autofagia in vari tipi di cellule di mammiferi coltivate. Durante l'autofagia alla rinfusa, autofagosomi sequestrano il citosol e quindi anche proteine citosoliche solubili, a fianco di altri carichi autofagici. LDH è una stabile e altamente solubile, abbondante enzima citosolico che è non-selettivamente sequestrata in autofagosomi. La quantità di sequestro di LDH pertanto riflette la quantità di sequestro autofagica alla rinfusa. Per efficientemente ed esattamente determinare sequestro di LDH in cellule, ci avvaliamo di un protocollo basato su electrodisruption frazionamento che separa efficacemente sedimentabili da citosolico LDH, seguita dalla misurazione dell'attività enzimatica in sedimentabili frazioni contro campioni di cellule intere. Autofagica sequestro è determinato sottraendo la proporzione di sedimentabili LDH in cellule non trattate da quello nelle cellule trattate. Il vantaggio del dosaggio di sequestro di LDH è che dà una misura quantitativa del sequestro autophagic del carico endogeno, al contrario di altri metodi che sia coinvolgere l'espressione ectopica di sequestro sonde o semi-quantitativa della proteasi analisi di protezione di autofagia marcatori o recettori.

Utilizzando il protocollo descritto qui, attività di sequestro autofagica alla rinfusa in un certo numero di linee cellulari di mammifero diversi, tra cui LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, fibroblasti embrionali (MEFs) il mouse, RPE-1, Cellule HEK293, BJ e LNCaP è stata misurata. Sequestro è stato valutato in condizioni basali (in mezzo completo, ricco di sostanze nutritive), o in cellule acutamente affamato per il siero e gli aminoacidi (u...

Qui è descritto un protocollo semplice ed e validato per la misurazione di massa autofagica sequestro attività in cellule di mammifero. Il metodo si basa su quantificare la percentuale di lattato deidrogenasi (LDH) in frazioni cellulari sedimentabili rispetto ai livelli LDH cellulari totali.

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'autofagia, come ad esempio come viene regolata la formazione degli autofagosomi e come vari trattamenti e condizioni cellulari influenzano l'autofogia di massa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che misura il sequestro endogeno del carico. Pertanto, il metodo è ampiamente applicabile e indipendente dalla sovraespressione artificiale o dall'introduzione di sonde per il carico.A dimostrare la procedura, saranno Paula Szalai e Morten Luhr, dottorandi del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare cellule aderenti in fiasche di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Lascia che le cellule crescano fino a raggiungere uno strato cellulare quasi confluente.Successivamente, lavare le cellule con tre millilitri di PBS a 37 gradi Celsius a pH 7,4. Rimuovere il PBS e sostituirlo con tre millilitri di tripsina EDTA allo 0,25%. Incubare in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius, fino a quando le cellule non si staccano.Successivamente, risospendere le cellule in sette millilitri di terreno di col

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Questo video descrive un test colorimetrico per la misurazione del lattato nei lisati cellulari utilizzando l'enzima lattato deidrogenasi. Questo enzima converte il lattato in piruvato, insieme alla conversione del NAD in NADH che reagisce con i coloranti tetrazolio e fornisce un prodotto colorato che può essere misurato spettrofotometricamente per quantificare il lattato.

Saggio colorimetrico per la quantificazione del lattato nei campioni di prova

Il video mostra un test per valutare l'attività di sequestro autofagico di massa nelle cellule di mammifero. Utilizza l'elettroporazione per rilasciare proteine citosoliche, tra cui la lattato deidrogenasi (LDH). Le frazioni di LDH sequestrate e LDH cellulari totali sono determinate per valutare il sequestro di LDH, fornendo informazioni sull'attività complessiva di sequestro di massa.

Quantificazione dell'attività di sequestro autofagico di massa nelle cellule di mammifero

Qui, la citometria a flusso di imaging multispectrale con una caratteristica analitica che confronta immagini luminose di dettagli di 3 marcatori autofag e quantifica la loro co-localizzazione, insieme al conteggio spot LC3, è stata utilizzata per misurare l'autofagia in modo oggettivo, quantitativo e statisticamente robusto.

Valutare il flusso autofagico misurando LC3, p62 e LAMP1 Co-localizzazione usando la citometria del flusso di imaging multispettrale

Mitophagy, il processo di schiarimento danneggiato i mitocondri, è necessario per la manutenzione di salute e omeostasi mitocondriale. Questo articolo presenta alcune delle mitophagy più recenti metodi di rilevazione in Caenorhabditis eleganse cellule umane in topi.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Descriviamo un protocollo per mappare la distribuzione spaziale dell'attività enzimatica per enzimi che generano nicotinatmide adenina dinucleotide fosfato (NAD + H + direttamente nei campioni di tessuto.

Metabolismo di mappatura: Monitoraggio dell'attività della deidrogenasi del lattato direttamente nel tessuto

Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.

Su piccola scala saggi colorimetrici di intracellulare lattato e piruvato nel Nematode Caenorhabditis elegans

L'obiettivo di questo protocollo è determinare i livelli autofagici nel cancro del pancreas e nelle cellule acinose pancreatiche attraverso l'immunofluorescenza LC3 e la quantificazione dei punti LC3.

Valutazione dei livelli di autofagia in due diversi modelli di cellule pancreatiche utilizzando l'immunofluorescenza LC3

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'uso di un saggio reporter basato sulla luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.

Screening farmacologico cellulare per gli inibitori della peptidasi 4B cisteina correlata all'autofagia

Qui, presentiamo la metodologia per valutare in modo conciso i livelli di LC3-II del marcatore autofagosomico nelle vescicole extracellulari (EV) mediante immunoblotting. L'analisi dei livelli di LC3-II nelle vescicole extracellulari, nella formazione di autolisosomi e nella formazione di omegasomi suggerisce il nuovo ruolo di STX6 nel rilascio di vescicole extracellulari LC3-II positive quando la fusione autofagosoma-lisosoma è inibita.

Valutazione del rilascio di LC3-II attraverso vescicole extracellulari in relazione all'accumulo di vescicole intracellulari LC3-positive

Pirosequenziamento (R) è uno dei metodi più approfondita ma semplice fino ad oggi utilizzato per analizzare polimorfismi. Questo metodo ha portato a un rapido ed efficiente a singolo nucleotide valutazione polimorfismo tra cui molti polimorfismi clinicamente rilevanti. La tecnica e la metodologia della Pyrosequencing è spiegato.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Scopri un metodo affidabile per misurare l'attività di sequestro autofagico bulk nelle cellule di mammifero tramite il dosaggio della lattato deidrogenasi (LDH). Questa tecnica quantifica il sequestro del carico endogeno senza sonde artificiali.

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare lattività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

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