Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'autofagia, come ad esempio come viene regolata la formazione degli autofagosomi e come vari trattamenti e condizioni cellulari influenzano l'autofogia di massa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che misura il sequestro endogeno del carico. Pertanto, il metodo è ampiamente applicabile e indipendente dalla sovraespressione artificiale o dall'introduzione di sonde per il carico.

A dimostrare la procedura, saranno Paula Szalai e Morten Luhr, dottorandi del mio laboratorio. Per iniziare, coltivare cellule aderenti in fiasche di coltura tissutale da 75 centimetri quadrati in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Lascia che le cellule crescano fino a raggiungere uno strato cellulare quasi confluente.

Successivamente, lavare le cellule con tre millilitri di PBS a 37 gradi Celsius a pH 7,4. Rimuovere il PBS e sostituirlo con tre millilitri di tripsina EDTA allo 0,25%. Incubare in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius, fino a quando le cellule non si staccano.

Successivamente, risospendere le cellule in sette millilitri di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e trasferirle in una provetta sterile da 50 millilitri. Utilizzando un puntale per pipetta da 0,5 a 20 microlitri, trasferire 10 microlitri di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga contenente 10 microlitri di blu di tripano. Utilizzare la stessa punta della pipetta per riempire immediatamente un vetrino della camera di conteggio e contare le cellule in un contatore di cellule automatizzato.

Quindi utilizzare un terreno di coltura contenente il 10% di FBS per preparare un'adeguata diluizione della sospensione cellulare. Utilizzando tecniche asettiche, seminare un millilitro della sospensione cellulare diluita in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Incubare in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius fino a raggiungere la densità cellulare desiderata.

Ai trattamenti sperimentali desiderati lasciare un set di pozzetti non trattato per definire i livelli di fondo di LDH sedimentabile. Tre o quattro ore prima del raccolto, aggiungere una quantità saturante di inibitore post-sequestro Bafilomicina A1 a ciascun pozzetto. Incubare in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.

Al termine del periodo di trattamento, si aspira per aspirare il fluido. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di distacco cellulare preriscaldata a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano.

Aggiungere 500 microlitri di PBS a temperatura ambiente a pH 7,4 contenente il 2% di BSA in ciascun pozzetto. Utilizzando una pipetta, sospendere nuovamente ciascun pozzetto fino a quando non sono visibili grumi di cellule. Successivamente, trasferire immediatamente la sospensione cellulare in ciascun pozzetto in una provetta da microcentrifuga separata da 1,5 millilitri con ghiaccio.

Centrifugare le provette a 400 volte g e quattro gradi centigradi per cinque minuti per sedimentare le cellule. Utilizzare l'aspirazione per aspirare completamente il surnatante, lasciando i pellet cellulari il più asciutti possibile. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione contenente il 10% di saccarosio in acqua ultra pura in ogni tubo.

Utilizzando una pipetta, risospendere il pellet di cella per ottenere una sospensione di una singola cellula quasi singola. Trasferire questa sospensione in una cuvetta per elettroporazione da quattro millimetri. Posizionare la cuvetta in un elettroporatore a onde di decadimento esponenziale e scaricare un singolo impulso elettrico a 800 volt, 25 microfarad e 400 ohm.

Utilizzare un nuovo puntale per pipetta per trasferire il disgregatore cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 400 microlitri di soluzione di saccarosio tamponato con fosfato ghiacciato e mescolare brevemente mediante pipettaggio. Ripetere questo processo di risospensione, elettro-disgregazione e miscelazione per ogni campione. Se si esegue la procedura per la prima volta, assicurarsi di verificare l'elettrodisgregazione della membrana plasmatica efficiente e selettiva come descritto nel testo.

Per ottenere frazioni di LDH sedimentate, rimuovere 550 microlitri da ciascuna soluzione diluita di disgregazione cellulare e trasferirla nella propria provetta da microcentrifuga da due millilitri contenente 900 microlitri di tampone di risospensione ghiacciato con 0,5% BSA e 0,01% Tween 20. Pipettare brevemente per mescolare. Centrifugare a 18.000 volte g e quattro gradi centigradi per 45 minuti per produrre pellet contenenti LDH sedimentato.

Utilizzando l'aspirazione, aspirare accuratamente il surnatante per lasciare i pellet il più asciutti possibile. Conservare i campioni di LDH sedimentati a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi. Per le frazioni totali di LDH, trasferire 150 microlitri da ciascuna delle soluzioni di disgregazione cellulare diluite alla propria nuova provetta.

Conservali in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi. Scongelare sia i campioni di LDH sedimentati che quelli totali di LDH su ghiaccio. Una volta scongelato, aggiungere 300 microlitri di tampone di risospensione ghiacciato contenente l'1,5% di Triton X-405 al totale dei campioni di LDH.

Ruotare i campioni su un rullo in una cella frigorifera per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 750 microlitri di tampone di risospensione ghiacciato contenente l'1% di Triton X-405 ai campioni di LDH sedimentati. Utilizzare una pipetta per risospendere i pellet fino a quando la soluzione non è omogenea.

Centrifugare tutti i campioni a 18.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per sedimentare i detriti cellulari non disciolti. Al termine della centrifugazione, mettere i campioni sul ghiaccio. Determinare i livelli di LDH nei surnatanti utilizzando un classico test enzimatico come descritto nel testo o uno qualsiasi dei numerosi kit disponibili in commercio.

In questo studio, l'attività di sequestro autofagico di massa è monitorata in un certo numero di diverse linee cellulari di mammiferi. Come mostrato qui, sia il sequestro basale che quello indotto dalla fame di LDH e le cellule LNCaP sono completamente abolite dall'inibitore della pan-PI3-chinasi, 3MA. L'inibitore selettivo della PI3-chinasi di terza classe, SAR-405 e l'inibitore della pompa del calcio ER, Thapsigargin.

Nelle cellule HEK293, il sequestro di LDH in condizioni di fame è fortemente ridotto sia da Thapsigargin che dall'inibitore ULK, MRT 67307. Inoltre, è stato dimostrato che il sequestro di LDH indotto dalla fame è costantemente inibito dalla 3MA nelle altre linee cellulari osservate. Successivamente, vengono impiegati vari MEF knockout per il gene ATG per verificare se i geni correlati all'autofagia riportati come essenziali per la formazione dell'autofagosoma sono necessari per il sequestro dell'LDH.

Come si può vedere, il sequestro di LDH indotto dalla fame è abolito nel MEFS knockout ATG5. Inoltre, è anche smussato nei MEF knockout ATG7 e ATG9A. Infine, vengono determinati gli effetti del silenziamento mediato dall'RNAi dei trascritti chiave del gene ATG.

Si è visto che la trasfezione con un siRNA bersaglio ATG9A o con il targeting combinato di ULK1 e ULK2 riduce fortemente il sequestro di LDH nelle cellule LNCaP. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante essere accurati in tutte le fasi del pipettaggio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il saggio di degradazione delle proteine a lunga durata, al fine di rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se sono state osservate alterazioni nell'attività di sequestro con conseguenti cambiamenti comparabili nell'attività di degradazione autofagica.

Dopo aver stabilito questo metodo in linee cellulari di mammifero, lo abbiamo utilizzato per dimostrare che l'autofagia di massa è indipendente dalla famiglia di proteine LC3 e richiede invece GABARAP. Ciò evidenzia l'importanza di impiegare metodi indipendenti da LC3 per monitorare l'attività dell'autofagia.