Name: Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Impara a quantificare l'mRNA di nuova sintesi in Saccharomyces cerevisiae usando il 4-tiouracile. Questo metodo misura l'attività della RNA polimerasi II separando la sintesi dal decadimento dell'RNA.

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Ringraziamo Laszlo Tora per il suo sostegno e V. Fisher, K. Schumacher e F. El Santoliquido per le loro discussioni. T.B. è stata sostenuta da una borsa di studio Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) e l'arco di Fondation. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Questo studio è stato supportato anche da ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo di stato francese gestito dall'Agence Nationale de la Recherche sotto il telaio programma Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

1. cellula coltura e lo svuotamento di rapamicina di una subunità SAGA
<ol><li>Per ogni ceppo di S. cerevisiae e replicare, tra cui wild type o ceppi di controllo, inoculare una singola Colonia da una piastra fresca al 5 mL di terreno YPD (2% Peptone, Estratto di lievito 1% e 2% di glucosio).</li>
	<li>Crescere le cellule di S. cerevisiae durante la notte a 30 ° C con agitazione costante (150 rpm).</li>
	<li>Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) e diluire la cultura a un OD600 di circa 0,1 in 100 mL di mezzo YPD e far crescere fino a quando il OD600 è intorno a 0,8.</li>
	<li>In parallelo, inoculare una singola Colonia delle cellule di S. pombe da un piatto fresco in 50 mL di mezzo di sì (0,5% di Estratto di lievito; 250 mg/L dell'adenina, istidina, uracile, leucina e lisina; 3% glucosio) e far crescere le cellule durante la notte a 32 ° C con agitazione costante (150 giri/min).</li>
	<li>Misurare il OD600 della cultura durante la notte di S. pombe e diluire la cultura a un OD600 di circa 0,1 a 500 mL di mezzo di sì e lasciarlo crescere fino a quando il OD600 è circa 0.8.</li>
	<li>Per ogni S. cerevisiae ceppo di ancoraggio-away e replicare, tra cui wild type o ceppi di controllo, inoculare una singola Colonia da una piastra fresca al 5 mL di terreno YPD (2% Peptone, Estratto di lievito 1% e 2% di glucosio).</li>
	<li>Crescere le cellule durante la notte a 30 ° C con agitazione costante (150 rpm).</li>
	<li>La mattina successiva, misurare il OD600, diluire la cultura a un OD600 di circa 0,1 in 100 mL di mezzo YPD e lasciarlo crescere fino al OD600≈ 0,8.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di rapamicina alla cultura da una soluzione madre di 1 mg/mL (concentrazione finale rapamicina di 1 µ g/mL) e lasciare che le celle Incubare a 30 ° C con agitazione costante per il tempo necessario per la proteina di interesse ad essere condizionalmente esaurito dal nucleo ( di solito, 30 min è adeguato). Per il controllo, usare una coltura di lievito simile, ma invece di aggiungere rapamicina, aggiungere il volume equivalente di solfossido dimetilico (DMSO).</li>
</ol>2. 4tU etichettatura con S. pombe come Spike-in (conteggio)
<ol><li>
Preparare una soluzione fresca di 2 M. 4-tiouracile. Una volta preparato, tenerlo a temperatura ambiente e lontano dalla luce.
	<ol>
<li>Con precisione pesare 64,1 mg di 4-tiouracile per ogni cultura di S. cerevisiae e scioglierla in 250 µ l di dimetilformammide (DMF) o in 250 µ l di DMSO.</li>
		<li>Per la cultura di S. pombe essere utilizzato come spike-a, pesa 320,5 mg di 4-tiouracile e dissolverlo in 1.250 µ l di DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di 4-tiouracile in S. cerevisiae e S. pombe culture per una concentrazione finale di 5 mM e li Incubare per 6 min con agitazione costante a 30 ° C e 32 ° C, rispettivamente.</li>
	<li>Dopo 6 min, rimuovere una piccola aliquota di ogni cultura per conta cellulare. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatica o di una camera di Neubauer.</li>
	<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione (2.500 x g) per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminare il supernatante, lavare le cellule con PBS 1X ghiacciata e centrifugare nuovamente (2.500 x g, 4 ° C, 5 min).</li>
	<li>Calcolare il numero totale di cellule in tutti gli esempi di S. cerevisiae e S. pombe .</li>
	<li>Risospendere le cellule in 5 mL di PBS 1X ghiacciata e mescolare S. cerevisiae con S. pombe le cellule con un rapporto 3:1.</li>
	<li>Centrifugare le cellule (2.500 x g, 4 ° C, 5 min), rimuovere il PBS, flash-congelare le cellule nel liquido N2e conservare il campione a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.</li>
</ol>3. RNA estrazione e trattamento della dnasi
<ol><li>Scongelare le cellule sul ghiaccio per circa 20 – 30 min.</li>
	<li>Procedere con l'estrazione di RNA utilizzando un kit di estrazione di lievito-RNA (Tabella materiali) con alcuni adattamenti.</li>
	<li>Per ogni campione, versate 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciate in una provetta da 1,5 mL tappo a vite fornita nel kit. Tieni presente che per ogni tubo, RNA da fino a 109 celle può essere estratta in modo efficiente. Quindi, preparare il numero di provette necessarie per ciascun campione. Ad esempio, una cultura di S. cerevisiae di 100 mL (OD600≈ 0,8) può rendere circa 2 x 109 a 3 x 109 celle, che conduce fino a un totale di 2,7 x 109 a 4 x 109 celle in totale (dopo il picco-in un terzo della S. pombe cellule). In questo caso, fino a 3-4 provette di reazione per ogni campione/condizione/mutante/replica sarebbe necessaria.</li>
	<li>Per ogni 1 x 109 celle, aggiungere 480 µ l di tampone di lisi fornito con il kit, 48 µ l di 10% SDS e 480 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1, v/v/v).</li>
	<li>Mescolare le celle utilizzando un miscelatore vortex e trasferirli ai tubi contenenti le microsfere di zirconio ghiacciate.</li>
	<li>Ospitare i tubi su un adattatore per miscelatore vortex, girare il vortice alla massima velocità e battere per 10 min a lisare le cellule di lievito (in una camera a 4 ° C). In alternativa, eseguire la lisi delle cellule in un branello-frullino automatico.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 16.000 x g per 5 min a temperatura ambiente e raccogliere con cura la fase superiore (fase contenente RNA) di un tubo falcon fresco 15ml. In genere, il volume recuperato per ogni tubo è di circa 500 – 600 µ l.</li>
	<li>Per i tubi di 15 mL contenente il RNA parzialmente purificato, aggiungere il buffer di associazione fornito con il kit e mescolare accuratamente. Per ogni 100 µ l di soluzione di RNA, aggiungere 350 µ l di tampone di associazione (cioè, quando il volume della fase acquosa soluzione è 600 µ l, 2,1 mL di buffer di associazione deve essere aggiunto).</li>
	<li>Al composto precedente, aggiungere il 100% di etanolo e mescolare accuratamente. Per ogni 100 µ l di soluzione di RNA, aggiungere 235 µ l di etanolo al 100% (cioè, quando il volume della fase acquosa soluzione è 600 µ l, aggiungere 1,41 mL di etanolo).</li>
	<li>Applicare fino a 700 µ l della miscela dal passaggio 3.9 di una cartuccia di filtro montato in un tubo di raccolta, entrambi forniti con il kit.</li>
	<li>Centrifugare per 1 min a 16.000 x g. Se la durata di centrifugazione non era abbastanza per il volume totale di passare attraverso il filtro, ripetere la centrifugazione per 30 s.</li>
	<li>Scartare il flusso continuo e riutilizzare lo stesso tubo di raccolta. Aggiungere un altro 700 µ l di soluzione di RNA-binding buffer-etanolo al filtro e centrifugare nuovamente a 16.000 x g per 1 min.</li>
	<li>Scartare il flusso continuo e ripetere i passaggi 3.11 e 3.12 fino a quando la soluzione di RNA è finita.</li>
	<li>Lavare il filtro 2 x con 700 µ l di soluzione 1 di lavaggio. Raccogliere il lavaggio soluzione tramite centrifugazione a 16.000 x g per 1 min e tenere sempre il tubo di raccolta.</li>
	<li>Lavare il filtro 2 x con 500 µ l di soluzione 2 di lavaggio. Raccogliere il lavaggio soluzione tramite centrifugazione a 16.000 x g per 1 min e tenere sempre il tubo di raccolta.</li>
	<li>Centrifugare le provette ancora una volta a 16.000 x g per 1 min asciugare completamente il filtro.</li>
	<li>Trasferire la cartuccia filtrante nella provetta di raccolta finale (RNA-del caso tubo) ed eluire RNA con 50 µ l di DEPC-trattati, privo di RNasi H2O (preriscaldato a 100 ° C).</li>
	<li>Centrifugare per 1 min a 16.000 x g.</li>
	<li>Eluire RNA nuovamente (per lo stesso tubo) con 50 µ l di preriscaldato DEPC-trattati, privo di RNasi H2O. Assicurarsi che tutto il volume è passata attraverso il filtro; in caso contrario, centrifugare per periodi più lunghi.</li>
	<li>Se vengono utilizzati tubi multipli per un singolo campione, piscina li tutti in una provetta.</li>
	<li>Quantificare e controllare la purezza del campione utilizzando le attrezzature adeguate. Nota: Mentre 4tU solo è incorporato all'interno di nuova sintesi RNA, c'è una possibilità di minore contaminazione con il DNA. Per questo motivo, si consiglia sempre di trattare i campioni con dnasi I. Per questo, usare i reagenti forniti con il kit di estrazione di RNA (Tabella materiali) seguendo le raccomandazioni del produttore.</li>
</ol>4. specifiche del tiolo Biotinylation di nuova sintesi RNA
<ol><li>Regolare la concentrazione di RNA ottenuta con la sezione 3 del protocollo a 2 mg/mL. Aliquotare 200 µ g di RNA totale, riscaldare per 10 minuti a 60 ° C e immediatamente si chill sul ghiaccio per 2 min.</li>
	<li>
L'aliquota di RNA, aggiungere i reagenti di seguito indicati nel seguente ordine: 600 µ l di DEPC-trattati, RNAsi-libera H2O, 100 µ l di tampone di biotinilazione (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] e 10 mM EDTA, di DEPC-trattati, privo di RNasi H2O) e 200 µ l di biotina-HPDP da uno stock di 1mg/mL biotina-HPDP in DMSO o DMF.
	<ol>
<li>In alcune situazioni, la soluzione di biotina-HPDP tende a precipitare, probabilmente a causa della sua bassa solubilità in acqua. In questa situazione, aumentare il volume di DMSO/DMF fino al 40% del volume di reazione (per il campione di RNA, aggiungere 400 µ l di DEPC-trattati H2O, 100 µ l di tampone di biotinilazione e 400 µ l di biotina-HPDP da uno stock di 0,5 mg/mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare il campione a temperatura ambiente e al riparo dalla luce per 3 h, con agitazione delicata.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, aggiungere un volume circa uguale di cloroformio ai tubi e mescolare energicamente.</li>
	<li>Girare il campione a 13.000 x g per 5 min a 4 ° C. Questo passaggio permette la rimozione di biotina in eccesso che ha fatto non biotinylate il RNA. In alternativa, eseguire questo passaggio utilizzando tubi di aggancio di fase (pesante). Per questo, spin giù i tubi di aggancio di fase per 1 min a 13.000 x g, aggiungere la miscela di RNA e una pari quantità di cloroformio, mescolare vigorosamente e li Centrifugare a 13.000 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire con cautela la fase superiore in nuove provette 2 mL.</li>
	<li>Aggiungere un decimo del volume di 5 M di NaCl e mescolare il campione.</li>
	<li>Aggiungere un uguale volume di isopropanolo, mescolare accuratamente il campione e girarla a 13.000 x g per almeno 30 min, a 4 ° C.</li>
	<li>Con cautela, rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di etanolo di 75% ghiacciata.</li>
	<li>Spin a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il surnatante, rapido-rotazione del tubo e rimuovere la soluzione di etanolo rimanente. Assicurarsi che la pallina del RNA non secca.</li>
	<li>Sospendere il RNA in 100 µ l di DEPC-trattati, privo di RNasi H2O.</li>
</ol>5. la purificazione della frazione recentemente sintetizzata da RNA totale e senza etichetta utilizzando biglie magnetiche rivestite con streptavidina
<ol><li>il RNA biotinilato per 10 min a 65 ° C di calore e poi raffreddare i campioni su ghiaccio per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di biglie magnetiche rivestite con streptavidina biotinilati RNA (ad un volume finale di 200 µ l). In particolare, è consigliabile utilizzare le perline indicate nella Tabella materiali, dal momento che, dopo le conversazioni con altri laboratori, questi sembrava di essere più coerente e affidabile.</li>
	<li>Incubare il campione con lieve agitazione per 90 minuti, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare le colonne fornite con il kit (Tabella materiali) nel supporto magnetico.</li>
	<li>Aggiungere 900 µ l di tampone di lavaggio temperatura (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M di NaCl e 0,1% Tween 20, trattata DEPC, privo di RNasi H2O) per le colonne (pre-corsa ed equilibrare).</li>
	<li>Applicare perline/RNA miscela (200 µ l) per le colonne.</li>
	<li>Raccogliere il flusso continuo in provette da 1,5 mL e applicarlo nuovamente alla stessa colonna magnetica. Se necessario, tenere questo flusso continuo come esso rappresenta la frazione di RNA senza etichetta.</li>
	<li>Lavare le colonne 5 x con volumi crescenti di tampone di lavaggio (600, 700, 800, 900 e 1000 µ l).</li>
	<li>Eluire il RNA recentemente sintetizzato con 200 µ l di 0,1 M DTT.</li>
	<li>Eseguire una seconda eluizione, 3 minuti più tardi, con un volume uguale di 0,1 M DTT.</li>
	<li>Dopo l'eluizione del RNA, aggiungere 0,1 volumi di 3 M NaOAc (pH 5.2), 3 volumi di etanolo 100% ghiacciata e 2 µ l di glicogeno 20 mg/mL (RNA-grado) e lasciare il pernottamento precipitato di RNA, a-20 ° C.</li>
	<li>Recuperare il RNA mediante centrifugazione (13.000 x g per 10 min a 4 ° C) ed e risospendere in 15 µ l di DEPC-trattati, privo di RNasi H20. La proporzione di RNA totale con l'etichetta dovrebbe essere circa 2% - 4% (solitamente più verso l'estremità inferiore), rendering di circa 2,0 µ g di RNA di nuova sintesi. Questa quantità è sufficiente per fare diversi esperimenti di qPCR, nonché per le analisi di microarray/sequenziamento.</li>
</ol>6. RT-qPCR convalida delle diverse frazioni
<ol><li>Sintetizzare cDNA da 2 µ g di RNA totale o 10 µ l di RNA con etichettato utilizzando esameri casuali e la trascrittasi inversa di scelta, secondo le istruzioni del produttore (Tabella materiali).</li>
	<li>Amplificare il cDNA di qPCR in tempo reale utilizzando un protocollo standard (Tabella materiali). Nota: Tutti i campioni devono essere eseguiti in triplice copia da un minimo di due replicati biologici. Correggere tutti i valori non elaborati per l'espressione di S. pombe tubulina.</li>
</ol>7. ibridazione di Microarray
<ol><li>Ibridare campioni di RNA sui chip di microarray preferito secondo le istruzioni del produttore (per questo protocollo specifico, vedere Tabella materiali). Brevemente, preparare biotinilati cRNA obiettivi da 150 ng di RNA usando il Kit di amplificazione del RNA di Premier (Tabella materiali), secondo le istruzioni del produttore. Ibridare 4 mg di cRNAs frammentato per 16 h a 45 ° C e 60 rpm su chip di microarray.</li>
	<li>Lavare, macchia e la scansione i chip utilizzando lo scanner (Tabella materiali) e la stazione indicata. Estrarre i dati grezzi (file CEL intensità) dalle immagini acquisite utilizzando la console di comando (AGCC, versione 4.1.2).</li>
	<li>Elaborare ulteriormente i file CEL con versione software espressione Console 1.4.1 per calcolare sonda impostata l'intensità del segnale, utilizzando gli algoritmi basati su statistiche MAS 5.0 con le impostazioni predefinite e scala globale come metodo di normalizzazione. Nota: L'intensità di profilati target medio di ogni chip arbitrariamente è stato impostato su 100. Eseguire tutti gli esperimenti utilizzando almeno due replicati biologici indipendenti. Normalizzare i dati grezzi per il segnale di S. pombe e calcolare piega i cambiamenti nei livelli di RNA totali e recentemente sintetizzati.</li>
</ol>8. analisi dei dati utilizzando una tubazione esistente R
<ol><li>Calcolare la sintesi e il decadimento tariffe utilizzando una pipeline e R/Bioconductor pacchetto pubblicamente disponibile, come descritto in precedenza8,10.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mentre per analizzare i cambiamenti nella trascrizione del genoma strumenti ancora stanno migliorando, l'esclusiva analisi del trascrittoma attraverso la quantificazione dei livelli allo stato stazionario di RNA potrebbe non riflettere accuratamente le modifiche nell'attività di RNA polimerasi II. Infatti, i livelli di mRNA sono regolati non solo dalla sintesi di RNA, ma anche dalla loro maturazione e degradazione. Per misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione di mRNA, distinti protocolli sono stati svil...

Le cellule rispondono a stimoli endogeni ed esogeni, attraverso l'alterazione dinamica del loro programma di espressione genica. Negli ultimi anni, un enorme sviluppo di metodologie di genoma permette la descrizione precisa e completa delle modifiche del trascrittoma in condizioni diverse. Nella maggior parte degli studi di transcrittomica, sequenziamento di ibridazione o ad alta velocità di microarray vengono utilizzati per quantificare i livelli di RNA da una frazione di RNA totale allo steady-state. Modifiche trascrizionali sotto una perturbazione specifica possono visualizzare una vasta gamma di risultati possibili, con un ampio spettro di geni essere up - o downregulated o cambiamenti di espressione genica specifica. Espressione genica è il risultato di un equilibrio fine-tuned — o allo steady-state — tra sintesi di RNA da RNA polimerasi e altri processi che interessano i livelli del RNA. Trascrizione di RNA polimerasi II, tra cui le tre fasi distinte (iniziazione, allungamento e terminazione), è altamente e intrinsecamente connesso all'elaborazione mRNA, esportazione citoplasmico, traduzione e degradazione.
Parecchi studi recenti hanno dimostrato che il decadimento e la sintesi di mRNA sono accoppiati meccanismi e ha mostrato che trascrizionali effetti al momento della mutazione o sotto stimoli possono essere trascurati nel quantificare il RNA totale allo steady-state. In primo luogo, il rilevamento delle modifiche trascrizionale attraverso l'analisi dei livelli allo stato stazionario di mRNA sempre dipende dal mRNA Half-Life. Una volta che la perturbazione è stato introdotto, i livelli allo stato stazionario di mRNA con emivita lunga ne risentirà molto meno rispetto a quelli dei mRNAs con breve emivita. Di conseguenza, la rilevabilità dei cambiamenti nella sintesi del RNA è fortemente sbilanciata in favore di trascrizioni di breve durate, mentre l'analisi di specie più longevo di mRNA potrebbe non riuscire a rivelare i cambiamenti dinamici nel tasso di trascrizione. In secondo luogo, diversi studi hanno dimostrato che, sia nel lievito e mammiferi, cambiamenti globali nella trascrizione potrebbero essere trascurati quando si analizzano i livelli allo stato stazionario di mRNA. Ciò è probabilmente dovuto i meccanismi che collegano mRNA sintesi e degradazione conseguente mRNA buffering. Questo ha spinto lo sviluppo di nuovi protocolli per quantificare la sintesi di mRNA disinserita dal degrado, attraverso l'analisi del mRNA appena trascritto. Negli ultimi anni, sono state presentate diverse alternative, tra cui sequenziamento eseguire-sulle globale (GRO-seq)1e trascrizione di allungamento nativo sequenziamento (NET-seq)2,3. Qui, presentiamo un protocollo sviluppato inizialmente in cellule di mammifero4,5,6 e poi adattato al lievito7,8,9,10, 11, che si basa sul RNA etichettatura con un chitosani nucleosidici o base analogica, 4-thiouridine (4sU) o 4-tiouracile (4tU), rispettivamente.
Questo metodo in particolare purifica recentemente trascritto RNA dalle cellule nel quale RNA sono impulsi-etichettati con 4sU pressoché senza interferenze nell'omeostasi cellulare. Quindi, una volta che le cellule sono esposte alle 4sU, la molecola è rapidamente uptaken, fosforilato a 4sU-trifosfato e incorporata nel RNA viene trascritto. Una volta impulso-etichetta, è possibile estrarre RNA cellulare totale (corrispondenti ai livelli allo stato stazionario di RNA), e, successivamente, la frazione di RNA 4sU-labeled è tiolo-specificamente modificato, portando alla formazione di un legame disolfuro tra biotina e la recentemente trascritto RNA4,5. Tuttavia, 4sU può solo essere uptaken dalle cellule che esprimono un trasportatore nucleosidico, come il trasportatore umano dei nucleosidi (hENT1), impedendo l'uso immediato in lievito germogliante o fissione. Mentre si potrebbe esprimere hENT1 in S. pombe o S. cerevisiae, un approccio più semplice può essere raggiunto utilizzando la 4tU base modificate, poiché le cellule di lievito possono prendere 4tU, senza la necessità di espressione di un nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. infatti, il metabolismo di 4tU richiede l'attività dell'enzima uracile fosforibosiltransferasi (UPRT). In diversi organismi, tra cui il lievito ma non mammiferi, UPRT è essenziale per una via di salvataggio delle pirimidine, uracile a uridina monofosfato di riciclaggio.
Un bias importante negli studi di trascrittomica può essere introdotto tramite la normalizzazione tra diversi campioni analizzati in parallelo. Infatti, molti fattori di deviazione possono influenzare l'analisi comparativa del trascrittoma del mutante e del selvaggio-tipo ceppi: l'efficienza di lisi cellulare, differenze di estrazione e recupero di RNA e di variazioni nella calibrazione dello scanner per microarray analisi , tra gli altri. Come discusso in precedenza, tali variazioni possono essere particolarmente ingannevole quando si prevedono effetti globali sulla trascrizione del RNA polimerasi II. Un mezzo elegante da comparare con precisione i tassi di sintesi di mRNA tra diversi campioni è stato progettato utilizzando il lievito di fissione lontanamente correlate Schizosaccharomyces pombe come standard interno. Per questo, un numero fisso di etichettato S. pombe celle viene aggiunto ai campioni S. cerevisiae , cellule wild type o mutanti, prima della lisi cellulare e RNA estrazione10. Successivamente, RNA sia stazionario e recentemente sintetizzato da S. pombe e S. cerevisiae è quantificati mediante RT-qPCR o tramite l'uso di chip di microarray o sequenziamento ad alta velocità10. Combinando questi dati con la modellistica cinetica, assoluti tassi di sintesi di mRNA e di decadimento in lievito possono essere misurati.
Nel quadro di questo manoscritto, vi mostreremo come l'analisi di RNA trascritto recentemente permesso di rivelare un ruolo globale per i complessi di coactivator SAGA e TFIID nella trascrizione del RNA polimerasi II nel germogliamento lievito14,15, 16. D'importanza, gli studi passati quantificati i livelli di mRNA di stato stazionario in S. cerevisiae e suggerito che SAGA svolge una funzione predominante su un insieme limitato di geni di lievito che sono fortemente interessati dalle mutazioni nella SAGA, ma relativamente resistente agli TFIID le mutazioni17,18,19. Sorprendentemente, l'attività enzimatica di SAGA sono stati indicati per agire sul genoma intero trascritto, suggerendo un ruolo più ampio per questo co-attivatore di trascrizione del RNA polimerasi II. In diminuzione assunzione di II della polimerasi RNA in geni espressi in più è stata osservata dopo l'inattivazione della SAGA o TFIID, suggerendo che questi coattivatori lavorano insieme alla maggior parte dei geni. Quindi, la quantificazione degli mRNA appena trascritto ha rivelato che sono richiesti per la trascrizione di quasi tutti i geni di RNA polimerasi II14,15,16SAGA e TFIID. L'implementazione di meccanismi di compensazione emerge come un modo per le celle ad affrontare una globale diminuzione nella sintesi di mRNA che è tamponata da una simultanea diminuzione globale nella degradazione di mRNA. La SAGA aggiunge all'elenco di elementi che hanno un effetto globale sulla trascrizione del RNA polimerasi II, ad esempio RNA Pol II subunità10, il Mediatore coactivator complesso20, il generale trascrizione fattore TFIIH21,22 e indirettamente, elementi del mRNA degradazione macchine9,10,23. Tali eventi compensativi universalmente sono stati osservati nei mutanti di SAGA, contabilità per il modeste e limitate le modifiche nei livelli di mRNA di stazionario nonostante una diminuzione globale e severa nel mRNA sintesi14. Simili analisi sono state eseguite anche in un ceppo di eliminazione BRE1 , con conseguente perdita completa dell'istone H2B ubiquitinazione. Interessante, un molto più lieve ma costante globale effetto sulla trascrizione del RNA polimerasi II potrebbe essere rilevato in assenza di Bre1, che indica che etichettatura metabolica di RNA recentemente trascritto nel lievito può rilevare e quantificare una vasta gamma di cambiamenti in mRNA tassi di sintesi.

<table><tbody><tr><td>4-Thiouracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 440736</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Euromedex</td><td>Cat# SYN-1185</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contatore di cellule automatizzato</td><td>ThermoFisher</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione dell'RNA RiboPure, lievito</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM1926</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spettrofotometro</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Kit TURBO senza DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link HPDP Biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 21341</td><td></td></tr><tr><td>Tiolutin</td><td>Abcam</td><td>ab143556</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Kit di streptavidina MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat# 130-074-101</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittore Trascrittasi inversa</td><td>Roche</td><td>03 531 295 001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Genoma del lievito 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>900555</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0079</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Scanner 3000 7G</td><td>ThermoFisher</td><td>00-0210</td><td></td></tr></tbody></table>

saccharomyces cerevisiae metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mrna come proxy per attività di rna polimerasi ii

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Globali difetti nella trascrizione del RNA polimerasi II potrebbero essere trascurati dagli studi di trascrittomica analizzando RNA allo steady-state. Infatti, la diminuzione globale nella sintesi del mRNA è stata indicata per essere compensata da una diminuzione simultanea nella degradazione di mRNA per ripristinare i livelli normali di stato stazionario. Quindi, la quantificazione del genoma di sintesi di mRNA, indipendentemente dalla degradazione del mRNA, è il miglior riflesso diretto dell'attività trascrizionale di RNA polimerasi II. Discutiamo qui, un metodo che utilizza non perturbante metabolica etichettatura degli RNA nascente in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). In particolare, le cellule sono coltivate per 6 min con un uracile analogico, 4-tiouracile e il RNAs recentemente trascritto con etichettato è purificato e quantificato per determinare i tassi di sintesi di tutti i singoli mRNA. Inoltre, utilizzando etichettati Schizosaccharomyces pombe cellule come standard interno permette di confrontare la sintesi di mRNA in diversi S. cerevisiae ceppi. Usando questo protocollo e montaggio i dati con un modello cinetico dinamico, i corrispondenti tassi di decadimento di mRNA possono essere determinati.

Quando si esegue etichettatura metabolica di RNA appena trascritto, diversi aspetti devono essere controllati: il tempo e l'efficienza dell'etichettatura, la proporzione di spike-a, il protocollo di estrazione e l'efficacia di biotinilazione (compreso signal-to-noise ratio), tra gli altri. Queste condizioni sono stati ampiamente e metodicamente indicate da altri7,10,11. Qui ci concentriamo princi...

Il protocollo qui descritto si basa sulla quantificazione genoma di nuova sintesi mRNA purificato da cellule di lievito etichettate con 4-tiouracile. Questo metodo permette di misurare la sintesi di mRNA disinserita dalla degradazione del mRNA e, quindi, fornisce una misurazione accurata della trascrizione del RNA polimerasi II.

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Il principale vantaggio di questa tecnica è che riflette l'attività dell'RNA polimerasi II misurando l'mRNA appena sintetizzato che non sono influenzati dalla degradazione dell'RNA. Questo protocollo è stato originariamente descritto usando l'ibridazione microarray, ma può essere facilmente adottato per il sequenziamento ad alta velocità dell'mRNA appena trascritto. A dimostrare questa procedura sarà Tiago Baptista, ex studente laureato del nostro laboratorio.Dopo aver inoculato le cellule S.cerevisiae, coltivarle durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione costante a 150 giri/min. Il giorno dopo, misurare la densità ottica a 600 nanometri. Diluire la coltura in un OD600 di circa 0,1 in 100 millilitri di mezzo YPD.Far crescere le cellule fino a quando l'OD600 è di circa 0,8. Successivamente, misurare l'OD600 della cultura notturna di S.pombe. Diluire questa cultura in un OD600 di circa 0,1 millilitri su 500 di mezzo YAS e lasciarla crescere fino a quando l'OD600 è di circa 0,8.In primo luogo, preparare una nuova soluzione di due molari a quattro tiouracil. Mantenere la soluzione preparata a temperatura ambiente e protetta dalla luce. Aggiungere la soluzione a quattro tiouracil alle colture S.cerevisiae e S.pombe in modo che la concentrazione finale sia di cinque millimolari.Incubare le colture S.cerevisiae e S.pombe rispettivamente a 30 gradi Celsius e 32 gradi Celsius con agitazione costante per sei minuti. Dopo questo, rimuovere una piccola aliquota di ogni coltura e contare le cellule usando un contatore di cellule automatico o una camera Neubauer. Centrifuga a 2.500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti per raccogliere le cellule.Scartare il supernatante e lavare le cellule con ghiaccio freddo una volta il PBS. Centrifugare di nuovo a 2.500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, rimospend le cellule in cinque millilitri di ghiaccio freddo una volta il PBS.Mescolare le cellule S.cerevisiae e S.pombe con un rapporto di tre a uno. Centrifugare i campioni misti a 2.500 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Quindi rimuovere il PBS e congelare le cellule in azoto liquido.Conservare il campione a -80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. Quando è pronto per procedere, scongelare le cellule sul ghiaccio per circa 20-30 minuti. Utilizzare un kit di estrazione dell'RNA di lievito adattato per estrarre l'RNA come delineato nel protocollo di testo.Successivamente, trasferire la cartuccia del filtro nel tubo di raccolta finale. Elute l'RNA con 50 microlitri di acqua priva di RNasi trattata con DEPC che è stata preriscaldata a 100 gradi Celsius. Centrifuga a 16.000 volte g per un minuto.Quindi utilizzare 50 microlitri di acqua senza RNasi preriscaldata trattata con DEPC per eludere nuovamente l'RNA nello stesso tubo. Centrifuga a 16.000 volte g per un minuto assicurandosi che l'intero volume del campione sia passato attraverso il filtro. In caso di allora, centrifugare di nuovo per un periodo di tempo più lungo.Al termine, quantificare e controllare la purezza del campione utilizzando l'attrezzatura appropriata. Utilizzare acqua priva di nucleasi trattata con DEPC per regolare la concentrazione dell'RNA precedentemente acquisito a due milligrammi per millilitro. Aliquota 200 microgrammi di RNA totale e riscaldarlo a 60 gradi Celsius per 10 minuti.Raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio per due minuti. Aggiungere 600 microlitri di acqua priva di RNasi trattata con DEPC. Aggiungere 100 microlitri di tampone di biotinilazione e quindi aggiungere 200 microlitri di BIOTINA HPDP.Se la soluzione HPDP di biotina precipita fuori dalla soluzione, aumentare il volume di DMSO o DMF fino al 40% del volume di reazione come delineato nel protocollo di testo. Proteggere il campione dalla luce e incubarlo a temperatura ambiente con agitazione delicata per tre ore. Successivamente, aggiungere un volume approssimativamente uguale di cloroformio ai tubi e mescolare vigorosamente.Centrifuga a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, trasferire attentamente la fase superiore in nuovi due tubi millilitro. Aggiungere una quantità di cinque cloruri di sodio molare pari a circa 1/10 del volume del campione.Quindi mescolare il campione. In primo luogo, riscaldare l'RNA biotinilato a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi raffreddare i campioni sul ghiaccio per cinque minuti.Aggiungere 100 microlitri di perline magnetiche rivestite di Streptavidin all'RNA biotinilato. Incubare a temperatura ambiente con lievi scosse per 90 minuti. Posizionare le colonne fornite con il kit nel supporto magnetico.Quindi, aggiungere 900 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente alle colonne. Applicare la miscela di perline e RNA da 200 microliter sulle colonne. Raccogliere il flusso in tubi da 1,5 millilitri e quindi applicarlo nuovamente alla stessa colonna magnetica.Mantenere questo flusso, se necessario, in quanto rappresenta la frazione di RNA senza etichetta. Per iniziare la convalida RT-qPCR delle diverse frazioni, sintetizzare prima cDNA come delineato nel testo. Quindi amplificare il cDNA in tempo reale qPCR utilizzando un protocollo standard.I livelli misurati di trascrizioni nelle frazioni purificate da cellule di tipo selvatico coltivate con e senza quattro tiouracil hanno confermato che questa procedura purifica specificamente l'RNA etichettato. L'analisi del ceppo delta spt20 rivela che la quantità di RNA totale allo stato stazionario è in gran parte invariata o è solo leggermente ridotta per i geni testati. Risultati simili si vedono per i ceppi cancellati per bre1.Tuttavia, l'analisi dell'RNA appena trascritto nel ceppo delta spt20 rivela una diminuzione da tre a cinque volte della sintesi dell'mRNA per tutti i geni testati. Nel frattempo, la perdita di bre1 porta a una diminuzione più discreta ma ancora visibile. Dopo l'esaurimento indutbile di spt7, una subunità strutturale del complesso sagale, i livelli di mRNA appena trascritti sono ridotti in misura simile al ceppo di cancellazione.Quando i livelli totali di RNA sono misurati mediante analisi a livello genomico, si vede che solo pochi geni hanno i loro livelli di espressione alterati al momento della cancellazione di spt20 regolando o regolando verso il basso. Tuttavia, l'analisi dell'RNA appena trascritto rivela che i livelli di oltre 4.000 geni sono significativamente ridotti almeno due volte al momento della cancellazione di spt20 che suggerisce un effetto positivo globale della saga sulla trascrizione dell'RNA polimerasi II nei lieviti in erba. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, è stato applicato solo con lievi variazioni a Usando questo protocollo, abbiamo potuto rilevare una diminuzione globale della sintesi dell'mRNA che è stata compensata da una diminuzione globale della degradazione dell'mRNA.

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Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II (Video) | JoVE Journal

Saccharomyces cerevisiae Metabolica etichettatura con 4-tiouracile e la quantificazione di nuova sintesi mRNA come Proxy per attività di RNA polimerasi II

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