Name: Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri la magnetofezione di motoneuroni primari murini per modellare la malattia di Charcot-Marie-Tooth. Questo metodo consente di studiare meccanismi neurodegenerativi e funzioni geniche in vitro.

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Vorremmo ringraziare la "Association pour le développement de la neurogénétique" del Dr. Jacquier fellowship e AFM-Telethon per il suo sostegno attraverso il piano strategico MyoNeurAlp. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, che hanno partecipato a sviluppare e migliorare la tecnica e diffondere la loro conoscenza.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state accettate dal comitato etico dell'istituzione.
1. soluzione preparazione
<ol><li>Preparare 10 mL di 4% BSA dializzata nel mezzo di L-15.<ol>
<li>Sciogliere polvere di albumina di siero bovino al 4% (p/v) in 10 mL di terreno di L-15.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione a una cassetta di dialisi da 20 mL con un cut-off kDa 20. Dializzare contro 500 mL di terreno L-15 per 3 giorni sotto agitazione a 4 ° C. Cambiare il mezzo di L-15 ogni giorno.</li>
		<li>Filtrare la soluzione attraverso un 0,22 µm membrana e aliquota in provette da 15 mL. Conservare le provette a-20 ° C. Nota: Questo protocollo utilizza i seguenti riferimenti: non modificato crudo L-15 medio = medio L-15, acido L-15 medio = pH L-15 e terreno base L-15 = L-15 di bicarbonato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 200 mL di pH L-15.<ol>
<li>Regolare il pH del mezzo L-15: in primo luogo, riempire una spruzzetta con alcuni pezzi di ghiaccio secco. Iniettare il mezzo di L-15 gas (CO2) fino a quando il colore diventa arancione (~ pressioni pH 6.4 e ~ 40). Il pH può essere regolato anche con un misuratore di pH standard.</li>
		<li>Filtro di supporto con un 0,22 µm membrana e conservare a 4 ° C per un mese.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 100 mL di bicarbonato L-15.<ol>
<li>Aggiungere 2,5 mL di bicarbonato di sodio del 7% a 97,5 mL di terreno di L-15 e conservare a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare i supplementi IPCS (insulina Putrescin Conalbumin Selenite).<ol>
<li>Sciogliere 2,5 mg di insulina in 0,5 mL di 0.1 M HCl. Aggiungi 4,5 mL di acqua bidistillata.</li>
		<li>Sciogliere 8 mg di putrescina in 5 mL di tampone fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Sciogliere 100 mg del conalbumin in 10 mL di PBS.</li>
		<li>Sciogliere 1 mg di selenito di sodio in 19,3 mL d'acqua, regolare il pH a 7,4 e diluire la soluzione 10 volte.</li>
		<li>Unire 1 mL di soluzione di insulina, 1 mL di soluzione di putrescina, 1 mL di conalbumin e 0,1 mL di soluzione di selenito di sodio per ottenere 3,1 mL di soluzione di supplemento di IPC. Conservare la soluzione a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una soluzione di progesterone di 0,02 mM.<ol>
<li>Sciogliere 1 mg di progesterone in 1,6 mL di etanolo di 80%.</li>
		<li>Diluire la soluzione 100 volte in 100% etanolo e conservare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 100 mL di terreno completo di L-15.<ol>
<li>Aggiungere 1,8 mL di soluzione di D-glucosio (200 mg/mL) a 92 mL di pH L-15 per ottenere una concentrazione finale di 3,5 mg/mL di glucosio.</li>
		<li>Unire 1 mL di 100 x penicillina-streptomicina (10.000 U/mL), 2 mL di siero equino inattivati, 3,1 mL di miscela IPCS e 0,1 mL di soluzione di progesterone (2 x 10-5 M).</li>
		<li>Filtrare il mezzo su una membrana da 0,22 µm e conservarla a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 5 mL di soluzione gradiente di densità (concentrazione finale del 5,5%) per esperimento.<ol>
<li>µ L 476 del mezzo di gradienti di densità 60% commerciale a 4524 µ l di L-15 (se possibile, senza rosso fenolo per aumentare il contrasto visivo all'interfase; rapporto di diluizione di 1:10. 5).</li>
		<li>Conservare la soluzione a 4 ° C per 2 settimane o congelare a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 10 mL di terreno di coltura.<ol>
<li>Aggiungere 200 µ l di terreno di supplemento a 9,6 mL di mezzo di coltura cellulare del neurone.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di siero inattivato con calore cavallo (che tende a differenziare i precursori delle cellule gliali e opere contro proliferazione) a 25 µ l di glutamina e 10 µ l di 2-mercaptoetanolo.</li>
		<li>Filtrare i media attraverso un filtro da 0,22 µm.</li>
		<li>Aggiungere i seguenti fattori neurotrofici: fattore neurotrofico ciliare (CNTF) ad una concentrazione finale di 10 ng/mL e fattore neurotrophic derivato cervello (BDNF) e fattore neurotrophic derivato delle cellule gliali (GDNF) alle concentrazioni finali di 1 ng/mL.</li>
		<li>Conservare i supporti a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 50 mL di media di dissezione.<ol>
<li>Aggiungere mL 47,05 di HBSS 2,25 mL di glucosio (200 mg/mL). Aggiungere 700 µ l di 1 M HEPES pH 7,4. Conservare i supporti a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una soluzione PFA del 4%.<ol>
<li>Sciogliere 20 g di PFA in 500 mL di PBS.</li>
		<li>Sotto una cappa chimica, riscaldare la soluzione a 60 ° C e aggiungere qualche goccia di 1 M NaOH fino a quando la soluzione diventa chiara.</li>
		<li>Filtrare la soluzione attraverso un filtro di carta e regolare il pH a 7,2. Conservare a-20 ° C. Nota: In alternativa, altre soluzioni commerciali di PFA possono essere utilizzati e diluiti al 4% in PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire gli attrezzi di dissezione inclusi pinze, forbici e piatti in silicone con etanolo al 70% prima dell'uso e con sapone e acqua cristallina dopo l'uso.</li>
</ol>2. poly-ornitina/laminina (Po/L) piatto rivestimento
Nota: I volumi sono adattati al cappotto una piastra a 24 pozzetti.
<ol><li>Se necessario, è possibile mettere un vetrino coprioggetto sterili 12 mm nel pozzo.</li>
	<li>Rivestire i pozzetti con 500 µ l di 10 µ g/mL Poly-L-ornitina soluzione disciolti in acqua.</li>
	<li>Lasciare i pozzetti stabilirsi a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di poli-L-ornitina e asciugare all'aria per 30 min.</li>
	<li>Ricoprire i pozzi durante la notte a 37 ° C con 500 µ l di 3 µ g/mL laminina in bicarbonato di L-15. Nota: Pozzi possono essere memorizzati a 37 ° C per 7 giorni nell'incubatrice. Per lunghe incubazioni, aggiungendo PBS sterile tra i pozzetti può contribuire a evitare l'evaporazione media.</li>
</ol>3. dissezione
<ol><li>Sacrificare un mouse incinto quando gli embrioni sono in fase embrionale 12.5. Pulire la pancia con etanolo al 70%.</li>
	<li>Rimuovere il grembo tagliando due ovidotti e la vagina e metterlo in una capsula Petri riempito con PBS freddo (senza Ca2 + Mg2 +).</li>
	<li>Raccogliere tutti gli embrioni e trasferirli al fresco, PBS freddo (senza Ca2 + Mg2 +) in una capsula di Petri.</li>
	<li>Mettere un embrione in un piatto rivestito con silicone e completo di supporti di dissezione (con HBSS, glucosio di 4,5 g/L e 7 mM HEPES pH 7.4). Nota: La dissezione dell'embrione viene eseguita sotto un microscopio utilizzando forbici e pinzette pulite bene. In alternativa, una capsula di Petri regolari senza silicone può essere utilizzato per la dissezione.</li>
	<li>Rimuovere la testa, coda e visceri, usando il forcipe come forbici.</li>
	<li>Mantenere l'embrione con la pancia contro il silicone con una pinza.</li>
	<li>Con un secondo paio di pinze, inserire una punta nel canale centrale del midollo spinale rostrale.</li>
	<li>Chiudere il forcipe per strappare il tessuto dorsale pochi millimetri.</li>
	<li>Ripetere questa operazione verso il lato caudale fino a quando l'intero midollo spinale è aperto (Figura 1B).</li>
	<li>Staccare la parte rostrale del midollo spinale (tronco cerebrale) dal corpo.</li>
	<li>Girare l'embrione per mantenere la colonna vertebrale aperta contro il silicone.</li>
	<li>Pizzicare la parte rostrale del midollo spinale e tirare l'embrione dal capo per estrarre il midollo spinale. Nota: Meningi e gangli delle radici dorsali (DRG) devono rimanere collegati all'embrione. In caso contrario, attentamente tirare via qualsiasi residuo meninges e DRGs ancora attaccato al midollo spinale. A questo punto, DRGs potrebbero essere raccolti anche per la cultura di neuroni sensibili (vedi discussione).</li>
	<li>Appiattire il midollo spinale sul silicone e togliere la metà dorsale del midollo tagliando lungo il centro di ogni lato usando un bisturi. Tagliare la parte centrale in 10 pezzi usando un bisturi e trasferire i pezzi in una nuova provetta.</li>
</ol>4. sospensione di cellule di midollo spinale di
<ol><li>Ripetere questa procedura di dissezione per 6 a 8 midolli spinali.</li>
	<li>Lasciate che il midollo spinale pezzi raccolgono nella parte inferiore del tubo e sostituire l'HBSS con 1 mL di terreno di prosciutto-F10.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di tripsina (2,5% w/v; concentrazione finale 0.025%). Incubare la provetta per 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Per interrompere la digestione enzimatica, trasferire i frammenti di un nuovo tubo da 15 mL contenente 800 µ l di terreno completo di L-15, 100 µ l di 4% (p/v) BSA e 100 µ l di dnasi (1 mg/mL nel mezzo di L-15).</li>
	<li>Triturare due volte aspirando 1 mL utilizzando una pipetta P1000. Lasciare i frammenti di stabilirsi per 2 min. raccogliere il surnatante in una provetta di fresco da 15 mL.</li>
	<li>Per i frammenti, aggiungere 900 µ l di terreno completo di L-15, 100 µ l di 4% (p/v) BSA e 100 µ l di dnasi (1 mg/mL nel mezzo di L-15).</li>
	<li>Triturare 6 volte aspirando 1 mL utilizzando una pipetta P1000. Lasciare i frammenti di stabilirsi per 2 min Aggiungi il surnatante per il tubo da 15 mL ottenuto al passaggio 4.5.</li>
	<li>Per i frammenti, aggiungere 900 µ l di terreno completo di L-15, 100 µ l di 4% (p/v) BSA e 100 µ l di dnasi (1 mg/mL nel mezzo di L-15).</li>
	<li>Triturare 10 volte aspirando 1 mL utilizzando una pipetta P1000. Lasciare i frammenti di stabilirsi per 2 min Aggiungi il surnatante per il tubo da 15 mL ottenuto al passaggio 4.5. Procedere con il surnatante.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da P1000, posizionare delicatamente un cuscino di 2 mL BSA 4% (p/v) nella parte inferiore del tubo galleggiante. Centrifugare a 470 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 2 mL di terreno completo di L-15.</li>
</ol>5. MN arricchimento di gradiente di densità
<ol><li>Dividere la sospensione cellulare in due provette da 15 mL (1 mL ciascuno). Quindi, aggiungere 2 mL di terreno completo di L-15. Se a partire da 6 embrioni, è possibile utilizzare l'equivalente di 3 embrioni per tubo in 3 mL di terreno.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di soluzione di gradienti di densità aggiungendo lentamente la soluzione per il fondo di ciascuna provetta per ottenere un'interfaccia tagliente.</li>
	<li>Centrifugare a 830 x g per 15 min a temperatura ambiente. Dopo questo passaggio, piccole cellule dovrebbero essere nella parte inferiore del tubo, mentre grandi cellule come MNs dovrebbero essere nell'interfaccia di medio/soluzione gradienti di densità.</li>
	<li>Raccogliere le cellule a livello di interfaccia di aspirazione 1 o 2 mL e trasferirli in una provetta di fresco da 15 mL. Regolare il volume a 10 mL con il mezzo di pH L-15.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL del cuscino di BSA del 4% il fondo del tubo e la centrifuga a 470 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 3 mL di terreno completo di L-15.</li>
	<li>Ripetere il punto 5.5.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di coltura completa. Contare il numero di cell e attuabilità sotto un microscopio a contrasto di fase con un emocitometro. Nota: Per 6 midolli spinali, il numero delle cellule dovrebbe essere di circa 1 x 105 MNs.</li>
</ol>6. MN cultura
<ol><li>Diluire il MNs alla densità appropriata, solitamente 5.000 a 10.000 cellule in 500 µ l di terreno di coltura per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Nota: Densità di semina è intorno 30.000 e 1.500 cellule per 6 e 96 pozzetti, rispettivamente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di laminina con un P1000.</li>
	<li>Trasferire immediatamente il MNs diluito in terreno di coltura in piastre di rivestimento per evitare l'essiccazione.</li>
	<li>Incubare la cultura per 2 giorni a 37 ° C.</li>
</ol>7. Magnetofection di MNs
Nota: Nei passaggi seguenti, i quantitativi utilizzati sono pensati per la transfezione di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Fare riferimento al protocollo del produttore di un altro formato.
<ol><li>Per la preparazione di DNA, risospendere 1 µ g di DNA in 50 µ l di terreno di coltura neuronale e vortexare per 5 s.</li>
	<li>Per la preparazione di tubo del branello, risospendere 1,5 µ l di perline in 50 µ l di terreno di coltura neuronale.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di perlina di 50 µ l per la soluzione di DNA di 50 µ l e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (volume totale = 100 µ l).</li>
	<li>Durante questa incubazione, prelevare 100 µ l di terreno di coltura dal pozzo che sarà trasfettato. Nota: Mettere la piastra magnetica nell'incubatrice per riscaldarla a 37 ° C.</li>
	<li>Trasferire 100 µ l della miscela del DNA/tallone nel pozzetto e incubare la piastra 20 – 30 minuti sulla piastra magnetica a 37 ° C.</li>
	<li>Attendere almeno 24 ore prima del rilevamento di espressione di cDNA.</li>
</ol>8. fissazione e colorazione
<ol><li>Lavare la cultura 2 volte con PBS.</li>
	<li>Incubare la cultura per 20 min a temperatura ambiente in 4% PFA/PBS.</li>
	<li>Lavare la cultura 2 volte con PBS.</li>
	<li>Incubare la cultura in 500 µ l di tampone bloccante (PBS, 4% BSA, siero normale di 2%, 0,3% Triton X-100, glicina 0.1 M) per 1 h a temperatura ambiente. Nota: Normale del siero dovrebbe essere derivato dalla stessa specie come l'anticorpo secondario (ad esempio, del siero di capra normale).</li>
	<li>Incubare la coltura durante la notte a 4 ° C con l'anticorpo primario diluito in 250 µ l di tampone bloccante. Nota: ad esempio, TUJ1 viene utilizzato a 1/1000, SMI32 è usato a 1/1.000 e Lc3b viene utilizzato a 1/200.</li>
	<li>Lavare la cultura 3 volte con PBS.</li>
	<li>Incubare la cultura con gli anticorpi secondari coniugati a fluorophore diluiti in 250 µ l di tampone bloccante per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la cultura 3 volte con PBS.</li>
	<li>Montare sulle lastre di vetro utilizzando il mezzo di montaggio.</li>
</ol>

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<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, (2016).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+gene+delivery+into+mouse+dorsal+root+ganglia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).</li>
<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Uno dei punti critici di questo protocollo è che gli embrioni del mouse vengono sezionati in una finestra di tempo preciso durante lo sviluppo (12.5) per ottimizzare la quantità di MNs ottenuti alla fine. Inoltre, per una resa ottimale, la dissezione deve essere eseguita al mattino o nel primo pomeriggio. Prima 12.5 (ad es., a E11.5), la dissezione è difficile, soprattutto per quanto riguarda l'eliminazione delle meningi. Dopo 12.5, il numero di MNs ottenuti scende significativamente. Per controllare la fase emb...

Malattie neuromuscolari comprendono una varietà di patologie clinicamente e geneticamente distinte che si caratterizzano per l'alterazione del muscolo e/o il sistema nervoso. A causa dei progressi nelle tecnologie di sequenziamento, centinaia di geni responsabili di questi disordini rari è stati identificati durante l'ultimo decennio (elenco disponibile presso il centro di malattie neuromuscolari, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La varietà di mutazioni identificate indica che mutazioni differenti in un singolo gene possono causare diversi fenotipi e malattie1,2,3 e che mutazioni in geni differenti possono produrre fenotipi simili 4 , 5. in questo contesto, ci sono gli sforzi per sviluppare modelli cellulari che possono diventare potenti strumenti per analizzare le conseguenze di mutazione e meccanismi patologici.
MNs spinale hanno grande somas situato nelle corna ventrale del midollo spinale, gli assoni lunghi forma come target fibre muscolari scheletriche e consentire movimenti volontari attraverso il rilascio di acetilcolina alle giunzioni neuromuscolari. Poiché MNs sono colpiti da malattie neuromuscolari come la sclerosi laterale amiotrofica, la malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) e l'atrofia muscolare spinale, Dr. Henderson e colleghi ha sviluppato il primo protocollo n.6 che ha permesso per la coltivazione di in vitro spinale MNs e la scoperta di neurotrophic factor GDNF7 (fattore neurotrophic derivato delle cellule gliali). Raffinatezze tecniche da allora hanno consentito una più accurata purificazione di MNs spinale e relativi sottotipi usando FACS8, ma arricchimento mediante gradiente di densità rimane potente e ampiamente utilizzati nei laboratori attualmente lavorando con MNs spinale primaria 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. successivamente, è anche possibile ottenere un grado di purificazione MN superiore attraverso immunopanning, approfittando di superficie dell'indicatore p75(NTR)15,16,17.
Il midollo spinale contiene diversi sottotipi di MNs cervicale, toracica e lombare, nonché colonne motore mediani e laterali che differiscono tra loro posizione nel corno anteriore su un asse dorso-ventrale e tra i bersagli innervate8, 18. culture MN primario possono recuperare tutti questi sottotipi di MN in proporzioni fisiologiche. Il limite principale di questa tecnica è il basso numero di MNs ottenuti al termine della procedura; in realtà, ci si attende di ottenere circa 105 MNs da sei embrioni, che è adatto per la microscopia ma limitante per esperimenti di biochimica. Per eseguire esperimenti con più standardizzati sottotipi e MNs abbondanti (> 106 cellule), embrionale MNs derivati da cellule staminali dovrebbe essere considerato18.
Transfezione di selvaggio-tipo/mutante transgeni o atterramento geni endogeni nelle primarie MNs è uno strumento rapido e utile per decifrare le vie fisiopatologiche, soprattutto quando non sono disponibili modelli murini. Magnetofection è una tecnica per trasfezione neuroni primari, simili a lipofezione senza la neurotossicità correlata. Inoltre, la transfezione può essere eseguita su neuroni maturi dopo diversi giorni in vitro, a differenza di tecniche basate su elettroporazione9. Tuttavia, uno svantaggio di questa tecnica è che le perle si legano gli acidi nucleici nella cultura, causando rumore in DAPI etichettatura. Infezione virale è probabilmente la tecnica più efficiente per trasfezione MNs; Tuttavia, magnetofection non richiede determinate procedure di sicurezza necessarie per la produzione virale e infezione cellulare.

<table><tbody><tr><td>Materiale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piatto di dissezione in silicone</td><td>Sistemi viventi Strumentazione</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td>Vetrino coprioggetti rotondo Sylgard</td></tr><tr><td></td><td>NeuVitro, vetro Knittel</td><td>GG-12-Pre</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>Slide a Cassette</td><td>Lyzer ThermoFisher Scientific</td><td>66030</td><td>20.000 MWCO ; 30 mL</td></tr><tr><td>Unità filtro</td> Filtri per <td></td> siringhe sterili <td>Millipore</td> SCGVU02RE GP Millipore SLGP033RS <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastra a 4 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>167063</td><td>Nunclon Pinze per piastre trattate Delta</td></tr><tr><td></td><td>FST di Dumont</td><td>11252-20</td><td>#5 forbice</td></tr><tr>a<td>forbice</td><td>FST di Dumont</td><td>14060-10</td><td>bisturi a forbice fine</td></tr><tr><td></td><td>FST di Dumont</td><td>10035-20</td> bisturi <td>a lama curva</td></tr><tr><td></td><td>FST by Dumont</td><td>10316-14</td><td>bisturi a microcoltello</td></tr><tr><td>Piastra Petri</td><td>Greiner</td><td>663102</td><td>&oslash; x h = 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Tubo in polipropilene da 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>carta da filtro</td><td>Watman</td><td>1001125</td><td>circle, diapositiva in vetro diametro 125 mm</td></tr><tr><td></td><td>Lab-Tek</td><td>154526</td><td>4 camere</td></tr><tr><td>Plasmide pCAGEN</td><td>Addgene</td><td>#11160</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions and mediums</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415056</td><td></td></tr><tr><td>L-15 medium, senza fenolo rosso</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>putrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>conalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7786</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Poli-DL-Ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 2,5%, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza Ca Mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td>senza Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>bicarbonato di sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>Neuron terreno di coltura cellulare</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582901</td><td>Neurobasal Plus medium</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tampone 1 M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Grado di densità</td><td>medio Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep</td></tr><tr><td>integratore medio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A3582801</td><td>B-27 Plus</td></tr><tr><td>Siero di cavallo inattivato al calore</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10.000 U/mL</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immuno fluorescenza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>X0515</td><td>senza Mg2+ Ca2+</td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>siero di capra normale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Colina Acetil transferasi (CHAT)</td><td>Chemicon</td><td>Ab144P</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilamento H non fosforilato (SMI32)</td><td>Biolegends</td><td>SMI-32P</td><td>IF a 1/1000</td></tr><tr><td>Isola-1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td></td></tr><tr><td>Isola-2</td><td>DSHB</td><td>39.4D5</td><td></td></tr><tr><td>Hb9</td><td>DSHB</td><td>81.5C10</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di montaggio Vectashield</td><td>Vector Lab</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina Beta3 (clone Tuj1)</td><td>Biolegends</td><td>801201</td><td>IF a 1/1000</td></tr><tr><td>Lc3b</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2775</td><td>IF a 1/200</td></tr></tbody></table>

malattia di charcot-marie-tooth in vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del mouse

Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons

Neurodegenerazione dei motoneuroni spinali (MNs) è implicata in un ampio spettro di disturbi neurologici, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscolare spinale, che sono tutti associati ad atrofia muscolare. Colture primarie di MNs spinale sono stati utilizzati ampiamente per dimostrare il coinvolgimento di geni specifici in tali malattie e caratterizzare le conseguenze cellulari delle loro mutazioni. Questa cultura di modelli un MN primario del protocollo derivato dal lavoro seminale di Henderson e colleghi più di venti anni fa. In primo luogo, abbiamo un metodo di dissezione corni anteriori del midollo spinale da un embrione di topo e isolando il MNs da cellule utilizzando un gradiente di densità vicine in dettaglio. Quindi, vi presentiamo un nuovo modo di trasfezione in modo efficiente MNs con plasmidi di espressione utilizzando magnetofection. Infine, illustriamo come risolvere e immunostain primaria che MNS. utilizzando mutazioni di neurofilament che causano la malattia di Charcot-Marie-Tooth, tipo 2, questo protocollo dimostra un approccio qualitativo che esprimono le proteine di interesse e studiare il loro coinvolgimento nella Crescita di MN, la manutenzione e la sopravvivenza.

Dopo 24 ore nella cultura, motoneuroni (MNs) dovrebbero mostrare già significativa crescita assonale (almeno 6 volte supera rispetto alla dimensione di soma). Nei giorni seguenti, gli assoni dovrebbero continuare a crescere ed esposizione di ramificazione (Figura 2). Ci saranno diverse morfologie a causa della specificità del sottotipo. Ad esempio, colonna mediana MNs che innervano i muscoli assiali hanno assoni più brevi e più ramificati rispetto colonna lat...

L'obiettivo di questa tecnica è quello di preparare una cultura altamente arricchita dei motoneuroni primari (MNs) da murino del midollo spinale. Per valutare le conseguenze delle mutazioni che causano malattie MN, descriviamo qui l'isolamento di questi isolati MNs e loro transfezione di magnetofection.

Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse

Neurodegeneration of spinal motoneurons (MNs) is implicated in a large spectrum of neurological disorders including amyotrophic lateral sclerosis, ...

Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave in neurobiologia, come la polarità dei motoneuroni, la guida dell'assone, il traffico di assone e i meccanismi neurodegenerativi. Il principale vantaggio di questa tecnica è quello di ottenere una cultura del motoneurone altamente arricchita mentre prendiamo per esprimere la nostra proteina knockdown per affetto minuto. Per iniziare questa procedura, mettere un embrione in un piatto di mezzi di dissezione codificati con silicio.Al microscopio, tenere l'embrione con l'addome contro il silicio con le forcep. Con la seconda coppia di forcep, inserire una delle punte nel canale centrale del midollo spinale rostrad. Quindi, chiudere le forcep per strappare leggermente il tessuto dorsale.Ripetere questa operazione verso il lato connell fino all'apertura dell'intero midollo spinale. Quindi, posizionare l'embrione in modo che il midollo spinale aperto sia contro il silicio. Successivamente, staccare la parte rostrad del midollo spinale dal corpo.Pizzicare la parte rostrad del midollo spinale e tirare l'embrione dalla testa per estrarre il midollo spinale. Allontanare con cura tutte le meningi e le DRAG rimanenti ancora attaccate al midollo spinale. Appiattire il midollo spinale sul silicio e usando un bisturi, rimuovere la metà dorsale del cordone tagliando lungo il centro di ciascun lato.Tagliare la parte centrale in dieci pezzi e trasferirli in un nuovo tubo. Per preparare la sospensione cellulare del midollo spinale, raccogliere i pezzi del midollo spinale nella parte inferiore del tubo. Sostituire HBSS con un millilitro di prosciutto F-10 medio e aggiungere dieci microlitri di tripina.Incubare il tubo per dieci minuti a 37 gradi Celsius. Per interrompere la digestione enzimatica, trasferire i frammenti in un nuovo tubo da 15 millilitri, contenente 800 microlitri di mezzo L-15 completo, 100 microlitri di 4%BSA e 100 microlitri di DNA e titolazione, due volte. Lasciare che i frammenti si sistemino per due minuti prima di raccogliere il supernatante in un tubo fresco da 15 millilitri.Aggiungere delicatamente due millilitri di 4%BSA nella parte inferiore del tubo supernatante. Centro fusibile a 470 x gravità per 5 minuti. Dopo 5 minuti, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet cellulare con 2 millilitri di mezzo L-15 completo.Per l'arricchimento del motoneurone, dividere la sospensione cellulare in due tubi da 15 millilitri. Quindi, aggiungere due millilitri di mezzo L-15 PH a ciascun tubo. Se si inizia con sei embrioni, utilizzare l'equivalente di tre embrioni per tubo e tre millilitri di mezzo.Aggiungere lentamente 2 millilitri di soluzione di grado di densità, sul fondo di ogni tubo per ottenere un'interfaccia nitida. Successivamente, centro fonderlo a 830 x gravità per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo questo passaggio, le piccole cellule dovrebbero essere nella parte inferiore del tubo, mentre le cellule di grandi dimensioni, come il motoneurone, dovrebbero essere alla soluzione gradiente di densità / interfaccia media.Asperae da 1 a 2 millilitri delle cellule all'interfaccia e trasferirle in un tubo fresco da 15 millilitri. Regolare il volume a dieci millilitri con mezzo L-15 PH. Successivamente, aggiungere due millilitri del cuscino 4%BSA sul fondo dei due tubi.E fusibile centro a 470 x gravità per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo 5 minuti, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet e 3 millilitri di mezzo L-15 completo. Ripetere il centrifugato a 470 x gravità per 5 minuti a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pallet cellulare e due millilitri di mezzo di coltura completo. Per coltura dei motoneuroni, diluirli a 5.000-10.000 cellule in 500 microlitri di mezzo di coltura per pozzo in una piastra di 24 pozzi. Quindi, rimuovere la soluzione di lamina con a punta di pipetta P-1,000.Trasferire immediatamente i motoneuroni diluiti nel mezzo di coltura. alle piastre di codifica per evitare l'asciugatura. Per preparare il DNA, sospendere di nuovo 1 microgrammo di DNA in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale.E vortice per 5 secondi. Per preparare il tubo B, sospendere di nuovo 1,5 microlitri di perline in 50 microlitri di terreno di coltura neuronale. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di perline a 50 microlitri di soluzione di DNA e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.Durante questa incubazione, prelevare 100 microlitri di mezzo di coltura dal pozzo che verrà trasfetto. Successivamente, trasferire 100 microlitri del mix di perline di DNA ad ogni pozzo. E incubare la piastra di 24 pozzi, 20-30 minuti sulla piastra magnetica a 37 gradi Celsius.Qui è mostrata la morfologia dei neuroni moderna rivelata dalla posizione della catena pesante di neurofilamento non fosforilato endogeno dopo quattro giorni di coltura. In queste immagini, mostra la morfologia dei neuroni modem dopo quattro giorni in vitro e trasfettato per il gene trans EGFP per magnetofezione al secondo giorno. I neuroni motto erano contro-macchiati con il marcatore SMI-32 o il marcatore pan-neuro TUJ-1 e le frecce indicano il soma dei neuroni.Queste sono le loro immagini confocali di motoneuroni magneto influenzati, che esprimono costrutti NEFH di tipo selvaggio o mutante EGFP e macchiati per il loro marcatore autofagico LC-3B. Le frecce mostrano gli aggregati proteici mutanti EGFP NEFH che sono anche positivi all'LC-3B Seguendo questa procedura, montoholda curcha può essere analizzato mediante microscopia video per visualizzare il traffico di axon e aggiungere alcune linee guida. Dopo il suo sviluppo iniziale per affrontare questioni fondamentali in biologia neurale, questa tecnica si rivela anche un potente strumento per esplorare i meccanismi fisiopatologici che coinvolgono lo spettro dei disturbi del motoneurone, come la malattia da sindrome da shock tossico, la sclerosi laterale trofica samuele o l'atrofia muscolare spinale.

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Gli astrociti fenotipicamente wild-type e le cellule staminali neurali raccolte da topi ingegnerizzati con alleli oncogenici condizionali e trasformati tramite ricombinazione virale Cre-mediata possono essere utilizzati per modellare la patogenesi dell'astrocitoma in vitro e in vivo mediante iniezione ortotopica di cellule trasformate in cervelli di compagni di cucciolata singenici e immunocompetenti.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi In Vitro E In Vivo Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

In questo protocollo, vi presentiamo le procedure nella creazione di modelli miotonici mioblasti distrofia 1, tra cui ottimizzato manutenzione C2C12 cellule, geni trasfezione / trasduzione, e la differenziazione dei miociti.

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Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

La misura della conduzione del nervo è un utile strumento per valutare i modelli murini di neurodegenerazione ma è frequentemente applicata solo per stimolare il nervo sciatico nelle zampe posteriori. Qui, descriviamo una tecnica per misurare muscolare composto (CMAP) del potenziale di azione in vivo nei mouse forelimb muscoli innervati dal plesso brachiale.

In Vivo Elettrofisiologici misurazione del potenziale di azione muscolare composto da arti anteriori in modelli murini di degenerazione del motoneurone

Questo protocollo consente la conversione rapida ed efficiente delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni motori con un'identità spinale o cranica, mediante l'espressione ectopica dei fattori di trascrizione dai vettori inducibili piggyBac.

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

Questo lavoro presenta un protocollo per produrre colture cellulari omogenee dei motoneuroni primari oculomotori, trocleari e spinali. Queste colture possono essere utilizzate per analisi comparative delle caratteristiche morfologiche, cellulari, molecolari ed elettrofisiologiche dei motoneuroni oculari e spinali.

Isolamento e coltura di Oculomotor, Trochlear, e MotoNeuroni Spinali da Prenatal Islmn:GFP Topi Transgenici

Qui forniamo un protocollo per generare NMJ in vitro da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). Questo metodo può indurre NMJ con morfologia e funzione mature in 1 mese in un unico pozzo. Gli NMJ risultanti potrebbero potenzialmente essere utilizzati per modellare malattie correlate, per studiare meccanismi patologici o per migliorare i composti farmacologici per la terapia.

Giunzione neuromuscolare in vitro indotta da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Descriviamo un metodo per generare unità motorie umane in dispositivi microfluidici disponibili in commercio co-coltivando motoneuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane con miotubi primari derivati da mesoangioblasti umani con conseguente formazione di giunzioni neuromuscolari funzionalmente attive.

Generazione di unità motorie umane con giunzioni neuromuscolari funzionali in dispositivi microfluidici

Descriviamo un sistema di imaging riproducibile, automatizzato e imparziale per caratterizzare la funzione di giunzione neuromuscolare utilizzando tessuto muscolare scheletrico ingegnerizzato umano e motoneuroni optogenetici. Questo sistema consente la quantificazione funzionale della connettività neuromuscolare nel tempo e rileva una diminuzione della funzione neuromuscolare causata da neurotossine e miastenia grave del siero del paziente.

Ingegnerizzazione e caratterizzazione di un modello optogenetico della giunzione neuromuscolare umana

L'utilizzo di un modello tumorale autoctono immunocompetente guidato da mutazioni comuni dei pazienti per i test preclinici è fondamentale per i test immunoterapici. Questo protocollo descrive un metodo per generare modelli murini di tumore cerebrale utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le mutazioni comuni dei pazienti, fornendo così un modello murino accurato, riproducibile e coerente.

Modellazione di tumori cerebrali in vivo utilizzando la somministrazione basata sull'elettroporazione di DNA plasmidico che rappresenta le firme di mutazione del paziente

Scopri la magnetofezione di motoneuroni primari murini per modellare la malattia di Charcot-Marie-Tooth. Questo metodo consente di studiare meccanismi neurodegenerativi e funzioni geniche in vitro.

Malattia di Charcot-Marie-Tooth In Vitro di modellazione di trasfezione motoneuroni primari del Mouse

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