Name: Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Scopri un metodo semi-automatizzato per produrre epatociti da cellule staminali pluripotenti umane in piastre da 96 pozzetti. Questa tecnica rapida e standardizzata supporta la modellazione di malattie epatiche e lo screening farmacologico.

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Questo lavoro è stato supportato con premi da parte del Chief Scientist Office (TCS/16/37) e una borsa di studio di dottorato di MRC.

1. cellule staminali pluripotenti (hPSCs) in 96 ben piastre per Hepatocyte differenziazione di semina
Nota: I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo è stato elencati nella tabella 1. I supporti utilizzati per questo esperimento devono essere sterile e a temperatura ambiente per la coltura cellulare. Se non diversamente specificato, tutti i volumi di soluzione di reagente, descritti in questa parte del protocollo si basano su un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
<ol><li>
Preparare laminin verniciato a 96 pozzetti.
	<ol>
<li>Scongelare una fiala di laminina ricombinante 521 (100 µ g/mL) (LN-521) per 2 h per una notte a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 5 µ g/mL diluendo LN-521 ghiacciata 1 x soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) (con Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Utilizzare un liquido automatico movimentazione erogatore con un tubo standard cassetta di erogazione per aggiungere 50 µ l della soluzione LN-521 per pozzetto di una piastra ben 96. Nota: Tutto il volume dispensa vengono eseguite con un dispenser automatico dei liquidi con un tubo standard cassetta di erogazione, se non diversamente specificato. Privilegiata la soluzione fino a quando raggiunge la fine erogazione della cassetta, quindi procedere per erogare. Più di 96 pozzetti possono essere preparati nello stesso esperimento ripetendo la procedura tante volte quanto necessario.</li>
		<li>Incubare le piastre rivestite con LN521 a 37 °C/5% CO2 per 2-4 h. Nota: Piastre rivestite con LN521 possono essere conservati fino a due settimane a 4 ° C. Tenere le piastre sigillate su una superficie piana per evitare l'evaporazione e contaminazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scaldare il numero richiesto di prepatinato piastre a 37 ° C per 30 min a 1 h.</li>
	<li>Aspirare la soluzione di LN-521 restante della superficie verniciata utilizzando un adattatore di aspirazione 8 canali. Nota: È fondamentale per evitare il contatto con la superficie rivestita per evitare il degrado del rivestimento.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 50 µ l di mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM Rho-collegata della chinasi (ROCK) Y27632 e mantenere la piastra nell'incubatore fino semina a 37 °C/5% CO2cellulare. Nota: Non lasciare asciugare i pozzetti rivestite con laminina.</li>
	<li>
Preparare una sospensione di cellule di 3 x 105 cellule/mL in mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM ROCK Y27632. Nota: La densità di semina per ogni linea cellulare richiedono ottimizzazione.<ol>
<li>Aspirare il mezzo da una capsula di Petri con una cultura indifferenziata di hPSCs a circa 75% a 85% confluency coltivati su LN-521 come precedentemente descritto12. Nota: hPSCs sono coltivate su LN-521 in mTSER1 con il mezzo cambiato ogni 24 h e attraversate regolarmente una volta che le cellule raggiungono l'80% dei confluency come descritto in precedenza12.</li>
		<li>Lavare le cellule con 5 mL di temperatura 1 x DPBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e aspirare il buffer.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di 1x delicato reagente di dissociazione delle cellule alle cellule e incubare a 37 ° C per 6-8 min per dissociazione delle cellule. Nota: Per interrompere la reazione, esaminare il distacco delle cellule dalla matrice sotto il microscopio. Le cellule dovrebbero essere parzialmente disconnesso dalla piastra. In caso contrario, estendere l'incubazione per un min di 1 o 2 extra.</li>
		<li>Terminare la reazione aspirando il reagente delicata delle cellule dissociazione e aggiungere 5 mL di mTeSR1 fresco supplementato con inibitore di ROCK Y27632 di 10 µM per le cellule. Usare un raschietto di cella per sollevare le cellule dalla matrice e pipetta su e giù utilizzando una punta di P1000 più volte per mescolare.</li>
		<li>Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro basato su macchiatura metodo di esclusione del blu di Trypan e preparare la sospensione cellulare con concentrazioni necessarie.</li>
		<li>Pipettare il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL o 50 mL sterile e rallentare le cellule mediante centrifugazione li a 115 x g per 5 min a temperatura ambiente. Nota: Per un 96 ben piatto, 5 mL di mezzo di mTeSR1 che contiene 3 x 105 cellule/mL è necessaria per la linea cellulare H9.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e Risospendere delicatamente il cellulare fino ad ottenuta una soluzione omogenea a 37 ° C in mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM ROCK Y27632. Nota: L'uso dell'inibitore di roccia è consigliato come migliora la sopravvivenza post ri-placcatura delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l della sospensione delle cellule sulla piastra ben 96 contenente 50 µ l di mTeSR1 con inibitore di 10 µM ROCK Y27632.</li>
	<li>Dopo la semina, riporre le piastre nell'incubatore di cella a 37 °C/5% CO2 per 24 h permettere alle cellule di allegare.</li>
	<li>Esaminare le cellule il giorno successivo e prelevare inibitore di roccia, una volta stabilito il contatto cellula-cellula. Al 40% confluency, passare a mezzo di differenziazione (Figura 1B). Nota: Se confluency di cella è superiore al 40%, le piastre non sono adatte per la differenziazione di HLC con la linea cellulare H9.</li>
</ol>2. differenziazione hPSCs per Hepatocyte-come le cellule su laminine ricombinante in 96 ben piastre
<ol><li>
Preparare la differenziazione crescita media e fattori.
	<ol>
<li>Preparare soluzione stock di activina A umana (100 µ g/mL) di dissoluzione umana activina A polvere in sterile 0,2% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare 1:1, 000.</li>
		<li>Preparare soluzione stock mouse Wnt3a (10 µ g/mL) di dissoluzione del mouse Wnt3a polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare a 1: 200.</li>
		<li>Preparare soluzione di riserva (HGF) di fattore di crescita dell'epatocita umano (10 µ g/mL) di dissoluzione umana HGF polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare a 1: 1000.</li>
		<li>Preparare soluzione stock Oncostatin M (OSM) (20 µ g/mL) sciogliendo la polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare 1:1, 000.</li>
		<li>Endoderma definitivo: preparare mezzo di differenziazione endoderma, che consiste di 2% B27 supplemento (50 x, senza insulina), 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali: 100 UI/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto al Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) medio basale. Conservare a 4 ° C e consumare entro due settimane. Ad ogni cambio medio, integrare il volume richiesto con activina A e Wnt3a alla concentrazione finale di 100 ng/mL e 50 ng/mL, rispettivamente.</li>
		<li>Hepatoblast differenziazione: preparare mezzo di differenziazione hepatoblast, costituito da sostituzione di 20% ad eliminazione diretta del siero (KSR), 0,5% alternativa supplemento di L-Glutammina, 1% non essenziali aminoacidi (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoetanolo, 1% DMSO e 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto a knockout DMEM (KO-DMEM). Filtrare sotto vuoto e conservare a 4 ° C. Utilizzare entro due settimane.</li>
		<li>Differenziazione dell'epatocita: preparare mezzo di differenziazione dell'epatocita, costituito da 1% un'alternativa supplemento di L-Glutammina, sale di 10 µM idrocortisone 21-emisuccinato sodico (HCC), 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto al medium HepatoZYME. Conservare il brodo a 4 ° C e utilizzare entro due settimane. Per ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con HGF e OSM (concentrazioni finali a 10 ng/mL e 20 ng/mL, rispettivamente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24h post semina, con attenzione rimuovere il mezzo utilizzando un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili e aggiungere 100 µ l di fresco endoderma-adescamento supplementato con 100 ng/mL activina A e 50 ng/mL Wnt3a. Nota: Il processo di differenziazione inizia una volta che è stato aggiunto il supporto di endoderma definitivo. Una volta semina delle cellule è ottimizzato, la differenziazione cellulare viene avviata normalmente entro 24 ore. Tutte le medie, le modifiche vengono eseguite rimuovendo il mezzo con un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili e 100 µ l di terreno fresco utilizzando un dispenser automatico dei liquidi con uno standard di erogazione tubo erogazione cassetta a meno che non altrimenti specificato. Con una testa, con 300 µ l punte 96 è stato utilizzato un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili. In breve, 90 µ l sono stati aspirati dal bene evitando qualsiasi contatto con le cellule, ed è importante non asciugare le cellule durante il cambiamento medio per ridurre lo stress cellulare.</li>
	<li>Per cellule staminali embrionali umane (hESC), cambiare il mezzo di differenziazione endoderma ogni giorno per tre giorni. Se la differenziazione viene eseguita per le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs), è possibile estendere la fase di endoderma definitivo 2 giorni extra utilizzando activina A solo.</li>
	<li>Dopo induzione endoderma definitivo, passare al mezzo di KSR/DMSO per hepatoblast specifica e modificare il mezzo ogni 2 giorni per 5 giorni. Nota: Se ci sono un numero di cellule non iscritti nel pozzo, utilizzare non integrati KO-DMEM per lavare le cellule una volta prima del prossimo cambio medio. A causa della durata della seconda fase del protocollo (5 giorni), ci saranno 3 cambi medi con l'ultimo l'ultimo giorno della specifica hepatoblast.</li>
	<li>In seguito la differenziazione hepatoblast, passare a HepatoZYME mezzo per maturazione dell'epatocita. Lavare le cellule una volta con HepatoZYME senza il supplemento dopo aver tolto di mezzo KSR/DMSO e aggiungere 100 µ l di terreno di maturazione HepatoZYME completato con HGF 10 ng/mL e 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Modificare il mezzo ogni 48 h per 7-10 giorni. Al giorno 18 della differenziazione, caratterizzano HLCs analizzando l'espressione genica e l'attività metabolica CYP P450.</li>
</ol>3. caratterizzazione del Hepatocyte-come cellule differenziate su ricombinante laminine
<ol><li>Rilevare l'espressione di marcatori specifici dell'epatocita e di polarizzazione usando immunostaining.</li>
	<li>Testare la funzione metabolica degli epatociti, facendo uso delle analisi di CYP P450 come descritto prima delle12.</li>
	<li>Determinare la variazione di piastra, contando il numero totale di cellule per pozzetto per piastra.</li>
</ol>4. high Throughput immunocitochimica e acquisizione di immagini
<ol><li>Il giorno 18 di differenziazione, lavare i pozzetti tre volte con 1 x DPBS, difficoltà il HLCs erogazione 50 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 15-30 min. Dopo la fissazione, lavare tre volte con PBST (0.1% tween) (senza Ca2 +/Mg2 +) utilizzando un lavatore automatico del piatto. Nota: Tutti i lavaggi in questa sezione vengono eseguite utilizzando un lavatore automatico del piatto, se non diversamente specificato. Tutti i lavaggi sono fatta seguendo lo stesso protocollo.</li>
	<li>Permeabilize la membrana di erogazione 100 µ l di PBST (senza Ca2 +/Mg2 +) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire il blocco della proteina di erogazione 100 µ l di 10% BSA in PBST e incubare per 1 h in agitazione delicata utilizzando un agitatore per piastre. Dopo proteina bloccando, aggiungere 50 µ l di 1% BSA in PBST contenente gli anticorpi primari, incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata utilizzando un agitatore per piastre. Nota: Non lavare tra aggiunta di blocco e l'anticorpo di proteina.</li>
	<li>Dopo 24 h, lavare tre volte con 1 x DPBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e aggiungere l'anticorpo secondario di erogazione 50 µ l di 1% BSA in PBST. Incubare 1h a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Dopo l'incubazione anticorpo secondario, lavare 3 volte con 1 x DPBS. Aggiungere 50 µ l di DPBS con DAPI (10 µ g/mL) e incubare per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Infine, lavare 3 volte con DPBS e lasciare 100 µ l di 1 x DPBS nel pozzo. Le piastre sono pronte per l'imaging. Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C al buio fino a formazione immagine.</li>
	<li>La piastra di immagine utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto e acquisire diversi campi attraverso il pozzo per ottenere una buona rappresentazione del pozzo. Quantificare l'espressione dei diversi marcatori nel HLCs utilizzando software di Columbus (Imaging ad alto contenuto di software di sistema di analisi). Nota: Columbus è un software di analisi dei contenuti ad alta, che offre analisi di segmentazione di cellule per fenotipizzazione delle cellule. Risultati simili possono essere raggiunti utilizzando CellProfiler, un software open-source per l'analisi quantitativa di immagini biologiche22.</li>
</ol>

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</ol>

Prof. ssa David C. Hay è un co-fondatore e direttore di Stemnovate Limited.
Prof. ssa David C. Hay è un direttore di HigherSteaks Limited.

La nostra procedura semiautomatica è efficiente, affidabile ed economico, permettendo la produzione di HLCs a scala (Figura 1). Non c'era alcuna differenza significativa in termini di numero di cellule tra i pozzetti della piastra, rendendo questa piattaforma un approccio adatto per lo screening basati su cellule (Figura 2). Inoltre, il flusso di lavoro semi-automazione consente all'utente di produrre un numero elevato di piastre in una sola volta, che non era possibile prima utilizzando processi manuali5,12.
D'importanza, il processo di automazione non ha impatto sui rendimenti di differenziazione, con la maggior parte delle cellule che esprimono HNF4α (89,2% ± 2) e ALB (92,8% ± 6) (Figura 3). HLCs inoltre espresso enzimi CYP P450 CYP2D6 e CYP3A4 e visualizzato CYP1A2 e CYP3A attività metabolica paragonabile ai precedenti esperimenti segnalati (Figura 3)5. Nonostante la standardizzazione del protocollo, confluency di cella prima la differenziazione è fondamentale per il differenziamento di HLC puro. Di conseguenza, garantendo una distribuzione delle cellule buona attraverso il ben è una considerazione importante (Figura 1). Questo ha dimostrato di essere la linea cellulare dipendente, pertanto è richiesto per ogni prima della linea cellulare scalabilità ottimizzazione di semina e la densità delle cellule.
Nella sua forma attuale, questa piattaforma non è adatta per produrre grandi quantità di HLCs per applicazioni cliniche, e questo molto probabilmente sarà raggiunto attraverso l'uso di bioreattori e fabbriche di cella. Tuttavia, la metodologia sviluppata consente la rapida generazione di cellule di fegato umane per modellazione di malattia, lo screening di stupefacenti e/o droga repurposing studi. Inoltre, il dosaggio è suscettibile di multiplexing, permettendo la generazione di DataSet multiparametrico per analisi meccanicistica. Andando avanti, anche noi crediamo che questa tecnologia potrebbe essere applicata a sistemi più complessi in vitro quali la differenziazione 3D o come una piattaforma per migliorare HLC fenotipo in vitro.
In conclusione, crediamo che il nostro sistema semi-automatizzato e semplice aumentare la velocità effettiva sperimentale e ridurre la variazione sperimentale, migliorando così la qualità del set di dati biologici e loro estrapolazione verso la fisiologia umana.

Epatociti umani primari (PHHs) rappresentano lo standard corrente per la ricerca biomedica del fegato. Malgrado i loro vantaggi, PHHs rappresentano una fonte limitata di epatociti maturi con fenotipo instabile1. Cellule staminali embrionali (ESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC) sono stati proposti come una potente risorsa per la ricerca biomedica, promettendo una fonte rinnovabile di tessuto umano, tra cui fegato2,3,4 . Attuali procedure di differenziazione dell'epatocita generano cellule che esprimono i marcatori dell'epatocita, geni e funzioni simili a PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Più recentemente, l'uso di materiali definiti e matrici quali ricombinante laminine, ha migliore delle cellule fenotipo e riproducibilità sperimentale5,12,13,14.
Tecniche di coltura cellulare tradizionale si basano molto il pipettaggio manuale, che è molto tempo e soggetto a errori. Questo limita la velocità effettiva del dosaggio e il formato del piatto si può lavorare con. Fino ad oggi, la maggior parte degli studi che descrive la generazione di HLCs sono lavoro intensivo in natura e di conseguenza piccola scala nelle dimensioni15,16,17.
Corrente i progressi nella gestione dei liquidi e sistemi di pipettaggio, in combinazione con microscopia automatizzata e analizzatori di laboratorio, hanno permesso di sviluppare procedure che ridurre al minimo la necessità di intervento umano. Abbiamo approfittato di queste tecnologie e sviluppato un sistema di differenziazione semi-automatico con cui generare grandi quantità di tessuto epatico umano per basic e ricerca biomedica applicata. Questo approccio può essere eseguito con linee di iPSC con piccoli aggiustamenti necessari, a seconda della linea cellulare e umano ESC. Combinando questo sistema con alta contenuto analisi, dimostriamo che phenotyping HLC può essere meno che richiede tempo ed eseguito a scala18,19,20,21.
In sintesi, l'automazione delle tecniche di coltura cellulare descritto nel presente documento ha portato a miglioramenti nell'affidabilità, gestione del tempo sperimentale e analisi throughput.

<table><tbody><tr><td>405 LS Rondella</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanolo</td> Life <td>Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con calcio e magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>Reagente delicato per dissociazione cellulare</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips per VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita degli epatociti umani</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatina umana M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Laminina ricombinante umana 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone 21-emiuccinato sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Siero sostitutivo</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Dispenser di reagenti MultidropCombi</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta Sistema di imaging ad alto contenuto</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante Wnt3a</td><td>R& D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della chinasi associata a Rho (ROCK) Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta di erogazione per provette standard</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Pipetta elettronica a 96 canali</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide 4%, tamponata, pH 6,9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1,00496&nbsp; EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Sistema di analisi e screening</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Sistema di analisi e screening</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (topo)</td></tr><tr><td>Alfa-fetoproteina</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (topo)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>Università di Dundee</td><td>Università di Dundee</td><td>1:200 (pecora)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>Università di Dundee</td><td>Università di Dundee</td><td>1:200 (pecora)</td></tr><tr><td>HNF-4&alfa;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (coniglio)</td></tr><tr><td>E-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (topo)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (anticorpo secondario)</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-pecora 488 (anticorpo secondario)</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-coniglio 488 (anticorpo secondario)</td><td>Tecnologie di vita</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

produzione semi-automatizzata di hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Cellule staminali pluripotenti umane rappresentano una fonte rinnovabile di tessuto umano. La nostra ricerca è focalizzata sulla generazione di tessuto epatico umano dalle cellule staminali embrionali umane (hESC) ed ha indotto le cellule staminali pluripotenti (iPSCs). Attuali procedure di differenziazione generano umano dell'epatocita-come le cellule (HLCs) visualizzati da una miscela di tratti fetali ed adulti. Per migliorare il fenotipo delle cellule, abbiamo completamente definito la nostra procedura di differenziazione e la nicchia delle cellule, con conseguente generazione di popolazioni di cellule che mostrano l'espressione genica migliorata e funzione. Mentre questi studi segnano progressi, la capacità di generare grandi quantità di multi piastre a pozzetti per lo screening è stata limitata da lavoro intensive procedure e variazioni da lotto a lotto. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una piattaforma semi-automatizzata per differenziare cellule staminali pluripotenti in HLCs. Stem cell seeding e differenziazione sono state effettuate usando liquid handling e sistemi automatici di pipettaggio in formato piastra a 96 pozzetti. In seguito la differenziazione, fenotipo delle cellule è stata analizzata usando microscopia automatizzata e un luminometro ben multi.

Differenziazione delle cellule è stata effettuata usando una linea di cellule staminali embrionali (H9). La piattaforma semi-automatica è stata utilizzata per differenziare e caratterizzare le cellule (Figura 1A). Un dispenser automatico dei liquidi è stato utilizzato per cappotto matrice e seme di singole cellule. Differenziazione cellulare è stata iniziata quando le cellule raggiunto confluency di 40% (giorno 0). Le modifiche di supporto sono state eseguite utilizzando un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili per rimuovere il mezzo e il dispenser di manipolazione dei liquidi per media aggiunta (Figura 1A). Fissazione delle cellule e la colorazione sono stati eseguiti utilizzando il distributore automatico dei liquidi in combinazione con la rondella automatica della piastra. Imaging e quantificazione sono stati eseguiti utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto e software di Columbus. L'attività del citocromo P450 è stata misurata usando un'analisi consolidata. A seguito di incubazione del substrato, i surnatanti delle cellule sono state raccolte e bioluminescenza registrate utilizzando un lettore di micropiastre multimodale (Figura 1A). Inoltre, microscopia di contrasto di fase convenzionale è stata utilizzata per misurare i cambiamenti nella morfologia delle cellule durante la differenziazione degli epatociti (Figura 1B).
Il giorno 18, la variabilità nel numero delle cellule tra pozzi è stata esaminata in seguito DAPI macchiatura (Figura 2A). Sette campi di vista furono catturati per bene e il numero dei nuclei quantificato (Figura 2A). Abbiamo non rilevato nessuna differenza statistica tra pozzetti con una media di ± 3 41.662, 366 cellule per pozzetto (Figura 2B).
Al giorno 18, HLCs erano fissi e macchiato per marcatori tipici dell'epatocita (Figura 3A-G) e testati per l'attività di CYP P450. HLCs hanno espresso gli indicatori dell'epatocita come HNF4α (89,2% ± 2 cellule positive), ALB (92,8% ± 6 cellule positive), AFP (61,8% ± 2 cellule positive). HLCs inoltre esprimono proteine CYP P450, CYP2D6 e CYP3A4 e visualizzato un aspetto poligonale distinto come indicato dall'espressione di proteine E-Cadherin. Attività di CYP P450 HLCs è stata misurata al giorno 18. HLCs ha esibito l'attività di CYP1A2 a 295.906 ± 45, 828 RLU/mL/mg di proteina e CYP3A a 1.066.112 ±177, 416 RLU/mL/mg di proteina (Figura 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figura 1: differenziazione degli epatociti da sportelli unici nella 96 Beh formato. (A). diagramma delle attrezzature utilizzate per semi-automatizza la differenziazione cellulare, fissazione, colorazione, imaging e l'attività funzionale. (B). rappresentante cambiamenti nella morfologia cellulare durante il differenziamento HLC. Brevemente, gli sportelli unici sono pronti verso endoderma definitivo, seguita dalla specifica di hepatoblast caratterizzata dalle cellule visualizzati da ciottoli-come la morfologia e prima della maturazione degli epatociti con cellule l'acquisizione di forma poligonale. Barra della scala = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figura 2: valutazione della variabilità di HLCs pozzetto a altro. (A) rappresentazione di un 96 piastra ben vista di HLCs macchiato con DAPI. Barra della scala = 1 mm (B) quantificazione del numero di cellule per pozzetto. Media del numero di cellulare per pozzi in colonne (in alto) e righe (in basso), da sette campi di viste al bene e quantificati utilizzando software di Columbus. Numero medio delle cellule attraverso la piastra è 41.662 ± 3.366 SEM cellule per pozzetto. Sono state osservate differenze statisticamente significative tra pozzetti. È stato impiegato un one-way ANOVA con test statistici di post-hoc di Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figura 3: espressione del marcatore dell'epatocita e misura di attività di CYP P450 in HLCs al giorno 18. (A) la percentuale dell'alfa di fattore nucleare 4 dell'epatocita (HNF4α) espressione ± SEM si basa su trenta pozzi con dieci campi di vista per pozzetto. (B) la percentuale di espressione di albumina (ALB) + /-SEM, si basa su 3 pozzetti separati con dieci campi di vista per pozzetto. (C) la percentuale di alfa fetoproteina (AFP) + /-SEM si basa su 3 pozzetti separati con dieci campi di vista per pozzetto. Macchiatura di E-caderina (D) . (E) la macchiatura CYP2D6. Macchiatura di CYP3A4 (F) . (G). immunoglobulina G (IgG) controllo di colorazione. Barra della scala = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 e 3A attività metabolica in HLCs al giorno 18. La rappresenta dati biologici sei replica + /-SEM. attività è citato come unità di luce relativa (RLU) /mL per 1 mg di proteina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un approccio semi-automatizzato per produrre dell'epatocita-come le cellule da cellule staminali pluripotenti umane in un formato ben 96 PORTATARGA. Questo processo è rapido ed economico, permettendo che la produzione di qualità ha assicurato lotti dell'epatocita-come delle cellule per la ricerca umana di base e applicata.

Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

Questo metodo produce cellule simili a epatociti altamente riproducibili in un formato a 96 pozzetti utilizzando piattaforme semi-automatizzate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è rapida, economica, con variazioni ridotte e consente la produzione di massa di piastre a 96 pozzetti di cellule simili agli epatociti. Preparare una soluzione di cinque microgrammi per millilitro di laminina 521 scongelata diluendola in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco ghiacciato una tantum o DPBS con magnesio di calcio.Utilizzare un erogatore automatico per la manipolazione dei liquidi con una cassetta di erogazione per tubi standard per aggiungere 50 microlitri della soluzione di laminina 521 per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare le piastre rivestite di lamina 521. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di laminina 521 dalla superficie rivestita, utilizzando un adattatore di aspirazione a otto canali ed evitare qualsiasi contatto con la superficie rivestita.Aggiungere immediatamente 50 microlitri per pozzetto di terreno mTeSR1 integrato con 10 micromolari di chinasi associata a Rho o inibitore ROCK Y27632. Conservare la piastra nell'incubatrice fino alla semina delle cellule a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Da una sospensione cellulare di tre volte 10 alla quinta cellula per millilitro in terreno mTeSR1 integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK Y27632.Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare sulla piastra. Dopo la semina, rimettere le piastre nell'incubatore cellulare a 37 gradi Celsius, 5% di CO2, per 24 ore per consentire alle cellule di attaccarsi. Dopo aver prelevato la piastra dall'incubatrice, esaminarla il giorno successivo e verificare che il contatto tra cellule sia stato stabilito e che la confluenza raggiunga il 40%, quindi passare ai mezzi di differenziazione.La confluenza cellulare fa appello all'inizio della differenziazione. È la chiave per ottenere una buona qualità delle cellule simili agli epatociti. L'inizio della differenziazione, una volta che la confluenza raggiunge il 40%Se la confluenza è più alta, le piastre non sono adatte per la differenziazione.24 ore dopo la semina, rimuovere con cura il terreno utilizzando una pipetta elettronica automatica a canale portatile. E aggiungi 100 microlitri di terreno di priming endodermico fresco integrato con 100 nanogrammi per millilitro di activina A e 50 nanogrammi per millilitro Wnt3a. Dopo l'induzione definitiva dell'endoderma, passare al terreno KSR DMSO per le specifiche dell'epatoblasto.E cambia il mezzo ogni due giorni per cinque giorni. Dopo la differenziazione dell'epatoblasto, rimuovere il terreno KSR DMSO e lavare le cellule una volta con il terreno HepatoZYME senza l'integratore. Dopo il lavaggio, aggiungere 100 microlitri di terreno di maturazione HepatoZYME integrato con 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita degli epatociti e 20 nanogrammi per millilitro di Oncostatina M.Cambiare il terreno ogni 48 ore per sette-dieci giorni.Il giorno 18 di differenziazione, fissare le cellule ed eseguire l'immunocitochimica, utilizzando la manipolazione dei liquidi e la lavatrice automatica delle piastre. Conservare le lastre a quattro gradi Celsius al buio fino all'imaging. Proseguire con l'imaging e la quantificazione.Il giorno 18, la variabilità e il numero di cellule tra i pozzetti sono stati esaminati dopo la colorazione DAPI. Dopo aver catturato sette campi visivi per pozzetto e aver quantificato il numero di nuclei, non sono state identificate differenze statistiche. La colorazione di cellule simili a epatociti umani o HLC al giorno 18 ha mostrato l'espressione dei marcatori epatocitari HNF4 alfa, albumina e AFP.Gli HLC esprimevano anche le proteine CYP P450, CYP2D6 e CYP3A4 mostravano attività metabolica CYP P450. Gli HLC hanno anche mostrato un aspetto poligonale distinto, mostrato dalla E-caderina. Nonostante la standardizzazione di questo protocollo, la confluenza cellulare prima della differenziazione è fondamentale per la differenziazione delle HRC.Vediamo indipendente dalle cellule. Pertanto, per ogni linea cellulare è necessaria la semina di vendita e l'ottimizzazione della densità. Una volta padroneggiata, questa metodologia consente la generazione rapida di piastre multiple di cellule epatiche umane per la modellazione della malattia, lo screening di farmaci o gli studi di proposta di farmaci.Questo sistema consente la generazione di dataset multiparametrici per l'analisi meccanicistica per la biologia degli epatociti.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

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Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Il metodo presentato qui descrive una soluzione scalabile e buone pratiche di fabbricazione (GMP) sistema di differenziazione -ready per generare cellule epatociti-come l'essere umano da cellule staminali pluripotenti. Serve come un sistema economico e standardizzato per generare cellule epatociti-come l'essere umano per la ricerca di base e applicata fegato umano.

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.

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Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

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Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).

Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

I sistemi di differenziazione da cellule staminali pluripotenti (PSC) a cellule funzionali sono attualmente ostacolati da problemi di grave variabilità da linea a linea e da lotto a lotto. Qui, utilizzando la differenziazione cardiaca come esempio principale, presentiamo un protocollo per monitorare e modulare in modo intelligente il processo di differenziazione della PSC basato sull'apprendimento automatico basato su immagini.

Una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti

Scopri un metodo semi-automatizzato per produrre epatociti da cellule staminali pluripotenti umane in piastre da 96 pozzetti. Questa tecnica rapida e standardizzata supporta la modellazione di malattie epatiche e lo screening farmacologico.

Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

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