Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in qualsiasi campo di ricerca in cui il segnale di fosforilazione è di interesse, come il campo del cancro, per valutare i cambiamenti nelle reti di segnalazione dopo la resistenza terapeutica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che migliaia di fosfopeptidi possono essere identificati in modo relativamente semplice ed economico per valutare globalmente il fosfoproteoma. Per raccogliere il tessuto tumorale, pesare il tumore e in una provetta di coltura, aggiungere due millilitri di tampone di lisi ghiacciata per ogni 100 milligrammi di tessuto.

Quindi utilizzare un omogeneizzatore portatile o da banco per omogeneizzare il lisato. Per ridurre e alcolizzare il campione, riscaldare la provetta a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare il campione su ghiaccio per 15 minuti. Mentre è ancora sul ghiaccio, sonicare il lisato tre volte, quindi riscaldare il campione a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Posizionare la provetta di sonicazione in un rotore a secchiello oscillante e centrifugare il lisato a 3, 500 g e 15 gradi Celsius per 15 minuti, quindi raccogliere il surnatante e scartare il pellet. Per digerire il lisato, utilizzare 100 millimolari di tris per diluire il campione di 12 volte per ridurre la quantità di guanidinio. Per cinque milligrammi di proteine, aggiungere 10 microgrammi di lisil endopeptidasi o lys-C e incubare il campione a temperatura ambiente per cinque o sei ore.

Preparare un milligrammo per millilitro di tripsina trattata con TPCK in un millimolare di HCL con 20 millimolari di cloruro di calcio e tripsina aggiunti con un rapporto di uno a 100 tripsina/proteine. Incubare il campione a 37 gradi Celsius per tre ore. Quindi aggiungere un'ulteriore aliquota di tripsina alla provetta e incubare il campione a 37 gradi Celsius per una notte.

Aggiungere il campione a un filtro di cutoff da 15 millilitri e 10 kilodalton. Centrifugare il campione in un secchio oscillante o in un rotore ad angolo fisso a 3, 500 g e 15 gradi Celsius fino a quando il volume del retentato è inferiore a 250 microlitri. Quindi raccogli il flusso e scarta il retentato.

Per acidificare il campione, aggiungere circa 20 microlitri di acido trifluoroacetico al 5% o TFA per millilitro di lisato. Mescolare bene la provetta e utilizzare una striscia di pH per misurare il pH. Se necessario, aggiungere un ulteriore 5% di TFA per regolare il pH a 2,5.

Quindi, collegare l'estremità più corta di una colonna C18 a un collettore a vuoto. Dopo aver impostato il vuoto tra 17 e 34 kilopascal, utilizzare tre millilitri di acetonitrile al 100% e una pipetta di vetro per bagnare la colonna. Equilibrare la colonna utilizzando una pipetta di vetro e applicando due aliquote da tre millilitri di TFA allo 0,1%.

Quindi caricare il campione acidificato sulla colonna. Utilizzare tre volumi da tre millilitri di 0,1 TFA per lavare la colonna. Quindi applicare due millilitri di ACN 0,1% al 40% di TFA per eluire il campione e raccogliere due frazioni da due millilitri in provette di vetro.

Con il parafilm, coprire le provette dell'eluente e utilizzare un ago da 20 gauge per praticare da tre a cinque fori nel coperchio prima di liofilizzare i campioni durante la notte. Risospendere la polvere liofilizzata con 0,5 millilitri di immunoprecipitazione ghiacciata o tampone legante IP in ciascuna frazione. Trasferire il volume di risospensione di 0,5 millilitri dalla seconda frazione al tubo con la prima frazione e conservare il puntale della pipetta.

Utilizzare altri 0,5 millilitri di tampone IP per risciacquare ogni provetta di liofilizzazione prima di trasferire il contenuto nella criopro, quindi ripetere il risciacquo utilizzando due millilitri di tampone IP. Dopo aver utilizzato un P200 con una punta tagliata per trasferire la scorta di 0,5 milligrammi per millilitro di liquame di perle di anticorpi nel tubo per microfuge, aggiungere 450 microlitri di tampone legante IP ghiacciato per lavare 50 microlitri di liquame di perline di anticorpi 4G10 e 25 microlitri di liquame di perline di anticorpi 27 B10.4 in un tubo di microfuge. Centrifugare la provetta a 100 g e quattro gradi Celsius per un minuto.

Dopo aver aspirato il surnatante, aggiungere un volume uguale al liquame originale del tampone legante IP per risospendere le perle. Aggiungere perle di pY prelavate alla soluzione del campione risospeso nelle crioprovette con tappo a vite, quindi incubarle a quattro gradi Celsius su un rotatore end-over-end durante la notte. Dopo aver centrifugato le perline, conservare il surnatante che verrà utilizzato per arricchire i peptidi pST.

Quindi, utilizzare 300 microlitri di tampone legante IP per risospendere le perle e trasferirle in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Centrifugare i campioni a 100 g e quattro gradi Celsius per un minuto. Quindi, con 500 microlitri di tampone legante IP, lavare le perle tre volte.

Lavare le perle quattro volte con 450 microlitri di bicarbonato di ammonio 25 millimolare pH 7,5. Immergere una punta di caricamento del gel leggermente sotto la superficie del cordone e aspirare completamente il surnatante. Aggiungere quattro volte il volume delle perle dello 0,1% di TFA alle perline.

Quindi mescolarli bene e incubare la provetta in un termomixer a 1.000 giri/min e 37 gradi Celsius per 15 minuti. Trasferire la risospensione in un filtro centrifugo da 0,2 micrometri e centrifugare il filtro a 850 g per un minuto. Dopo aver trasferito l'eluizione in una provetta da microcentrifuga a basso contenuto proteico, concentrare sotto vuoto l'eluente fino alla secchezza a 40 gradi Celsius con un tempo di riscaldamento di 300 minuti durante la notte.

Per preparare le perle di ossido di titanio contenute nelle punte, aggiungere 200 microlitri di ACN al 100%. Quindi capovolgerlo e muovere l'estremità stretta per spostare il liquido verso il tappo. Usando una lama di rasoio, taglia la punta e posizionala sopra il tubo legante a basso contenuto proteico.

Quindi rimuovere il tappo e inserire una micropipetta per eliminare l'ACN rimanente prima di ripetere il lavaggio. Precondizionare il biossido di titanio con 500 microlitri di ACN al 100% due volte. Quindi condizionare il biossido di titanio con 500 microlitri di tampone fosfato di sodio molare 0,2 molare pH 7 due volte.

Infine, utilizzare 300 microlitri di tampone di equilibrio per lavare le perle tre volte. Aggiungere 400 microlitri di 50%ACN 0,1%TFA al tubo a basso contenuto proteico. Quindi aggiungere 84 microlitri di acido lattico.

Trasferire i fosfopeptidi risospesi nella provetta a basso contenuto proteico e incubarli a temperatura ambiente utilizzando un rotatore end-over-end per un'ora. Dopo aver pellettato le perline, utilizzare 300 microlitri di tampone di equilibrio per lavarle due volte e farle girare verso il basso. Con 300 microlitri di tampone di risciacquo, sciacquare le perle due volte.

Quindi trasferirli in un filtro rotante da 0,2 micrometri. Dopo la centrifuga, trasferire l'unità filtrante in un tubo pulito da 1,5 millilitri a basso contenuto proteico e con 200 microlitri di ammonio allo 0,9% in acqua, eluire il contenuto due volte. Dopo aver controllato il pH, concentrare sotto vuoto l'eluente fino alla secchezza durante la notte per far evaporare l'ammoniaca.

Per desalinizzare i peptidi per l'analisi della MS, ricostituire i fosfopeptidi con 15 microlitri di TFA allo 0,1%. Pulire il campione utilizzando una punta C18 con una capacità legante di cinque microgrammi e seguire il protocollo del produttore. Infine, dopo aver completamente essiccato il volume di eluizione mediante concentrazione sotto vuoto, risospendere i fosfopeptidi essiccati in 12,5 microlitri di soluzione di spettrometria di massa.

Questo gel di lisato predigerito colorato con Coomassie conferma la presenza di proteine, mentre la colorazione del lisato post-digerito conferma la completa digestione. Per una digestione completa, non devono apparire bande superiori a 15 kilodalton, ad eccezione delle bande da 30 kilodalton e 23,3 kilodalton rispettivamente per la lis-C e la tripsina. L'aggiunta di lys-C riduce anche il numero di scissioni mancate.

L'immunoprecipitazione pY separa efficacemente i peptidi pY da quelli pST erano in media l'85% dei fosfopeptidi identificati dal preparato pY sono pY e oltre il 99% dei fosfopeptidi identificati dal preparato pST sono pST. Il biossido di titanio viene utilizzato per arricchire i fosfopeptidi in entrambi i preparati. La percentuale prevista di peptidi fosforilati nella preparazione pronta per la SM è compresa tra il 30 e il 50% e la maggior parte dei fosfopeptidi rilevati ha un gruppo fosforico singolo o doppio.

Dopo aver eseguito la spettrometria di massa, i file grezzi MS vengono caricati in un software di analisi MS. Come illustrato qui, l'impostazione di un cutoff di probabilità di localizzazione superiore a 0,75 filtra circa il 5% dei peptidi pY e il 15% e il 34% dei peptidi pS e pT rispettivamente. Dopo l'applicazione di questi filtri, il numero previsto di identificazioni di fosfopeptidi alla fine dell'analisi MS è di circa 300 peptidi pY per cinque milligrammi della proteina di partenza e circa 7.500 peptidi pS e 640 peptidi pT per 2,5 milligrammi della quantità di peptide iniziale dalle rispettive preparazioni di arricchimento.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei giorni se i passaggi pY e pST vengono eseguiti in parallelo. Tuttavia, per più di otto campioni, eseguire i passaggi in sequenza per ridurre l'errore tecnico per altri quattro giorni. Durante il tentativo di queste procedure, è importante ricordare di concentrarsi sui dettagli.

Ogni passaggio è importante e può influire sulla qualità delle preparazioni finali, compresi i necessari controlli di qualità sono fondamentali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e digerire le proteine, seguito dall'arricchimento di fosfopeptidi per l'analisi tramite spettrometria di massa per studiare i cambiamenti globali nel fosfoproteoma.