Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse
30 settembre 2018
Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.
Questo metodo può avere risposta a domande chiave nel campo dell'isolotto pancreatico sulla differenziazione del lignaggio dell'isolotto pancreatico, sulla maturazione e sulla rigenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la raccolta di singole cellule isolotti pancreatiche per la generazione di dati di sequenziamento dell'RNA a singola cella di alta qualità. L'applicazione di questa tecnica si estende verso la terapia del diabete e delle altre malattie endocrine pancreatiche attraverso l'analisi trascritologica delle singole cellule endocrine pancreatiche sulle condizioni patologiche.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'inserimento dell'ago nel condotto biliare stretto del pancreas per la perfusione può essere complicato. Per il giorno embrionale 17,5 embrioni. Dopo aver aperto la cavità addominale, utilizzare una pinzetta a gomito per trasferire il tessuto viscerale su un piatto inferiore nero di sei centimetri contenente PBS freddo.
Utilizzare le pinze per staccare il pancreas dal tessuto viscerale. E mettere il tessuto pancreatico in una fiala da 20 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione fredda di collagenasi. Per il giorno postnatale da zero a 15 topi, sezionare attentamente tutti i lobi del pancreas prima di posizionare il tessuto nella collagenasi.
Per il giorno postnatale da 18 a 60 topi, rimuovere prima lo xifoide ed estrarre l'intestino sul lato destro della cavità addominale. Spingere i lobi mediali sinistro e destro del fegato su ciascun lato per esporre la cistifellea e il comune condotto biliare. E bloccare il duodeno con un paio di morsetti di piccoli recipienti nelle posizioni superiore e inferiore per fiancheggiare il sito in cui il condotto biliare entra nel duodeno.
Successivamente, caricare una siringa da 5 millilitri dotata di un ago calibro 30 con soluzione di collagenasi fredda. E usa il microscopio per inserire la punta dell'ago nella cistifellea. Manipolare con cura e senza intoppi l'ago attraverso il comune condotto biliare.
E deprimere lo stantuffo per perfondere il pancreas con uno o cinque millilitri della soluzione di collagenasi in base alle dimensioni del topo. Quando tutta la soluzione è stata perfusa, utilizzare le forcep per trasferire immediatamente il pancreas in una fiala da 20 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione fresca di collagenasi fredda. Quando tutto il tessuto pancreatico è stato raccolto, posizionare il flaconcino in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per tre minuti, seguito da tre o cinque minuti di agitazione delicata.
Quindi filtrare il prodotto digerito attraverso un colino in nylon da 0,25 millimetri in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri. E utilizzare una siringa da 20 millilitri contenente PBS ghiacciato per lavare accuratamente il colino. Per il giorno postnatale da 18 a 60 pancreata, centrifugare il campione filtrato e rimospendare il tessuto in 30 millilitri di PBS freddo.
Quindi decantare la sospensione del tessuto in un piatto inferiore nero di sei centimetri e utilizzare una pipetta da 200 microlitri e un microscopio sezionante per raccogliere gli isolotti per il trasferimento in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente un piccolo volume di PBS freddo. Per il giorno embrionale 17,5 dopo il giorno natale 15 pancreata, centrifugare il tessuto pancreatico filtrato e rimpicolare il pellet in soluzione di tripsiderina-EDTA per un'incubazione di quattro minuti in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi. Al termine dell'incubazione, cercare delicatamente di valutare il pellet per un minuto con una pipetta da 200 microliter, seguita dall'aggiunta di 0,5 volte il volume del siero bovino fetale freddo con un vortice delicato per fermare la digestione.
Quindi raccogliere il digest per centrifugazione e risosopendare le cellule in 200 microlitri di tampone FACS in un tubo FACS da 5 millilitri per lo smistamento per citometria del flusso. Per il prelievo e lalisi a cella singola, tampone dilisi cellulare appena preparato in otto tubi PCR a strisce e trasferire una singola cella in ciascuno di essi. Vortice i campioni per liscittere le cellule per il rilascio dell'RNA, seguito da centrifugazione per 30 secondi a quattro gradi Celsius, e stoccaggio immediato sul ghiaccio.
Per la trascrizione inversa, incubare i lisati per tre minuti a 72 gradi Celsius seguiti da un minuto sul ghiaccio. Centrifugare brevemente i campioni per 30 secondi a quattro gradi Celsius e aggiungere 5,7 microlitri di miscela di trascrizione inversa a ciascun campione per portare il volume totale a 10 microlitri per ogni campione. Dopo un delicato vortice e centrifugazione, caricare i campioni in un termociclo e avviare il programma di trascrizione inversa.
Per la preamplificazione della reazione a catena della polimerasi, o PCR, aggiungere 15 microlitri di miscela PCR a ciascun campione contenente le prime reazioni del filamento, seguiti da un delicato vortice e centrifugazione. Quindi caricare i campioni nel termociclo e avviare il programma PCR. Per la purificazione della PCR, aggiungere 25 microlitri di perline di purificazione del DNA rimorsiate a ciascun campione e mescolare bene con il vortice.
Quindi ruotare rapidamente i campioni a temperatura ambiente per raccogliere il liquido evitando l'insediamento delle perline. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, posizionare i campioni su un supporto magnetico appropriato, rimuovendo e scartando con cura il supernatante quando la soluzione è chiara. Lavare le perline con due lavaggi di 30 secondi in 200 microlitri di etanolo per lavaggio preparato al momento all'80%.
E scartare l'etanolo rimanente dopo il secondo lavaggio. Quando le perline si sono asciugate all'aria, aggiungere 11 microlitri di acqua priva di nucleasi per elutare il bersaglio di DNA dalle perline, seguito da vortice. Quindi centrifugare rapidamente i campioni, riportare i campioni al supporto magnetico fino a quando la soluzione non è chiara e trasferire 10 microlitri di ciascun campione su un nuovo tubo PCR.
Il cDNA amplificato con successo dovrebbe avere una lunghezza completa superiore a 500 coppie di basi ed essere arricchito da 1,5 a due coppie di basi di chilo. Inoltre, di solito c'è un arricchimento da 500 a 600 coppie di basi di cDNA osservato in insulina una RFP più cellule, che può rappresentare le trascrizioni di insulina. Tuttavia, i frammenti di cDNA vicino a 100 coppie di basi sono dimeri primer, che di solito sono causati da primer eccessivi e che devono essere rimossi ripetendo la fase di purificazione del DNA.
I frammenti di cDNA tra le 100 e le 500 coppie di basi di solito rappresentano cDNA degradato, che è causato da uno stato di cattivo stato cellulare o da problemi di regione, come la contaminazione da RNasi e dovrebbe essere escluso. Dopo la purificazione delle librerie cDNA per il sequenziamento, il cDNA che va da 250 a 450 coppie di basi può essere ottenuto attraverso l'aggiunta di perline di purificazione del DNA al primo e al secondo round di purificazione. Dopo la purificazione delle perline di DNA, il punteggio di qualità del sequenziamento dovrebbe essere maggiore di 30 durante la valutazione della qualità del sequenziamento.
Per ottenere cellule di alta qualità per le analisi a valle, sono escluse cellule con meno di 0,5 milioni di letture mappate o con meno di 4.000 geni rilevati, facilitando la caratterizzazione di diversi gruppi di cellule e l'identificazione di geni che sono eterogenamente espressi in diversi gruppi dopo l'analisi dei componenti principali e il clustering gerarchico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di perfondere rapidamente il pancreas prima della digestione della collagenasi per evitare l'isolotto sulla digestione e mantenere l'ambiente libero dalla RNasi durante le procedure a singola cellula. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'imaging isolotto e la coltura possono essere eseguiti per facilitare la visualizzazione della struttura dell'isolotto ed esaminare le risposte cellulari e la stimolazione del farmaco.
Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della ricerca pancreatica per esplorare i meccanismi di sviluppo e rigenerazione del lignaggio dell'isolotto, così come la progressione del diabete nei mammiferi.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per isolare cellule endocrine da diverse fasi dello sviluppo del pancreas, seguito da sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Questa tecnica consente un'analisi dettagliata dello sviluppo della linea cellulare endocrina del pancreas e dell'eterogeneità cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Endocrinologia
Sfondo
- Comprendere la differenziazione della linea cellulare degli isolotti pancreatici è fondamentale per la ricerca sul diabete.
- Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula fornisce dati trascrittomici di alta qualità.
- Il metodo consente lo studio della maturazione e della rigenerazione cellulare.
- Una guida visiva è importante per gli aspetti tecnici della procedura.
Scopo dello studio
- Analizzare lo sviluppo e l'eterogeneità delle cellule endocrine del pancreas.
- Studiare i processi di rigenerazione negli isolotti pancreatici.
- Migliorare la comprensione del diabete e delle malattie correlate attraverso l'analisi trascrittomica.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cellule endocrine pancreatiche da pancreas embrionali, neonatali e postnatali.
- Sequenziamento dell'RNA a singola cellula per l'analisi trascrittomica.
- Dimostrazione visiva del metodo per maggiore chiarezza.
- Utilizzo di pinzette a becco lungo e PBS freddo durante la procedura.
Risultati principali
- Il metodo isola con successo singole cellule delle isole pancreatiche.
- Vengono generati dati di sequenziamento dell'RNA di alta qualità.
- Fornisce informazioni sul differenziamento e sulla maturazione della linea cellulare delle isole pancreatiche.
- Vengono discussi potenziali applicazioni nella terapia del diabete.
Conclusioni
- Questa tecnica è uno strumento prezioso per lo studio delle cellule endocrine del pancreas.
- Offre un percorso per comprendere meglio e trattare le malattie correlate alle cellule endocrine del pancreas.
- Ulteriori ricerche possono basarsi sui risultati ottenuti per esplorare opzioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il profilo trascrittomico a singola cellula delle cellule endocrine del pancreas consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione di bersagli per il diabete, risolvendo l'eterogeneità cellulare e le traiettorie di linea cellulare. Questo approccio supporta una maggiore affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando i fenotipi molecolari agli stati funzionali delle cellule β produttrici di insulina attraverso le diverse fasi dello sviluppo. Il metodo fornisce un sistema rilevante per la malattia per valutare l'interazione con il bersaglio e le risposte trascrizionali in modelli preclinici di malattie metaboliche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la mappatura delle vie di differenziazione dei progenitori endocrini e di maturazione delle cellule β.
- Valore operativo: Fornisce una risoluzione quantitativa a livello di singola cellula per ridurre i rischi associati ai target coinvolti nella specificazione e rigenerazione della linea cellulare degli isolotti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera set di dati trascrittomici di alta qualità per la scoperta di biomarcatori e la standardizzazione di saggi in popolazioni di cellule endocrine.
- Valore operativo: Consente flussi di lavoro scalabili per l'isolamento di cellule da utilizzare come input validati in applicazioni di screening a valle.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie confrontando gli stati trascrizionali nei contesti pancreatici embrionali, neonatali e postnatali.
- Valore operativo: Permette il monitoraggio longitudinale delle transizioni dello stato cellulare per informare un avanzamento mirato al rischio nei modelli preclinici di diabete.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta fornendo letture trascrizionali che contribuiscono alla validazione degli obiettivi e all'identificazione di composti promettenti nei programmi per le malattie metaboliche.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nello sviluppo della linea endocrina e nella maturazione funzionale delle cellule β.
- Screening: Fornisce output quantitativi riproducibili a livello singola cellula per la preparazione dei saggi e la caratterizzazione dell'effetto di composti in sistemi derivati da isole pancreatiche.
- Analisi: Permette l'analisi delle componenti principali e il raggruppamento gerarchico al fine di identificare geni espressi in modo eterogeneo e definire gli stati cellulari.
- Ricerca Translazionale: Collega le firme trascrittionali dello sviluppo ai processi di maturazione postnatale e di rigenerazione, rilevanti per la modellizzazione delle malattie.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata per il profilo delle cellule endocrine applicabile in diverse fasi della malattia e modelli genetici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Conferma predittiva attraverso la riduzione del rischio meccanicistica di bersagli legati all'identità e alla funzione delle cellule β.
- Valore operativo: Protocollo standardizzato di isolamento e sequenziamento che garantisce riproducibilità attraverso diversi punti temporali dello sviluppo.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'ambiguità nelle previsioni sulla biologia del bersaglio e sulla risposta cellulare.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, basandosi su evidenze trascrittomiche in contesti cellulari endocrini rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissezione dei tessuti, nella perfusione enzimatica e nella manipolazione di singole cellule in condizioni prive di RNasi.
- Dipende dall'accesso a strumentazione per la perfusione, citometria a flusso e piattaforme di termociclaggio per la preparazione delle librerie.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi di digestione, i protocolli di colorazione e le soglie di controllo qualità per la vitalità cellulare e l'integrità dell'RNA.
- L'adattamento tra diversi sistemi modello richiede l'ottimizzazione della concentrazione di collaghenasi e del volume di perfusione in base alle dimensioni del pancreas e allo stadio di sviluppo.
- I limiti pratici includono la variabilità nel rendimento del tessuto e la necessità di una perfusione rapida per prevenire una digestione eccessiva, come indicato nelle indicazioni procedurali.
