Name: Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri l'analisi trascrittomica unicellulare delle cellule endocrine pancreatiche del topo. Questo metodo consente di studiare la differenziazione cellulare e la rigenerazione delle isole pancreatiche con dati di sequenziamento RNA di alta qualità.

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Ringraziamo il centro nazionale per Protein Sciences, Beijing (Peking University) e il centro di Tsinghua di Pechino per la piattaforma di Computing di Life Science. Questo lavoro è stato supportato dal Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2015CB942800), National Foundation Natural Science of China (31521004, 31471358 e 31522036) e finanziamenti da Tsinghua di Pechino centro per le scienze della vita a C.-chrysantha

<ol><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li>
<li>Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">On the origin of the beta cell.</a> Genes & Development. 22 (15), 1998-2021 (1998).</li>
<li>Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+pancreatic+beta-cells+are+formed+by+self-duplication+rather+than+stem-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation.</a> Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+Advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).</li>
<li>Qiu, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+pancreatic+islet+beta+cell+and+alpha+cell+maturation+pathways+and+characteristic+features+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-seq2+for+sensitive+full-length+transcriptome+profiling+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells.</a> Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Piccand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pak3+promotes+cell+cycle+exit+and+differentiation+of+beta-cells+in+the+embryonic+pancreas+and+is+necessary+to+maintain+glucose+homeostasis+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice.</a> Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).</li>
<li>Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+mouse+pancreas+for+histological+analysis+and+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).</li>
<li>Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Single cell isolation and analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116(2016).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14 (4), (2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--a+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mRNA+abundance+using+RNA-seq+data%3A+RPKM+measure+is+inconsistent+among+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+in+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples.</a> Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).</li>
<li>Brennecke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+technical+noise+in+single-cell+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments.</a> Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Le, S., Josse, J., Husson, F. <a target="_blank" href="https://www.jstatsoft.org/article/view/v025i01">FactoMineR: An R package for multivariate analysis.</a> Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).</li>
<li>Hadley, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadley%2C+W+%22ggplot2%3A+Elegant+graphics+for+data+analysis%22">ggplot2: Elegant graphics for data analysis</a>. , Springer Science & Business Media. (2009).</li>
<li>Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://cran.r-project.org/package=gplots">https://cran.r-project.org/package=gplots</a> (2016).</li>
<li>Marcheva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+clock+components+CLOCK+and+BMAL1+leads+to+hypoinsulinaemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes.</a> Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+analysis+maps+development+of+human+germline+cells+and+gonadal+niche+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+Digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+Purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Teo, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+of+human+islet+cells+reveal+de-differentiation+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures.</a> Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo protocollo, abbiamo dimostrato un metodo efficace e facile da usare per studiare i profili di espressione di singole cellule delle cellule β del pancreas. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per isolare le cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale e per eseguire analisi trascrittomica unicellulare.
Il punto più critico è l'isolamento di cellule β singolo in buone condizioni. Pancreas completamente irrorato rispondono meglio alla successiva digestione. Insu...

Il pancreas è un organo metabolico vitale nei mammiferi. Il pancreas è costituito da scomparti endocrini ed esocrini. Le cellule endocrine del pancreas, tra cui cellule β che producono insulina e glucagone-producendo le cellule α, raggruppare in cluster degli isolotti di Langerhans e coordinatamente regolano l'omeostasi del glucosio sistemico. Disfunzione delle cellule endocrine si traduce in diabete mellito, che è diventato un problema importante di sanità pubblica in tutto il mondo.
Le cellule endocrine del pancreas sono derivate da Ngn3+ progenitori durante l'embriogenesi1. Più tardi, durante il periodo perinatale, le cellule endocrine proliferano negli isolotti immaturo di forma. Queste cellule immature continuano a sviluppare e gradualmente diventare maturi isolotti, che riccamente vascolarizzati per regolare l'omeostasi del glucosio di anima in adulti2.
Anche se è stato identificato un gruppo di fattori trascrizionali che regolano la differenziazione delle cellule β, la via precisa maturazione delle cellule β è ancora poco chiara. Inoltre, il processo di maturazione delle cellule β coinvolge anche il regolamento di cella numero espansione3,4 e la generazione di eterogeneità cellulare5,6. Tuttavia, i meccanismi di regolamentazione di questi processi non sono stati studiati bene.
Cella singola RNA-sequenziamento è un approccio potente che può profile sottopopolazioni delle cellule e traccia cella lignaggio vie dello sviluppo7. Approfittando di questa tecnologia, la chiave di eventi che si verificano durante lo sviluppo dell'isolotto pancreatico possono essere decifrati al livello unicellulare8. Tra i protocolli di RNA-sequenziamento unicellulare, Smart-seq2 consente la generazione di cDNA integrale con una migliore sensibilità e precisione e l'uso di reagenti normalizzati a più basso costo9. Smart-seq2 richiede circa due giorni per costruire una libreria di cDNA per sequenziamento10.
Qui, vi proponiamo un metodo per l'isolamento delle cellule β fluorescenza-etichettati dal pancreas del feto per adulto Ins1-RFP topi transgenici11, usando la fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS), e le prestazioni di trascrittomica analizza presso il livello di singola cellula, utilizzando la tecnologia Smart-seq2 (Figura 1). Questo protocollo può essere esteso per analizzare i trascrittomi di tutti i tipi di cellula endocrina pancreatica negli stati normali, patologici e invecchiamento.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi P</td><td>Roche</td><td>11213873001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25 %), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-5058</td><td></td></tr><tr><td>30 G BD Ago 1/2" Lunghezza</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Lumar V12</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene Tubo a fondo tondo con tappo per filtro cellulare</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra PCR a 96 pozzetti</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-C</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino sigillante in silicone</td><td>Axygen</td><td>AM-96-PCR-RD</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per PCR a pozzetti sottili</td><td>Extragene</td><td>P-02X8-CF</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta capillare</td><td>Sutter</td><td>B100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Gibco</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi ricombinante</td><td>Takara</td><td>2313</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa Superscript II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Tampone primo filamento (5x)</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-43-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads Perline XP</td><td>Vazyme</td><td>N411-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>AceQ qPCR SYBR Green Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q121-02</td><td></td></tr><tr><td>TruePrep DNA Library Prep Kit di preparazione V2 per Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD502</td><td>Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE</td></tr><tr><td>Kit indice TruePrep V3 per Illumina</td><td>Vazyme</td><td>TD203</td> Include 16 kit di analisi dei frammenti NGS ad alta sensibilità <td>N6XX e 24 N8XX</td></tr><tr><td></td><td>Tecnologie analitiche avanzate</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS senza Ca2+ e Mg2+</td><td></td><td></td><td>138 mM di NaCl; 5,34 mM KCl 4,17 mM NaHCO3; 0,34 mM Na2HPO4 0,44 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td> di isolamento <td>1 &volte; HBSS contenente 10 mM di HEPES, 1 mM di MgCl2, 5 mM di glucosio, pH 7,4</td></tr><tr><td>tampone</td><td></td><td></td> FACS <td>1 & HBSS contenente 15 mM HEPES, 5,6 mM di glucosio, 1% FBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN primer</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30 VN-3'TSO</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'ISPCR</td></tr> <tr><td>inneschi</td><td></td><td></td><td>5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Innesco</td><td></td><td></td> diretto <td>5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'</td></tr><tr><td>Gapdh Innesco</td><td></td><td></td> inverso <td>5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Primer</td><td></td><td></td> diretto <td>5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'</td></tr><tr><td>Ins2 Primer</td><td></td><td></td> inverso <td>5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'</td></tr></tbody></table>

analisi trascrittomica unicellulare delle cellule endocrine del pancreas del mouse

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Le cellule endocrine del pancreas, che sono raggruppate in isolotti, regolano la stabilità di glucosio nel sangue e il metabolismo energetico. I tipi distinti delle cellule in isolotti, tra cui insulina-secrezione delle cellule β, sono differenziati da progenitori endocrini comuni durante la fase embrionale. Le cellule endocrine immature espandere tramite proliferazione delle cellule e maturare durante un periodo di sviluppo lungo postnatale. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi processi non sono chiaramente definiti. Cella singola RNA-sequenziamento è un approccio promettente per la caratterizzazione di popolazioni distinte delle cellule e l'analisi delle cellule lignaggio differenziazione pathways. Qui, descriviamo un metodo per il cella singola RNA-sequenziamento delle cellule β del pancreas isolato dal pancreas embrionale, neonatale e postnatale.

Pancreas sono stati sezionati da topi embrionali, neonatali e postnatali (Figura 2A e 2B). Per topi oltre postnatale giorno 18 anni di età, l'effetto digestivo dipende dal grado di aspersione; di conseguenza, l'iniezione è il passo più importante per l'isolamento dell'isolotto (Figura 2-2E e tabella 6). Come era possibile riempire il pancreas durante questo pass...

Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Questo metodo può avere risposta a domande chiave nel campo dell'isolotto pancreatico sulla differenziazione del lignaggio dell'isolotto pancreatico, sulla maturazione e sulla rigenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la raccolta di singole cellule isolotti pancreatiche per la generazione di dati di sequenziamento dell'RNA a singola cella di alta qualità. L'applicazione di questa tecnica si estende verso la terapia del diabete e delle altre malattie endocrine pancreatiche attraverso l'analisi trascritologica delle singole cellule endocrine pancreatiche sulle condizioni patologiche.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'inserimento dell'ago nel condotto biliare stretto del pancreas per la perfusione può essere complicato. Per il giorno embrionale 17,5 embrioni. Dopo aver aperto la cavità addominale, utilizzare una pinzetta a gomito per trasferire il tessuto viscerale su un piatto inferiore nero di sei centimetri contenente PBS freddo.Utilizzare le pinze per staccare il pancreas dal tessuto viscerale. E mettere il tessuto pancreatico in una fiala da 20 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione fredda di collagenasi

single-cell-transcriptomic-analyses-mouse-pancreatic-endocrine

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Qui, si descrive un metodo per l'isolamento, la cultura e manipolazione del pancreas embrionali di topo. Ciò rappresenta un...

Un sistema per<em&gt; Ex vivo</emColtura&gt; del pancreas embrionale

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

In questa pubblicazione, si descrive una procedura rapida e conveniente per l'isolamento e la coltura primaria cellule pancreatiche acinose del pancreas murino. Questo metodo costituisce un valido approccio per studiare la fisiologia delle cellule esocrine del pancreas freschi primarie normali / non trasformata.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

Nei saggi di colonie in vitro per rilevare auto-rinnovamento e la differenziazione delle cellule progenitrici isolate dal pancreas di topo adulti sono messo a punto. In questi saggi, progenitori pancreatici danno origine a colonie di cellule nello spazio 3-dimensionale in terreno semisolido contenente metilcellulosa. I protocolli per la gestione di singole cellule e caratterizzazione delle singole colonie sono descritti.

In Vitro Colony saggi per Caratterizzazione Tri-potenti cellule progenitrici isolato dal adulti murini Pancreas

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule nel microambiente del pancreas da tessuto embrionale, neonatale e adulto di topo, concentrandosi sull'isolamento di cellule mesenchimali. Questo metodo consente la profilazione dell'espressione genica cellulare e della secrezione proteica al fine di chiarire i segnali estrinseci che regolano lo sviluppo, la funzione e la tumorigenesi del pancreas.

Isolare e analisi cellule del pancreas Mesenchima mediante citometria di flusso

Qui, presentiamo un protocollo per generare insulina esprimendo 3D pancreatoids murino da progenitori pancreatici e 10.5 digalleggiante dissociato e mesenchima associato.

Generazione di insulina senza impalcatura, tridimensionale esprimendo Pancreatoids dal Mouse progenitori pancreatico In Vitro

Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.

Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

Questo protocollo descrive come generare fette di pancreas umano da donatori di organi deceduti per studiare la funzione cellulare in condizioni quasi fisiologiche. Questo approccio innovativo consente lo studio di isole normali e strutturalmente danneggiate e l'intricata interazione tra compartimenti endocrini ed esocrini.

Generazione di fette di tessuto pancreatico umano per studiare la fisiologia del pancreas endocrino ed esocrino

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule endoteliali di topo dall'intero pancreas.

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

Forniamo un protocollo minimamente invasivo per il trapianto intramuscolare di isolotti di cellule staminali pancreatiche derivate da cellule staminali umane in topi immunodeficienti per l'impianto in vivo e l'analisi a valle.

Trapianto intramuscolare di cellule endocrine pancreatiche derivate da cellule staminali pluripotenti umane nei topi

Scopri l'analisi trascrittomica unicellulare delle cellule endocrine pancreatiche del topo. Questo metodo consente di studiare la differenziazione cellulare e la rigenerazione delle isole pancreatiche con dati di sequenziamento RNA di alta qualità.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

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