Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

Questo metodo può essere utile quando si eseguono diagnosi point of care di pazienti con segni di infezioni virali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere eseguita senza attrezzature di laboratorio ed elettricità, e quindi può essere eseguita in un reparto ospedaliero. A dimostrare la procedura di raccolta del sangue, saranno il medico Anders Fomsgaard e lo scienziato Morten Rasmussen, entrambi del mio laboratorio.

Inizia preparando le provette per la raccolta del sangue. Utilizzare un ago da 25 pollici da 25 gauge collegato a una siringa da 3 ml per iniettare 1,6 ml di un tampone di lisi commerciale in una provetta a vuoto EDTA da 4 ML. È fondamentale mantenere il vuoto nella provetta per la raccolta del sangue per la raccolta del sangue.

Pertanto, utilizzare sempre un ago per iniettare il tampone di lisi nella provetta per la raccolta del sangue. Quindi risospendere completamente un volume di 960 microlitri di particelle di vetro magnetiche, o MGP, e trasferirlo in un tubo etichettato da 1,8 ML. Quindi, pipettare 4 ml di tampone di lavaggio, uno in una provetta da 4,5 ml etichettata WB-1,1,5 ml di tampone di lavaggio, due in una provetta da 3,6 ml etichettata WB-2 e 3 ml di tampone di lavaggio, tre in una provetta da 4,5 ml etichettata WB-3.

Infine, aggiungere 100 micro-litri di tampone di eluizione a una provetta da 1,8 ml etichettata EB e lasciare le provette a temperatura ambiente fino all'uso. Per prelevare sangue intero per via endovenosa dal paziente, utilizzare un ago a farfalla con un tubo di prolunga di piccolo diametro e una delle provette a vuoto per la raccolta del sangue precedentemente preparate contenenti tampone di lisi. Appoggiare il braccio del paziente in posizione abbassata.

Inserire l'ago a farfalla nella vena del paziente e collegare il tubo a vuoto per la raccolta del sangue alla piccola prolunga del foro. Dopo il prelievo del sangue, mescolare il contenuto della provetta, capovolgendo la provetta da cinque a dieci volte. Disinfettare l'esterno del tubo utilizzando etanolo al 70%.

Quindi incubare le provette per 20 minuti a temperatura ambiente per l'inattivazione del virus. Per purificare gli acidi nucleici dal sangue raccolto, mescolare nuovamente il contenuto della provetta capovolgendo manualmente la provetta a vuoto da cinque a dieci volte. Versare l'aliquota preparata di MGP direttamente nella provetta per il prelievo del sangue.

Posizionare un nuovo coperchio di una provetta per la raccolta del sangue inutilizzata sulla provetta contenente il campione. Metti un dito sul coperchio per assicurarti che il tubo sia ben chiuso e mescola il contenuto del tubo girandolo da cinque a dieci volte. Posizionare il tubo nel supporto magnetico e tenere un dito sul coperchio, per assicurarsi che il tubo sia ben chiuso.

Quindi capovolgere il supporto magnetico con il tubo alcune volte per disperdere gli MGP prima che si raccolgano sul lato del tubo con il magnete. Rimuovere il coperchio della provetta e gettare il contenuto della provetta in una provetta di raccolta da 50 ml, utilizzando una pipetta monouso. Versare l'aliquota preparata di WB-1 direttamente nella provetta per il prelievo del sangue e chiudere il coperchio della provetta.

Mescola il contenuto a mano da cinque a dieci volte. Quindi raccogliere le perline sul lato del tubo, utilizzando il magnete e rimuovere il liquido come prima. Risospendere le perle nell'aliquota preparata di WB-2, quindi scartare la soluzione e ripetere la procedura con un'aliquota preparata di WB-3.

Infine, rimuovere la provetta dal supporto magnetico e versare l'aliquota di EB preparata direttamente nella provetta per il prelievo del sangue. Posizionare il coperchio sul tubo e risospendere gli MGP picchiettando da cinque a dieci volte con un dito. Infine, utilizzare una pipetta monouso da 1,5 ml per trasferire una gocciolina di MGP risospese nella miscela di reazione di amplificazione degli acidi nucleici a valle.

Assicurarsi di risospendere completamente gli MGP prima di trasferire solo una gocciolina nella reazione PCR. Per dimostrare la prova del concetto, il sangue intero negativo è stato addizionato con diluizioni di 10 volte lo standard del virus Ebola, preparato dalla recente epidemia nel sud della Guinea, o tre diverse concentrazioni del virus di Epstein Barr. Gli acidi nucleici estratti sono stati analizzati mediante R2 qPCR o qPCR specifica per virus.

Più bassa è la soglia di attraversamento, o CT, maggiore è il numero di copie del genoma virale. Qui, il sangue intero addizionato con diverse concentrazioni del virus Ebola è stato rilevato da una lampada specifica per il virus Ebola. La concentrazione finale del virus nel campione di sangue intero addizionato si vede sull'asse X e i minuti verso la positività si vedono sull'asse Y.

Qui, il sangue intero è stato addizionato con diluizioni di 10 volte di un campione di siero standardizzato dell'OMS per l'epatite C, con rilevamento mediante RT qPCR specifica per l'HCV. Infine, questa immagine mostra i risultati di una reazione alla lampada specifica per il virus di Epstein Barr, su sangue intero positivo al virus di Epstein Barr. Durante il tentativo di questa procedura è importante utilizzare il tampone di legame della lisi specificato.

Questo è un passaggio cruciale e un reagente cruciale per il metodo. Questo tampone legante la lisi inattiverà il virus nel campione. Seguendo questa tecnica è possibile eseguire diversi metodi di rilevamento molecolare come la lampada e la PCR, e quindi è possibile eseguire una diagnosi differenziale.