Siringa-iniettabili Mesh elettronica per elettrofisiologia roditore cronica stabile

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come i processi di invecchiamento si manifestano nel cervello, come si sviluppa il cervello e come hanno origine e progrediscono le malattie cerebrali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'elettronica a rete non suscita una risposta immunitaria cronica nella gliosi una volta impiantata nel cervello e consente una perfetta integrazione con il tessuto neurale circostante. A dimostrare la procedura saranno Tao Zhou, uno studente laureato del Gruppo Lieber, e Jung Min Lee, un post-doc del Gruppo Lieber.

Per iniziare la procedura, caricare un wafer di silicio pulito in un evaporatore termico ed evaporare 100 nanometri di nichel. Quindi, centrifugare il fotoresist negativo SU-8 2000.5 sul wafer a 400 giri al minuto per uno spessore SU-8 approssimativo da 400 a 500 nanometri. Caricare il wafer in un allineatore a maschera per esporre l'SU-8 con una maschera per fotolitografia corrispondente allo strato inferiore di SU-8 mesh.

Esporre alla dose I-line di 100 millijoule per centimetro quadrato. Loro, immergere il wafer nel vassoio dello sviluppatore SU-8. Agitare delicatamente la soluzione per due minuti, fino a quando il modello di rete nell'SU-8 non è stato completamente sviluppato.

Quindi, sciacquare il wafer in una vaschetta di alcol isopropilico per un minuto e asciugarlo. Cuocete la cialda su una piastra calda a 180 gradi centigradi per un'ora. Successivamente, centrifugare il LOR 3A sul wafer a 4.000 giri al minuto per uno spessore approssimativo di 300 nanometri.

Spin coat S1805 fotoresist positivo a 4.000 giri al minuto per uno spessore approssimativo di 500 nanometri. Successivamente, caricare il wafer in un allineatore a maschera per esporre l'S1805 con la maschera fotolitografica due corrispondente alle interconnessioni metalliche e ai pad di ingresso e uscita. Esposto alla dose della linea H a 40 millijoule per centimetro quadrato, quindi immergere il wafer in un vassoio di rivelatore fotoresist CD-26.

Agitare delicatamente la soluzione per un minuto fino a quando il modello di interconnessione metallica non è stato completamente sviluppato. Sciacquare la cialda in una vaschetta di acqua deionizzata per un minuto e asciugarla con il phon. Successivamente, evaporare termicamente tre nanometri di cromo seguiti da 80 nanometri di oro.

Immergere il wafer in un becher piatto di dispositivo di rimozione PG per circa tre ore, fino a quando il metallo non è completamente sottosquadro, lasciando il metallo solo nell'interconnessione desiderata e nelle regioni di input, pad di uscita dell'elettronica a rete. Ripetere lo spin coating, la litografia, l'evaporazione e il sollevamento per lasciare tre nanometri di cromo e 50 nanometri di platino nelle regioni dell'elettrodo. Successivamente, ripetere lo spin coating e la fotolitografia di SU-8 per definire lo strato superiore di mesh SU-8.

Trattare il wafer con ossigeno al plasma a 50 watt per un minuto. Successivamente, immergere il wafer in una soluzione di incisione al nichel per circa tre ore, fino a quando l'elettronica della rete non è stata completamente rilasciata dal wafer di silicio. Utilizzare una pipetta pasteur per trasferire le sonde elettroniche a rete rilasciate dall'incisione del nichel a un becher da 100 millilitri di acqua deionizzata.

Quindi, trasferire l'elettronica a rete in un becher fresco di acqua deionizzata almeno tre volte per garantire il risciacquo. Per caricare l'elettronica mesh in un ago, inserire un ago capillare di vetro nel becher da 100 millilitri di PBS contenente l'elettronica mesh. Posizionare l'estremità dell'ago vicino ai cuscinetti di ingresso e uscita di una sonda elettronica a rete e ritrarre manualmente la siringa per aspirare una sonda per l'elettronica a rete nell'ago.

Spingere e tirare lo stantuffo della siringa mentre è ancora immerso nella soluzione salina per regolare la posizione dell'elettronica a rete all'interno dell'ago. Per iniettare l'elettronica mesh nel cervello di un topo, utilizzare un trapano dentale e un telaio stereotassico per aprire una craniotomia alle coordinate desiderate sul cranio. Aprire una seconda craniotomia lontano dal sito di iniezione per l'inserimento di una vite o di un filo grafico in acciaio inossidabile.

Quindi, fissare un substrato di serraggio al cranio con cemento dentale. Un taglio largo circa un millimetro nel substrato migliora l'affidabilità della fase di piegatura più avanti nella procedura. Successivamente, montare il portapipetta con l'ago contenente l'elettronica a rete nel telaio stereotassico utilizzando un morsetto terminale ad angolo retto.

Collegare l'uscita laterale del supporto della pipetta a una siringa da cinque millilitri fissata in una pompa a siringa con un tubo capillare lungo da 0,5 a un metro. Quindi, utilizzare il telaio stereotassico per posizionare la punta dell'ago nella posizione di partenza desiderata all'interno del cervello. Posizionare la fotocamera in modo da visualizzare la parte superiore della sonda elettronica a rete all'interno dell'ago di vetro.

Avviare il flusso impostando la pompa a siringa a bassa velocità e premendo start. Aumentare lentamente la portata se la sonda elettronica a rete non si muove all'interno dell'ago. Quando la sonda elettronica mesh inizia a muoversi all'interno dell'ago, utilizzare il telaio stereotassico per ritrarre l'ago alla stessa velocità con cui viene iniettata la sonda elettronica mesh utilizzando la posizione originale contrassegnata dell'elettronica mesh come guida.

Continua a far scorrere la soluzione salina e a ritrarre l'ago fino a quando l'ago non è uscito dal cranio. Quindi, interrompere il flusso dalla pompa a siringa. In questa procedura, utilizzare il telaio stereotassico per guidare con cura l'ago verso il substrato di bloccaggio del cavo piatto e flessibile attraverso lo spazio, facendo scorrere la soluzione con la pompa a siringa per generare un gioco nelle interconnessioni elettroniche a rete.

Una volta che l'ago si trova sopra il substrato di serraggio e attraverso lo spazio, riprendere il flusso a una velocità elevata per iniettare l'input dell'elettronica della rete, i pad di uscita sul substrato di bloccaggio. Utilizzando una pinzetta e una pipetta di acqua deionizzata, piegare i pad di input e output a un angolo di 90 gradi il più vicino possibile al primo pad di input e out. Una volta che i pad di ingresso e di uscita sono allineati e piegati e con un angolo di 90 gradi rispetto allo stelo della rete, asciugarli in posizione con aria compressa che scorre delicatamente.

Tagliare il substrato di serraggio su un bordo stretto a circa 0,5-un millimetro dal bordo delle piazzole di ingresso e uscita. Inoltre, tagliare le parti estranee del substrato di serraggio che ostacoleranno l'inserimento nel connettore zif a 32 canali montato su PCB. Quindi, inserire i pad di ingresso e uscita nel connettore zif sul PCB e chiudere il fermo.

Utilizzare l'elettronica di misurazione per misurare l'impedenza tra i canali e la vite di messa a terra per confermare la corretta interfaccia. Se i valori di impedenza sono troppo alti, sbloccare il connettore zif, regolare l'inserimento e ripetere il test fino a quando non viene confermato il collegamento riuscito. Successivamente, coprire il connettore zif e le interconnessioni elettroniche a rete esposta con cemento dentale per protezione.

Capovolgere il PCB in corrispondenza della fessura nel substrato e fissare il PCB con del cemento sul cranio del topo. Per registrazioni in movimento libero, rilasciare il mouse dal fermo dopo aver inserito il preamplificatore PCB e messo a terra la vite di riferimento. Registrare per il periodo di tempo desiderato utilizzando il sistema di acquisizione dati mentre il mouse si comporta liberamente.

Qui sono mostrate le mappe di calore rappresentative del campo locale dalle sonde elettroniche a 32 canali iniettate nell'ippocampo del topo e nella corteccia somatosensoriale. I dati sono stati registrati mentre il topo esplorava liberamente la sua gabbia a due mesi e quattro mesi dopo l'iniezione. L'ampiezza del potenziale di campo locale è codificata a colori in base alla barra dei colori a destra.

Le tracce del filtro passa-alto, nere, che mostrano l'attività di picco sono sovrapposte allo spettrogramma per ciascuno dei 32 canali. Di seguito sono riportati i picchi isolati dopo l'ordinamento dei dati tracciati. L'attività di spiking di una singola unità è stata rilevata su 26 dei 32 canali, sia due mesi dopo l'iniezione che quattro mesi dopo l'iniezione.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di testare l'interfaccia I/O per confermare il corretto collegamento elettrico alla sonda elettronica mesh. L'impedenza di misura aiuta a risolvere l'origine di eventuali problemi ed è fondamentale per identificare i problemi con l'interfacciamento o la fabbricazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire l'istologia per studiare l'ambiente cellulare attorno a ciascun elettrodo registrato.

A differenza delle sonde cerebrali rigide convenzionali, l'elettronica a rete può essere lasciata nel tessuto durante l'istologia, rendendo possibile correlare con precisione i dati elettrofisiologici con l'analisi immunoistochimica.