Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e l'analisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato

Questo metodo consente agli studenti universitari di purificare rapidamente i metalloenzimi leganti il ferro e quindi utilizzare quella proteina per rispondere a domande chiave sulla struttura e la funzione, il tutto entro i confini del laboratorio didattico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è applicabile agli enzimi non leganti il ferro eme. È accessibile agli studenti universitari ed è facilmente implementabile nel laboratorio didattico.

Per iniziare questa procedura, procurarsi una colonna di 1,5 x 20 centimetri dotata di un'uscita luer lock, un tappo superiore che contiene anche un raccordo luer lock e un supporto del letto inferiore per trattenere le particelle di resina. Montare il raccordo luer lock inferiore con un rubinetto di arresto per controllare il flusso. Successivamente, procurati una bottiglia contenente il 50% di resina di acido nitriloacetico legata al nichel e il 20% di etanolo precedentemente conservato a quattro gradi Celsius.

Agitare delicatamente il flacone per risospendere uniformemente la resina. Lavorando a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta graduata per prelevare due millimetri di impasto e trasferirlo nella colonna. Dopo che la soluzione di conservazione in eccesso è defluita dalla resina, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere con cura almeno 30 millilitri di tampone legante per lisi raffreddata, assicurandosi di non disturbare la superficie della resina.

Far scorrere il tampone lungo le pareti della colonna per evitare schizzi. Equilibrare la resina lasciando che il tampone scarichi lentamente dalla colonna per gravità in un becher di raccolta. Per iniziare, preparare la colonna di nichel-NTA per l'aggiunta degli estratti grezzi privi di cellule aprendo il rubinetto di arresto e lasciando che il tampone legante la lisi rimanente dreni per gravità attraverso la resina di nichel-NTA.

Quando il tampone è completamente scaricato e la superficie della resina è esposta, chiudere il rubinetto. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur per pipettare con cura gli estratti grezzi privi di cellule sulla resina, facendo attenzione a non disturbare la superficie. Far scorrere gli estratti di greggio lungo la parete della colonna per evitare schizzi.

Dopo che tutti gli estratti grezzi sono stati trasferiti nella colonna, aprire il rubinetto in modo che la colonna possa drenare per gravità. Raccogliere 100 microlitri di flusso continuo per un'analisi successiva. Utilizzare un breve tratto di tubo di plastica per collegare una siringa luer lock da 10 millilitri al tappo della colonna.

Estrarre lo stantuffo della siringa e quindi riempire saldamente il tappo della colonna sulla parte superiore della colonna. Comprimere delicatamente lo stantuffo mentre si raccoglie l'eluente in un cilindro graduato per valutare manualmente la portata. Dosi comprese tra uno e due millilitri al minuto sono compatibili con la resina e la configurazione sperimentale.

Aumentare delicatamente la compressione dello stantuffo della siringa man mano che la velocità del flusso rallenta. Quando il menisco del liquido applicato raggiunge da cinque a 10 millilitri sopra il letto di resina, rimuovere il tappo della colonna e la pompa manuale collegata per evitare l'introduzione di aria nella resina. Lasciare scolare il volume rimanente per gravità.

Dopo che gli estratti grezzi hanno terminato il drenaggio e la superficie della resina è stata nuovamente esposta, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere con cura circa 30 millilitri di tampone di lavaggio refrigerato alla colonna, facendo attenzione a non disturbare la superficie della resina. Aprire il rubinetto e far defluire il tampone di lavaggio attraverso la colonna. Mentre la colonna è in fase di drenaggio, etichettare 16 provette per microcentrifuga per la raccolta delle frazioni.

Quando il tampone è completamente scaricato e la superficie della resina è nuovamente esposta, chiudere il rubinetto. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere con cura circa 30 millilitri di tampone di eluizione raffreddato alla colonna, facendo attenzione a non disturbare la superficie della resina. Quindi, aprire lentamente il rubinetto per consentire al tampone di eluizione di eluire la proteina marcata con poliistidina dalla colonna.

Raccogliere un millilitro di eluente in ciascuna delle provette per microcentrifuga contrassegnate. Dopo aver testato le proteine, combinare le frazioni contenenti proteine in una provetta conica pulita. Procedere con una ricostituzione del cofattore di ioni metallici, oppure congelare la proteina in aliquote da tre millilitri a meno 80 gradi Celsius.

Per iniziare la ricostituzione del metallo, mettere su ghiaccio un'aliquota di tre millilitri dell'enzima purificato, sospesa in tampone di eluizione. Utilizzando il volume di proteine nella provetta, calcolare la quantità di ascorbato di sodio e ditiotreitolo necessari in modo tale che la concentrazione finale di ciascuno sia di 12,5 millimolari nel campione. Aggiungere l'ascorbato di sodio solido e il ditiotreitolo e mescolare delicatamente ma accuratamente per sciogliere completamente.

Batti alcuni granuli da un millilitro di solfato di ferro solido eptaidrato su un pezzo di carta da pesare. Piega la carta sul granulo e schiacciala con il lato piatto di una spatola di metallo. Aggiungere un granello della polvere risultante nel tubo contenente la soluzione proteica.

Vortice da mescolare, ottenendo un colore rosato. Tappare la provetta e incubare la soluzione rosa con ghiaccio per un periodo compreso tra 10 e 30 minuti. Il colore rosa sbiadirà nel tempo.

Per la filtrazione su gel, utilizzare una colonna di filtrazione su gel confezionata con 10 millilitri di gel di poliacrilammide sferico in una colonna di 1,5 x 12 centimetri, anch'essa dotata di un serbatoio da 10 millilitri. Quindi equilibrare la colonna come descritto nel protocollo di testo. Quando il tampone è stato scaricato dalla colonna e il supporto del letto superiore è esposto, chiudere il rubinetto.

Pipettare la soluzione da tre millilitri di metalloenzima ferro due ricostituito sul supporto del letto superiore esposto. Aprire il rubinetto e lasciare che l'intero campione da tre millilitri entri nella colonna per gravità. Scartare i primi tre millilitri di eluente.

Qualsiasi colore rosa che si forma durante la manipolazione della soluzione verrà intrappolato nella parte superiore della colonna. Quando la colonna ha smesso di gocciolare e il supporto del letto superiore è esposto, aggiungere quattro millilitri del tampone di filtrazione su gel e raccogliere quattro millilitri di eluente su frazioni di 8,5 millilitri. Dopo aver combinato le frazioni contenenti proteine, procedere con il saggio o la conservazione del campione come indicato nel protocollo di testo.

In questo studio, gli studenti hanno purificato e successivamente ricostituito una diossigenasi legante il ferro non eme marcata con poliistidina. L'analisi SDS-PAGE mostra che la proteina marcata viene purificata in modo efficace. Qui sono mostrati i dati di attività raccolti dagli studenti sull'azione enzimatica della L-dopa diossigenasi purificata dopo la ricostituzione con ferro due e la successiva filtrazione su gel.

Il ritardo di cinque secondi prima dell'inizio della raccolta dei dati è tipico degli studenti che eseguono questa tecnica per la prima volta. Il test allo stato stazionario indica che i parametri cinetici, determinati adattando le curve di avanzamento, sono coerenti con i risultati pubblicati. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che più ferro non è meglio, poiché troppo ferro causerà la precipitazione delle proteine.

Le concentrazioni di ferro in eccesso da tre a cinque molari della proteina sono sufficienti. Seguendo questa procedura, gli studenti possono eseguire ulteriori esperimenti per misurare la struttura della soluzione, esaminare la chimica enzimatica o dipendente dal substrato, il tutto per rispondere a ulteriori domande sul meccanismo di reazione.