Name: Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e lanalisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Impara a purificare metalloenzimi ferro-leganti mediante cromatografia di affinità del metallo immobilizzato e a ricostituire il cofattore metallico per analizzarne la struttura e la funzione in un contesto didattico universitario.

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Questa pubblicazione si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Grant No.  CHE 1708237.

1. preparazione per la depurazione
<ol><li>Preparazione dell'estratto senza cellula grezzo<ol>
<li>Ottenere un pellet di cellulare ~ 9-10 g di e. coli (BL21) che overexpressed la polyhistidine etichettate metalloproteina25 in una provetta conica da 50 mL.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL per grammo di buffer di lisi temp/bind camera (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazolo 10 mM a pH 8) il ~ 9-10 g di pellet cellulare per un volume totale di ~ 45-50 mL. Periodicamente il vortice per favorire la dissoluzione. Se il pellet è stato congelato, scongelare in un bagno di acqua tiepida.</li>
		<li>Usando il bagno di acqua ghiacciata, chill la sospensione cellulare a ~ 3 ° C in preparazione per lisi cellulare. Nota: A questo punto, la lisi delle cellule mediante sonicazione, fresatura perlina o un altro metodo sono possibile. Fresatura della perla è dimostrato qui perché è rapido, relativamente poco costoso e non necessita di una protezione acustica.</li>
		<li>Assemblare una perlina di 50ml fresatura camera secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Pimento della camera del mulino di perlina mezzo pieno di refrigerati 0,1 mm perline di vetro che sono stati conservati a-20 ° C.</li>
		<li>Riempire il resto della camera con la sospensione di cella refrigerata e utilizzare buffer di lisi/bind di 4 ° C per riempire completamente la camera.</li>
		<li>Utilizzare una piccola spatola per ruotare l'albero del mulino perlina e mescolare la sospensione cellulare con le perline.</li>
		<li>Rimuovere qualsiasi grandi bolle con una pipetta e poi avvitare il coperchio.</li>
		<li>Asciugare la camera da eventuali perdite.</li>
		<li>Aggiungere circa 1 tazza di ghiaccio alla giacca chiara, plastica, invertire la camera riempita 50 mL in pieno di ghiaccio giacca e stringi la vite.</li>
		<li>Fissare la guaina di ghiaccio camera sul motore.</li>
		<li>Girare il mulino perlina motore su per 15 secondi a 15.800 giri, poi lasciar per riposare per 45 secondi. Ripetere 8 volte.</li>
		<li>Quando l'8 cicli sono completi, decantare la sospensione di lisi delle cellule intere in un 50 mL o tubo di diametro maggiore nominale per centrifugazione ad alta velocità (25.000 x g o superiore). Inserire una coppia di tubi equilibrati nella centrifuga e spin a 25.000 x g per 40-45 minuti a 4° C a pellet cellulare detriti e perline in vetro. Nota: Se non sono disponibili 50 mL o più grandi tubi voto per centrifugazione ad alta velocità, rimuovere i branelli di vetro mediante centrifugazione a 1000-2000 x g per 2-3 min in una provetta conica 50 mL per produrre un più piccolo volume di sospensione cellulare (~ 25 mL) che può essere travasato in un più piccolo volum tubo e valutato per centrifugazione ad alta velocità.</li>
		<li>Al termine della centrifugazione, decantare il chiaro, giallo, senza cellula, gli estratti del grezzo in una provetta conica pulito 50 mL. Fare attenzione a non per trasferire eventuali detriti cellulari.</li>
		<li>Raccogliere un piccolo campione degli estratti senza cellula grezzi per un'analisi successiva della purificazione da SDS-PAGE26.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione della colonna IMAC<ol>
<li>Ottenere una colonna di 1,5 x 20 cm dotato di un supporto inferiore del letto a trattenere particelle di resina, un'uscita Luer lock e un tappo superiore che contiene anche un raccordo Luer lock. Entra nella presa di attacco Luer-lock con un rubinetto per controllare il flusso.</li>
		<li>Lavora presso il benchtop, fissare la colonna su un basamento di anello.</li>
		<li>Ottenere un impasto di 50% di nichel-associazione nitriloacetic acido resina (Ni-NTA) in etanolo al 20% che sia stata conservata a 4 ° C.</li>
		<li>Agitare delicatamente il flacone per risospendere uniformemente la resina.</li>
		<li>Lavorando a temperatura ambiente e sul banco, uso depositato una pipetta graduata per aspirare 2 mL del liquame, che produrrà 1 mL di resina in grado di legare il 50-60 mg di polyhistidine etichettato proteine e trasferire i residui nella colonna.</li>
		<li>Aprire il rubinetto e lasciare che la soluzione di stoccaggio in eccesso di scarico per gravità dalla resina.</li>
		<li>Chiudere il rubinetto in modo sicuro</li>
		<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere con cautela il buffer di lisi refrigerati/bind (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazolo 10 mM a pH 8) e alla colonna di resina – almeno 30 mL. Fare attenzione a non per disturbare la superficie della resina. Eseguire il buffer giù le pareti della colonna per evitare schizzi.</li>
		<li>Equilibrare la resina consentendo il buffer di lisi/bind lentamente dalla colonna di scarico per gravità in un becher di raccolta.</li>
		<li>Quando il buffer di lisi/bind per la maggior parte ha drenato, chiudere il rubinetto per fermare il flusso del buffer quando ~ 5 mL di tampone di lisi rimane sopra la resina e lasciare la colonna, montata in posizione eretta, fino al momento di procedere o per fino a 1 settimana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificazione di Polyhistidine-etichetta Target di IMAC
<ol><li>Preparare il tampone di lavaggio (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo pH 8) e tampone di eluizione (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazolo 250 mM, pH 10% glicerolo 8). Raffreddare a 4° C.</li>
	<li>Preparare la colonna Ni-NTA per l'aggiunta degli estratti senza cellula greggi aprendo il rubinetto e consentendo restanti buffer di lisi/associazione di scarico per gravità attraverso la resina Ni-NTA. Quando tutto il buffer è vuoto, e la superficie della resina è esposto, chiudere il rubinetto.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, attentamente dispensare il greggio gratis cellulare estrae sulla resina, facendo attenzione a non per disturbare la superficie. Eseguire gli estratti grezzi lungo le pareti della colonna per evitare schizzi. Il volume degli estratti grezzi applicato è dipenda dal livello di espressione della proteina polyhistidine-etichetta; garantire il volume totale degli estratti grezzi contiene 50-60 mg o meno della proteina per mL di resina Ni-NTA (Vedi punto 1.2.4).</li>
	<li>Quando tutti gli estratti grezzi sono stati trasferiti alla colonna, è necessario aprire il rubinetto così la colonna può scarico per gravità. Questo flusso attraverso è composto di proteine che non ha fatto associare alla resina – raccogliere 100 μL per un'analisi successiva della purificazione mediante SDS-PAGE. 26
</li>
	<li>La viscosità degli estratti senza cellula grezzi può rallentare notevolmente il flusso di gravità della colonna. Per aumentare la velocità del flusso, applicare un semplice "pompa a mano":<ol>
<li>Prendere una siringa 10 mL Luer-lock e collegarlo al tappo della colonna utilizzando un breve tratto di tubazione di plastica e raccordi Luer lock tra il tappo di colonna e la siringa. Disegnare lo stantuffo della siringa e quindi fissare strettamente il tappo di colonna nella parte superiore della colonna.</li>
		<li>Comprimere delicatamente lo stantuffo della siringa mentre manualmente valutare il tasso di flusso attraverso la raccolta di eluente in un cilindro graduato; tariffe di 1-2 mL al minuto sono compatibili con la resina e il programma di installazione. Delicatamente aumentare compressione del pistone della siringa in quanto rallenta la velocità di flusso.</li>
		<li>Per evitare l'introduzione di aria nella resina, togliere il tappo di colonna e collegato la pompa a mano quando il menisco del liquido applicato raggiunge il 5-10 mm sopra il letto di resina e consentire il volume residuo di scarico per gravità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando estratti grezzi libero delle cellule hanno finito drenante e la superficie della resina viene esposto nuovamente, è possibile utilizzare una pipetta Pasteur attentamente aggiungere ~ 30 mL di tampone di lavaggio refrigerato alla colonna – facendo attenzione a non per disturbare la superficie della resina. Eseguire il buffer giù le pareti della colonna per evitare schizzi.</li>
	<li>Aprire il rubinetto e permettere al tampone di lavaggio di defluire attraverso la colonna. Questo processo è rimozione proteine debolmente limitati dalla resina. Scartare l'eluente.</li>
	<li>Mentre il tampone di lavaggio è drenante, sedici anni, preparare provette microcentrifuga per la raccolta di frazioni di 1 mL.</li>
	<li>Quando il tampone di lavaggio è vuoto, e la superficie della resina viene esposto nuovamente, chiudere il rubinetto. Utilizzare una pipetta di Pasteur attentamente aggiungere ~ 30 mL di tampone di eluizione refrigerate alla colonna – facendo attenzione a non per disturbare la superficie della resina. Eseguire il buffer giù le pareti della colonna per evitare schizzi.</li>
	<li>Aprire lentamente il rubinetto e permettere al tampone di eluizione eluire la proteina di polyhistidine contrassegnati dalla colonna. Raccogliere 1 mL di eluente in ciascuna delle provette microcentrifuga contrassegnato, da 1 a 16.</li>
	<li>Testare le frazioni per proteina usando un'analisi colorimetrica della proteina come l'analisi di Bradford o spettroscopia UV-visibile secondo i metodi specifici di reagente e/o strumento Produttore27,28. Come illustrato di seguito, il saggio colorimetrico utilizzando blu di Coomassie è ridotta a un volume di 100 μL per sacrificare solo un piccolo volume da ogni frazione.</li>
	<li>Mix 3 μL di ogni frazione con 100 µ l di una proteina colorimetrica dosaggio reagenti e manualmente osservare la formazione di qualsiasi colore per indicare la presenza di proteina nella frazione; rilevamento con uno spettrometro non è necessario.</li>
	<li>Se proteina si trova in frazione 16, continuare a eluizione di frazioni di 1 mL e analisi per la proteina periodicamente, fino a quando le frazioni eluite non contengono una notevole quantità di proteine.</li>
	<li>Combinare le frazioni contenenti proteine in una provetta pulita e prelevare un campione di 100 μL per un'analisi successiva da SDS-PAGE26.</li>
	<li>Procedere con la ricostituzione del cofattore ione metallico o congelare la proteina in aliquote di mL 3 a-80 ° C. Assicurare quel 10% glicerolo è incluso nell'eluizione buffer è un crioprotettore per stabilizzare la proteina pura durante il congelamento.</li>
	<li>Quando eluizione della colonna Ni-NTA è completa, vale a dire tutte le proteine sono spento la colonna e raccolti in frazioni, passare un altro 25 mL di tampone di eluizione attraverso la colonna e memorizzare la colonna a 4 ° C in ~ 5 mL di tampone di eluizione per la conservazione a breve termine , o buffer di lisi/bind con etanolo al 20% per l'archiviazione a lungo termine.</li>
</ol>3. la ricostituzione della proteina bersaglio con Fe2 +
<ol><li>Aggiunta di Fe2 + Nota: Un ferro non-eme (II) associazione degli enzimi, come la l-dopa diossigenasi in questo esempio, richiede un ione Fe2 + per attività; Tuttavia, il ferro (II) si ossida facilmente a ferro (III), che è inattivo, e una frazione della proteina purifica senza qualsiasi ferro a tutti.<ol>
<li>Per iniziare la ricostituzione del metallo, ottenere 3 mL dell'enzima purificato sospesa in tampone di eluizione. Se congelato, scongelare rapidamente usando un bagno di acqua tiepida e una volta scongelati, mettere la proteina sul ghiaccio.</li>
		<li>Utilizzando il volume della proteina nel tubo, calcolare la quantità di ascorbato di sodio (198.1 g/mol) necessaria per rendere la concentrazione finale 12,5 mM nel campione. Inoltre, calcolare la quantità di ditiotreitolo (DTT, 154.25 g/mol) necessaria per rendere la concentrazione finale 12,5 mM nel campione.</li>
		<li>Aggiungere l'ascorbato di sodio solido e DTT e delicatamente, ma a fondo, mescolare per sciogliere completamente. Fare attenzione a non per causare precipitazione della proteina con miscelazione eccessivamente aggressivo. Aggiungere una piccola quantità di ferro (II) solfato eptaidrato (MW 278.01 g/mol) per il campione della proteina.</li>
		<li>Al fine di ottenere una quantità abbastanza piccola del rubinetto salata, Ferro 1 pochi millimetri granuli di FeSO4•7H2O solido fuori su un pezzo di pesano la carta, piegare la carta sopra il granulo e schiacciano con la parte piatta di una spatola di metallo.</li>
		<li>Aggiungere un granello di polvere risultante al tubo della proteina.</li>
		<li>Vortice di mescolare e un colore rosa rosato apparirà nel tubo.</li>
		<li>Incubare la soluzione rosa della proteina, il limite massimo, per 10-30 minuti sul ghiaccio. Il colore rosa si sbiadirà lentamente nel tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gel filtrazione<ol>
<li>Utilizzare una colonna di gel filtrazione imballata con 10 mL di gel di poliacrilammide sferico con un limite di esclusione del peso molecolare di circa 6.000 e una gamma di dimensione di particella idratata di 90 – 180 µm in una colonna di 1.5 x 12 cm, che è anche dotata di un serbatoio da 10 mL. Garantire la colonna è dotata di inferiore e letto superiore supporta sottoforma di 30 dischi di Umm in polietilene per mantenere la resina nella colonna e prevenire il letto di resina dal funzionamento a secco. Montare la colonna di gel filtrazione per uno stand di anello.</li>
		<li>Se si utilizza una colonna di filtrazione gel pre-confezionati, rimuovere il tappo e versare il tampone in eccesso sopra il supporto del letto superiore.</li>
		<li>Per equilibrare la colonna, iniziare a riempire il serbatoio con tampone compatibile con successiva analisi e archiviazione, ad esempio, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolo pH 8.0.</li>
		<li>Se si utilizza una colonna di filtrazione gel pre-confezionati, scattare fuori la punta inferiore della colonna di gel filtrazione per avviare il flusso del buffer ed esporre il raccordo scorrevole Luer. Montare un rubinetto per la fine di slittamento di Luer della colonna, ma lasciarla aperta e consentire la colonna a gocciolare dalla forza di gravità.</li>
		<li>Quando il buffer è vuoto dalla colonna e il supporto del letto superiore è esposta, chiudere il rubinetto e aggiungere i ~ 3 mL di metalloenzimi il Fe (II) ricostituito nella colonna pipettando la soluzione sul supporto letto superiore esposta.</li>
		<li>Aprire il rubinetto e lasciare il campione intero 3,0 mL immettere la colonna dalla forza di gravità. Eliminare questi primi 3 mL di eluente. Qualsiasi colore rosa che si forma durante la manipolazione la soluzione sarà intrappolato nella parte superiore della colonna.</li>
		<li>Quando la colonna ha smesso di gocciolamento e il supporto del letto superiore è esposta, è possibile aggiungere 4 mL di tampone gel-filtrazione (ad es., 50mm NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolo pH 8.0) alla colonna. Aprire il rubinetto e raccogliere l'eluente in microcentrifuga su otto frazioni di 0,5 mL.</li>
		<li>Testare le frazioni per proteina usando un'analisi colorimetrica della proteina o UV-Vis27,28 , come descritto in precedenza.</li>
		<li>Combinare le frazioni contenenti proteine.</li>
		<li>Prelevare un campione per analisi di SDS-PAGE26.</li>
		<li>Procedere con l'analisi o la conservazione del campione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Mentre l'aggiunta di tag di polyhistidine da proteine ricombinanti e loro purificazione di IMAC è diventato praticamente onnipresente in letteratura biochimica3,4,5, applicazioni di IMAC alla purificazione degli enzimi nella biochimica laboratorio didattico rimangono sparse, e metodi pubblicati non considerano sempre le limitazioni di risorse dell'insegnamento laboratorio20. Inoltre, l'utilizzo di IMAC nel laboratorio didattico è più efficace se utilizzato insieme agli esperimenti che valutare attività e purezza, rendendo la purificazione di IMAC di un enzima un'attività didattico ideale. Al fine di estendere l'applicazione di IMAC per la purificazione degli enzimi, compreso metalloenzymes, presso il laboratorio di insegnamento, sono necessari metodi affidabili ed economici. In questo protocollo, dimostriamo benchtop IMAC utilizzando forniture laboratorio prontamente disponibili e poco costoso, affrontando anche le limitazioni nell'applicazione di IMAC a metalloproteine22, ricostituendo il ferro (II) dipendente metalloenzimi, l-dopa diossigenasi, postare purificazione. Utilizzando i reagenti e i materiali descritti, si stima che il costo dei materiali di consumo per otto gruppi di studenti è tra 500-600 dollari a semestre per eseguire questo protocollo, compresa la procedura di analisi descritta in Figura 1 e Figura 2.
A causa della facilità con cui Fe2 + possibile dissociare dall'aminoacido ligandi24 e la facile ossidazione del Fe2 + di O2 di Fe3 +, ricostituzione del non-eme, aminoacido chelato ferroso in un metalloenzimi ricombinante è un componente tipico della purificazione enzimatica. Quando viene utilizzata la cromatografia classica, è possibile evitare la perdita totale di ferro in alcuni casi32, ma più spesso, il ferro (II) è aggiunto indietro in presenza di agenti riducenti33,34,35, 36 spesso sotto un'atmosfera anaerobica37,38,39e in alcuni casi il ferro in eccesso non è rimosso33,34,36, che complica qualsiasi analisi successiva. Passaggi consecutivi di cromatografia classica e un'atmosfera anaerobica non sono realistici per il laboratorio dello studente non laureato, che richiede lo sviluppo di questo protocollo.
Mentre la preparazione manuale della colonna Ni-NTA e trattamento dei campioni in gran parte dalla forza di gravità prendere ulteriore tempo e fatica quando rispetto alle colonne pre-confezionate e automatizzato di strumentazione di cromatografia, la procedura manuale consentono hands-on apprendimento dello studente che si traducono in una maggiore comprensione della scienza dietro il processo. L'aggiunta di un sale di ferro (II) nelle condizioni descritte qui è particolarmente sensibile all'eccesso ditiotreitolo. Se uno studente aggiunge erroneamente un eccesso di ditiotreitolo, un evento di precipitazione è probabile. Abbiamo trovato utile richiedono agli studenti di eseguire calcoli delle quantità di reagente prima di arrivare in laboratorio, in modo tempo di laboratorio può essere utilizzato più efficacemente al banco. La purificazione di IMAC benchtop intera - da lisi cellulare per eluizione proteina - può essere realizzata in un periodo di 4 ore di laboratorio, seguita dall'analisi e ricostituzione in un periodo di laboratorio successive.

I primi rapporti della purificazione di una proteina di polyhistidine contrassegnati dagli estratti di un organismo ospite tramite chelazione del tag istidina da un metallo immobilizzato entrò la letteratura nel 19881,2. Da quel momento, l'aggiunta di tag di polyhistidine da proteine ricombinanti e loro purificazione dalla cromatografia di affinità immobilizzata di metallo (IMAC) sono diventati praticamente onnipresenti in letteratura biochimica3,4, 5. Metodi di purificazione di IMAC possono essere implementati sul banco, mediante cromatografia automatizzato e in formati di spin-colonna. Mentre metodi di purificazione di affinità, soprattutto IMAC, sono ampiamente utilizzati nei laboratori di ricerca, sono meno comuni nel laboratorio di insegnamento universitario. I libri di testo di laboratorio più ampiamente usato per il laboratorio di biochimica non ordinariamente insegnare questi metodi, optando invece per scambio ionico più tradizionale o tintura-associazione cromatografia6,7,8 , 9. ad esempio, la purificazione del lattato deidrogenasi di Anderson10 utilizza affinità colorante-legandosi e la purificazione di latte bovino α-lattalbumina7,11 da Boyer utilizza un nichel-nitriloacetic matrice di acido, ma nessun tag ricombinante poli-istidina, affidandosi invece all'intrinseca affinità della proteina per la resina. Alcune pubblicazioni e libri di testo moderno laboratorio dello studente non laureato implementare cromatografia di affinità del metallo immobilizzati su bersagli proteici poli-istidina taggato come verde o rosso fluorescente proteine12,13, 14,15, anticorpi16ed enzimi selezionati17,18,19,20, anche alcuni di funzione sconosciuta21. Senza dubbio, la purificazione di un enzima è preferibile nel laboratorio di insegnamento, perché la destinazione possa essere analizzata per attività nelle sessioni successive, arricchendo l'esperienza di "vera scienza" da parte dello studente; Infatti, questi tipi di esperienze di laboratorio sono stati pubblicati e risultati utili su apprendimento degli studenti segnalati17,18,20,21. E ancora, le applicazioni di IMAC alla purificazione degli enzimi nella biochimica insegnamento laboratorio rimangono sparse, e i metodi pubblicati possono presumere anche accesso alla strumentazione di cromatografia che non è in genere disponibile per utilizzare nel laboratorio di aula 20. ci sono anche limitazioni nell'applicazione di IMAC di metalloproteine, specialmente quelli che legano i metalli bivalenti redox-sensibili che sono essenziali per attività22. Spesso, lo ione metallico è perso o ossidato durante purificazione producendo un enzima inattivo mal si adatta al laboratorio dello studente non laureato.
Un terzo degli enzimi legano ioni metallici i23, e nonostante un requisito quasi universale di ferro in tutte le forme di vita23, Ferro da stiro è senza dubbio tra i più problematici ioni metallici in enzimologia. Non-eme Fe2 + associazione enzimi sono particolarmente inclini a perdita e/o ossidazione del metallo durante IMAC; presumibilmente a causa della mancanza di un legante organico dedicato come heme e la facilità con cui Fe2 + possibile dissociare dall'aminoacido ligandi24. Inoltre, l'ossidazione di ossigeno dipendente di Fe2 + a Fe3 + è spontanea in soluzione acquosa, dovuto la variazione negativa di energia libera e la relativa stabilità del Fe3 +. Spesso, queste sfide sono superate mediante utilizzo di metodi cromatografici di atmosfera e/o non-IMAC anaerobica22. In questo articolo, dimostreremo l'uso di benchtop IMAC per purificare il Fe2 + dipendente metalloenzimi l-dopa diossigenasi utilizzando forniture di cromatografia semplice, poco costoso, seguite dalla ricostituzione del sito attivo Fe2 +, e analisi enzimatica. Questi metodi sono standard nel nostro laboratorio di biochimica dello studente non laureato di gruppi di 6-12 studenti e possono essere utilizzati per ampliare il repertorio delle indagini enzima a livello universitario.

<table><tbody><tr><td>materiali di</td><td></td><td></td><td></td>consumo</tr><tr><td>BeadBeater Perle di vetro da 0,1 mm Prodotti</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>1 libbra ciascuna</td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml con tappi a vite, sterili</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio, Acros monobasico</td><td>(Fisher)</td><td>AC42420-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>Acros (Fisher)</td><td>AC35268-1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Ditiotreitolo)</td> <td>Lab Scientific</td><td>D-115</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ferro (II) eptaidrato</td><td>Sigmaaldrich</td><td>310077</td><td></td></tr><tr><td>HisPur NiNTA Resin&nbsp;</td><td>Fisher (pierce)</td><td>PI88221</td><td></td></tr><tr><td>Colonne per cromatografia Econo-Column - 1,5 x 20 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1522&nbsp;</td><td>1,5 x 20 cm, 35 ml, 2ea,&nbsp;</td></tr><tr><td>Valvola di arresto, unidirezionale, da femmina a maschio luer</td><td>Kimble</td><td>420163-0000</td><td>Confezione da 50</td></tr><tr><td>siringhe luer-loc BD da 10 ml (non sterile, senza ago)</td><td>VWR</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo per tubi: da 1,6 mm Barb a femmina Luer</td><td>Biorad</td><td>7318222</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo per tubi: da 1,6 mm Barb a Luer maschio&nbsp;</td><td>Tubo</td> in silicone <td>Biorad 7318225</td><td></td></tr><tr><td>(1,6 mm ID/0,8 mm di parete, per 0,2-5 ml/min su pompa peristaltica)</td><td>Bio-Rad</td><td>7318211</td><td>Confezione da 1, 1,6 mm ID/0,8 mm di parete, 10 m, tubo a bassa pressione per la manipolazione di liquidi</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay</td><td>Thermo Scientitic</td><td>23236</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, tappo a scatto, 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche monouso in polistirene Fisher</td><td></td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per pipetta universale Fiserbrand</td><td>Fisher</td><td>14-955-110</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione Econo-Pac 10DG</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2010</td><td>scatola da 30</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE 5x tampone campione</td><td>Genscript</td><td>MB01015</td><td>5mL (diluire 1:5 con campione)</td></tr><tr><td>ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 pozzetti</td><td>Genscript</td><td>M42012</td><td>20 gel</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cuvette monouso, metaacrilato</td><td>Fisher</td><td>14-955-128&nbsp;</td><td>Cassa da 500</td></tr><tr><td>Tappi per cuvette quadrati usa e getta</td><td>Fisher</td><td>14-385-999</td><td></td></tr><tr><td>L-DOPA (3,4-diidrossifenilalanina)</td><td>Acros</td><td>D9628-5G</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura permanente:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera BeadBeater da 50 ml&nbsp;</td><td>BioSpec Products</td><td>110803-50SS</td><td>1 camera</td></tr><tr><td>BeadBeater</td><td>BioSpec Products</td><td>1107900-101</td><td>Camera in policarbonato da 350 ml, gruppo rotore, base motore, camicia di raffreddamento ghiaccio-acqua e una libbra di perle di vetro.</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, PPCO ad alta velocità, 50 ml</td><td>Fisher</td><td>3119-0050PK</td><td></td></tr><tr><td>Cella di elettroforesi verticale Tetra Mini-PROTEAN per gel prefabbricati, 4 gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>&nbsp; Sistema di elettroforesi verticale a 4 gel, include gruppo elettrodo, modulo di corsa compagno, serbatoio, coperchio con cavi di alimentazione, diga tampone per mini celle</td></tr><tr><td>Alimentatore PowerPac HC</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>100... 120/220&ndash; 240 V, alimentatore per applicazioni ad alta corrente, include cavo di alimentazione</td></tr><tr><td>UV-1800 con software UV-Probe</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Global Kinetic Explorer</td><td>Kintek Corp</td><td>versione 6</td><td>https://www.kintekexplorer.com/downloads/</td></tr></tbody></table>

benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e l'analisi di un polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobilizzato la cromatografia di affinità del metallo (IMAC), di polyhistidine etichettate proteine facilmente è masterizzata da studenti universitari ed è diventato il metodo di purificazione della proteina più ampiamente usato nella letteratura moderna. Ma, l'applicazione della cromatografia di affinità per proteine leganti metallici, soprattutto quelli con metalli sensibili redox come il ferro, è spesso limitata ai laboratori con accesso a un vano portaoggetti - attrezzature che non sono normalmente disponibile nella laurea laboratorio. In questo articolo, dimostriamo il nostro metodi di benchtop per isolamento, purificazione e ioni metallici la ricostituzione di una poli-istidina etichettata IMAC, associazione di ferro non-eme redox-attivo extradiol diossigenasi e il dosaggio di dioxygenase con substrato varia concentrazioni e saturazione dell'ossigeno. Questi metodi sono eseguiti da studenti universitari e implementati nel laboratorio di insegnamento e di ricerca dello studente non laureato con strumentazione che è accessibile e conveniente principalmente istituti universitari.

Questi risultati rappresentativi sono stati raccolti da studenti universitari come hanno eseguito questo protocollo durante due periodi di laboratorio del corso di BCM 341: biochimica sperimentale presso Muhlenberg College. Nella figura 1 viene illustrato i risultati della purificazione di un 20 kDa poli-istidina tagged metalloenzimi, l-dopa diossigenasi, interpretato da due studenti universitari durante un periodo di 4 ore aula laboratorio e analizzati da SDS-PAGE degli stessi studenti durante un periodo di laboratorio successive. La proteina di poli-istidina etichettata è efficacemente purificato (Figura 1, lane 2). Un immunoblot del gel usando anticorpo contro il tag di poli-istidina indica che una piccola quantità della proteina dell'obiettivo di poli-istidina etichettata è perso in flusso continuo (dati non mostrati), probabilmente perché la maggiore quantità di 100 mg di proteina bersaglio nella lisato ha superato la capacità di legame della resina.
Nella figura 2 viene illustrato come attività di studente-raccolti dati sulla reazione enzimatica del target taggati metalloenzimi poli-istidina, l-dopa diossigenasi, dopo ricostituzione con ferro (II) e successive di gel-filtrazione come descritto nel protocollo di nel presente documento. Il secondo cinque inizia tempo morto prima dei dati raccolti è tipico degli studenti l'esecuzione di questa tecnica per la prima volta. La robusta attività dei metalloenzimi è stata rilevata usando un'analisi pubblicata e ha reso i parametri cinetici allo steady-state coerenti con i risultati pubblicati29. Parametri cinetici allo steady-state sono stati determinati mediante raccordo il progresso curve30 mostrato in Figura 2; Tuttavia, minimi quadrati non lineari di tassi iniziali raccolti nel corso di una serie di concentrazioni nel substrato sono ugualmente possibili31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig1.jpg"> Figura 1. Analisi di26 SDS-PAGE di poli-istidina etichetta proteina prima, durante e dopo la purificazione. Corsie 1 - marcatori di peso molecolare, 2-purificato della proteina (20 kDa) post Ni-NTA, 3-Ni-NTA flusso attraverso, 4 lisi - cellulare gratis gli estratti grezzi prima della purificazione, 5 - detriti cellulari post del pellet. I campioni sono stati preparati utilizzando il buffer di caricamento del campione/5x e separati su gel di poliacrilammide prefabbricato 4-20% utilizzando un sistema di elettroforesi del gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58012/58012fig2.jpg"> Nella figura 2. Analisi di stato stazionario di ferro (II) ricostituito metalloenzimi (cioè, l-dopa diossigenasi, 10 µm) con substrato (l-dopa-5 µM (rosso), 25 µM (verde), 50 µM (blu)) nel tampone (fosfato di 50 mM, 200 mM NaCl, pH 8). Tracce raffigurano formazione prodotto presso 414nm. Dati di assorbanza continuamente sono stati acquisiti utilizzando le provette di metacrilato di 1 mL in una split-larghezza scansione UV-visibile spettrometro29. Dati grezzi sono adatti a un modello di Michaelis-Menten approssimazione dello stato stazionario (KM µM 30,8 ± 14.4, kgattoapparente 2.3 s-1 ± 0.05)30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58012/58012fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui presentiamo un protocollo per la purificazione di cromatografia di affinità metallo benchtop immobilizzato e successiva ricostituzione di un polyhistidine taggati, ferro non-eme associazione diossigenasi adatto per il laboratorio di insegnamento universitario.

Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e l'analisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Questo metodo consente agli studenti universitari di purificare rapidamente i metalloenzimi leganti il ferro e quindi utilizzare quella proteina per rispondere a domande chiave sulla struttura e la funzione, il tutto entro i confini del laboratorio didattico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è applicabile agli enzimi non leganti il ferro eme. È accessibile agli studenti universitari ed è facilmente implementabile nel laboratorio didattico.Per iniziare questa procedura, procurarsi una colonna di 1,5 x 20 centimetri dotata di un'uscita luer lock, un tappo superiore che contiene anche un raccordo luer lock e un supporto del letto inferiore per trattenere le particelle di resina. Montare il raccordo luer lock inferiore con un rubinetto di arresto per controllare il flusso. Successivamente, procurati una bottiglia contenente il 50% di resina di acido nitriloacetico legata al nichel e il 20% di etanolo precedentemente conservato a quattro gradi Celsius.Agitare delicatamente il flacone per risospendere uniformemente la resina. Lavorando a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta graduata per prelevare due millimetri di impasto e trasferirlo nella colonna. Dopo che la soluzione di conservazione in eccesso è defluita dalla resina, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere con cura almeno 30 millilitri di tampone legante per lisi raffreddata, assicurandosi di non disturbare la superficie della resina.Far scorrere il tampone lungo le pareti della colonna per evitare schizzi. Equilibrare la resina lasciando che il tampone scarichi lentamente dalla colonna per gravità in un becher di raccolta. Per iniziare, preparare la colonna di nichel-NTA per l'aggiunta degli estratti grezzi privi di cellule aprendo il rubinetto di arresto e lasciando che il tampone legante la lisi rimanente dreni per gravità attraverso la resina di nichel-NTA.Quando il tampone è completamente scaricato e la superficie della resina è esposta, chiudere il rubinetto. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur per pipettare con cura gli estratti grezzi privi di cellule sulla resina, facendo attenzione a non disturbare la superficie. Far scorrere gli estratti di greggio lungo la parete della colonna per evitare schizzi.Dopo che tutti gli estratti grezzi sono stati trasferiti nella colonna, aprire il rubinetto in modo che la colonna possa drenare per gravità. Raccogliere 100 microlitri di flusso continuo per un'analisi successiva. Utilizzare un breve tratto di tubo di plastica per collegare una siringa luer lock da 10 millilitri al tappo della colonna.Estrarre lo stantuffo della siringa e quindi riempire saldamente il tappo della colonna sulla parte superiore della colonna. Comprimere delicatamente lo stantuffo mentre si raccoglie l'eluente in un cilindro graduato per valutare manualmente la portata. Dosi comprese tra uno e due millilitri al minuto sono compatibili con la resina e la configurazione sperimentale.Aumentare delicatamente la compressione dello stantuffo della siringa man mano che la velocità del flusso rallenta. Quando il menisco del liquido applicato raggiunge da cinque a 10 millilitri sopra il letto di resina, rimuovere il tappo della colonna e la pompa manuale collegata per evitare l'introduzione di aria nella resina. Lasciare scolare il volume rimanente per gravità.Dopo che gli estratti grezzi hanno terminato il drenaggio e la superficie della resina è stata nuovamente esposta, utilizzare una pipetta Pasteur per aggiungere con cura circa 30 millilitri di tampone di lavaggio refrigerato alla colonna, facendo attenzione a non disturbare la superficie della resina. Aprire il rubinetto e far defluire il tampone di lavaggio attraverso la colonna. Mentre la colonna è in fase di drenaggio, etichettare 16 provette per microcentrifuga per la raccolta delle frazioni.Quando il tampone è completamente scaricato e la superficie della resina è nuovamente esposta, chiudere il rubinetto. Utilizzando una pipetta Pasteur, aggiungere con cura circa 30 millilitri di tampone di eluizione raffreddato alla colonna, facendo attenzione a non disturbare la superficie della resina. Quindi, aprire lentamente il rubinetto per consentire al tampone di eluizione di eluire la proteina marcata con poliistidina dalla colonna.Raccogliere un millilitro di eluente in ciascuna delle provette per microcentrifuga contrassegnate. Dopo aver testato le proteine, combinare le frazioni contenenti proteine in una provetta conica pulita. Procedere con una ricostituzione del cofattore di ioni metallici, oppure congelare la proteina in aliquote da tre millilitri a meno 80 gradi Celsius.Per iniziare la ricostituzione del metallo, mettere su ghiaccio un'aliquota di tre millilitri dell'enzima purificato, sospesa in tampone di eluizione. Utilizzando il volume di proteine nella provetta, calcolare la quantità di ascorbato di sodio e ditiotreitolo necessari in modo tale che la concentrazione finale di ciascuno sia di 12,5 millimolari nel campione. Aggiungere l'ascorbato di sodio solido e il ditiotreitolo e mescolare delicatamente ma accuratamente per sciogliere completamente.Batti alcuni granuli da un millilitro di solfato di ferro solido eptaidrato su un pezzo di carta da pesare. Piega la carta sul granulo e schiacciala con il lato piatto di una spatola di metallo. Aggiungere un granello della polvere risultante nel tubo contenente la soluzione proteica.Vortice da mescolare, ottenendo un colore rosato. Tappare la provetta e incubare la soluzione rosa con ghiaccio per un periodo compreso tra 10 e 30 minuti. Il colore rosa sbiadirà nel tempo.Per la filtrazione su gel, utilizzare una colonna di filtrazione su gel confezionata con 10 millilitri di gel di poliacrilammide sferico in una colonna di 1,5 x 12 centimetri, anch'essa dotata di un serbatoio da 10 millilitri. Quindi equilibrare la colonna come descritto nel protocollo di testo. Quando il tampone è stato scaricato dalla colonna e il supporto del letto superiore è esposto, chiudere il rubinetto.Pipettare la soluzione da tre millilitri di metalloenzima ferro due ricostituito sul supporto del letto superiore esposto. Aprire il rubinetto e lasciare che l'intero campione da tre millilitri entri nella colonna per gravità. Scartare i primi tre millilitri di eluente.Qualsiasi colore rosa che si forma durante la manipolazione della soluzione verrà intrappolato nella parte superiore della colonna. Quando la colonna ha smesso di gocciolare e il supporto del letto superiore è esposto, aggiungere quattro millilitri del tampone di filtrazione su gel e raccogliere quattro millilitri di eluente su frazioni di 8,5 millilitri. Dopo aver combinato le frazioni contenenti proteine, procedere con il saggio o la conservazione del campione come indicato nel protocollo di testo.In questo studio, gli studenti hanno purificato e successivamente ricostituito una diossigenasi legante il ferro non eme marcata con poliistidina. L'analisi SDS-PAGE mostra che la proteina marcata viene purificata in modo efficace. Qui sono mostrati i dati di attività raccolti dagli studenti sull'azione enzimatica della L-dopa diossigenasi purificata dopo la ricostituzione con ferro due e la successiva filtrazione su gel.Il ritardo di cinque secondi prima dell'inizio della raccolta dei dati è tipico degli studenti che eseguono questa tecnica per la prima volta. Il test allo stato stazionario indica che i parametri cinetici, determinati adattando le curve di avanzamento, sono coerenti con i risultati pubblicati. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare che più ferro non è meglio, poiché troppo ferro causerà la precipitazione delle proteine.Le concentrazioni di ferro in eccesso da tre a cinque molari della proteina sono sufficienti. Seguendo questa procedura, gli studenti possono eseguire ulteriori esperimenti per misurare la struttura della soluzione, esaminare la chimica enzimatica o dipendente dal substrato, il tutto per rispondere a ulteriori domande sul meccanismo di reazione.

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In questo video, dimostriamo la tecnica di cromatografia di affinità al nichel per purificare gli enzimi pirofosfochinasi marcati con istidina dai batteri Clostridium difficile.

Purificazione delle proteine basata sulla cromatografia di affinità al nichel: una tecnica per purificare le proteine ricombinanti marcate con poliistidina dal lisato cellulare batterico

Questo video mostra una procedura per la produzione di anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi. I plasmidi ricombinanti che trasportano i geni per l'anticorpo, la proteina fluorescente verde e la resistenza agli antibiotici vengono trasfettati in cellule epiteliali con lipofectamina. Le cellule trasfettate vengono selezionate e coltivate per generare anticorpi ricombinanti.

Un metodo per produrre anticorpi ricombinanti contro la metallopeptidasi

I reagenti di rilevamento robusti sono sempre più necessari per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici per la malaria. È stata progettata una sonda all'iridio (III) che emette un segnale luminescente di lunga durata in presenza di un biomarcatore proteico malarico ricco di istidina. La rilevazione della proteina, sia in soluzione che immobilizzata su una particella magnetica, offre flessibilità nell'applicazione.

Iridium (III) luminescente sonda per il rilevamento della proteina malarica Biomarker istidina Rich Protein-II

La cromatografia ad esclusione dimensionale con plasma accoppiato induttivamente - la spettrometria di massa (ICP-MS) è un potente strumento per misurare i cambiamenti nell'abbondanza di metalloproteine direttamente da campioni biologici. Qui descriviamo una serie di standard metalloproteici utilizzati per stimare la massa molecolare e la quantità di metallo associata a proteine sconosciute.

Norme per quantitativa Metalloproteomic analisi utilizzando Size Exclusion ICP-MS

Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.

Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain

Qui, descriviamo un metodo per purificare enzimi pyrophosphokinase istidina-etichettate e utilizzando la cromatografia su strato sottile di radiomarcato substrati e prodotti di test per l' attività enzimatica in vitro. L'analisi di attività dell'enzima è ampiamente applicabile a qualsiasi chinasi, ciclasi del nucleotide o reazione di fosforo-trasferimento cui meccanismo include idrolisi di trifosfato del nucleotide.

Una purificazione e l'analisi di attività In Vitro per un ppGpp (p) sintetasi da Clostridium difficile

La spettrometria di massa io-masse ionica e le tecniche di modellazione molecolare possono caratterizzare le prestazioni selettive di chelatura metallica di peptidi progettati e la metanobattina peptide legante al rame. Lo sviluppo di nuove classi di peptidi chelanti metallici contribuirà a portare alle terapie per le malattie associate allo squilibrio degli ioni metallici.

Tecniche di spettrometria ione Mobilità-Massa per determinare la struttura e i meccanismi del riconoscimento degli ioni metallici e dell'attività di redox degli oligopeptidi di metal linciazione

Vi presentiamo un saggio per una facile quantificazione dei metalli introdotti nei campioni preparati utilizzando la cromatografia dell'affinità dei metalli immobilizzati. Il metodo utilizza il blu idxynaphthol come indicatore di metallo colorimetrico e uno spettrofotometro UV-Vis come rivelatore.

Quantificazione della lisciviazione dei metalli nella cromatografia di affinità metallica immobilizzata

Qui descriviamo i protocolli per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS) che coinvolgono le ubiquitina ligasi Von Hippel-Lindau E3 ligasi (VHL) e Cereblon (CRBN).  I metodi biofisici qui illustrati includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).

Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce 

Impara a purificare metalloenzimi ferro-leganti mediante cromatografia di affinità del metallo immobilizzato e a ricostituire il cofattore metallico per analizzarne la struttura e la funzione in un contesto didattico universitario.

Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e lanalisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato (Video) | JoVE Journal

Benchtop immobilizzati di cromatografia di affinità del metallo, la ricostituzione e l'analisi di un Polyhistidine contrassegnati metalloenzimi per il laboratorio dello studente non laureato

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