Name: Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri la tecnica FLIPS per amplificare e sequenziare provirus HIV-1 full-length da singole cellule infette. Questo metodo ad alto rendimento consente di identificare provirus geneticamente intatti e potenzialmente replicanti, migliorando la comprensione del serbatoio latente.

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Questo lavoro è stato supportato Delaney AIDS ricerca Enterprise (DARE) per trovare una cura (1U19AI096109 e 1UM1AI126611-01); un amfAR Consorzio di ricerca su HIV eradicazione (ARCHE) Collaborative Research Grant della Fondazione per la ricerca sull'AIDS (amfAR 108074-50-RGRL); Australian Centre for HIV ed epatite virologia ricerca (ACH2); UCSF-GIVI centro per la ricerca sull'AIDS (P30 AI027763); e l'Australian National Health and Medical Research Council (AAP1061681). Vorremmo ringraziare Dr. Joey Lai, genomica Facility Manager presso l'Istituto di Westmead ricerca medica per la sua formazione in libreria preparazione e uso del suo impianto e il centro di Ramaciotti per genomica (Università del New South Wales, Sydney, Australia) per lo svolgimento di sequenziamento. Riconosciamo con gratitudine i partecipanti che hanno donato i campioni per questo studio.

<ol><li>Bruner, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+proviruses+rapidly+accumulate+during+acute+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection.</a> Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).</li>
<li>Hiener, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genetically+Intact+HIV-1+Proviruses+in+Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+from+Effectively+Treated+Participants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants.</a> Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).</li>
<li>Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+position%2C+and+frequency+of+mutations+made+in+a+single+cycle+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication.</a> Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).</li>
<li>Ho, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+noninduced+proviruses+in+the+latent+reservoir+increase+barrier+to+HIV-1+cure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure.</a> Cell. 155 (3), 540-551 (2013).</li>
<li>Harris, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+deamination+mediates+innate+immunity+to+retroviral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection.</a> Cell. 113 (6), 803-809 (2003).</li>
<li>Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermutation+of+HIV-1+DNA+in+the+absence+of+the+Vif+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein.</a> Science. 300 (5622), 1112(2003).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebound+of+plasma+viremia+following+cessation+of+antiretroviral+therapy+despite+profoundly+low+levels+of+HIV+reservoir%3A+implications+for+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication.</a> AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).</li>
<li>Chomont, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reservoir+size+and+persistence+are+driven+by+T+cell+survival+and+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation.</a> Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).</li>
<li>Soriano-Sarabia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+replication-competent+HIV-1+in+populations+of+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells.</a> Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).</li>
<li>Josefsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reservoir+in+eight+patients+on+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy+is+stable+with+few+genetic+changes+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).</li>
<li>Evering, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+HIV-1+evolution+in+the+gut-associated+lymphoid+tissue+from+patients+on+combination+antiviral+therapy+initiated+during+primary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection.</a> Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506(2012).</li>
<li>von Stockenstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+Genetic+Characterization+Reveals+That+Cell+Proliferation+Maintains+a+Persistent+HIV+Type+1+DNA+Pool+During+Effective+HIV+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).</li>
<li>Palmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).</li>
<li>Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench ">https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench </a> (2018).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), (2011).</li>
<li>Magoc, T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+fast+length+adjustment+of+short+reads+to+improve+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.</a> Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Bankevich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPAdes%3A+a+new+genome+assembly+algorithm+and+its+applications+to+single-cell+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing.</a> Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA7%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+Version+7.0+for+Bigger+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets.</a> Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).</li>
<li>Katoh, K., Standley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFFT+multiple+sequence+alignment+software+version+7%3A+improvements+in+performance+and+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability.</a> Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html ">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html </a> (2018).</li>
<li>Foster, J. L., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Nef+in+HIV-1+replication+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis.</a> Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html</a> (2018).</li>
<li>Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html">https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html</a> (2018).</li>
<li>Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/2041-210X.12628">ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data.</a> Methods in Ecology and Evolution. , (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il dosaggio di salti mortali è un metodo efficiente e ad alta resa di amplificazione e sequenziamento singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1. I fattori multipli e passaggi critici nel protocollo che influenzano il numero e la qualità delle sequenze ottenute sono state identificate. In primo luogo, il numero delle cellule e la frequenza di infezione di HIV-1 della popolazione cellulare influenzano il numero di provirus amplificato. Ad esempio, in una precedente pubblicazione, circa la metà come molte sequenze sono state ottenute dallo stesso numero di ingenuo CD4+ T cellule rispetto alla memoria effettrici CD4+ T cellule. Questo è perché le cellule naive in genere hanno una frequenza più bassa di infezione che di cellule effettrici memoria2. In secondo luogo, la lisi cellulare sono preferibile ai metodi di estrazione basata su colonne per l'ottenimento del DNA genomico non c'è alcun rischio di perdere del DNA nel processo di estrazione. Infine, come con qualsiasi analisi PCR-basata, impedendo la contaminazione è fondamentale. Zone separate pulite dovrebbero essere designate per la preparazione di mix master, manipolazione del DNA di genomic, aggiunta di controlli positivi, purificazione del DNA e quantificazione e preparazione di biblioteca. Ciò è particolarmente importante per singola copia saggi come quello qui presentato.
Implementazione del dosaggio FLIPS prima dovrebbe includere in esecuzione di un controllo positivo ad esempio plasmidi pNL4-3 piuttosto che campioni partecipanti. Questo permetterà per qualsiasi risoluzione dei problemi prima che l'uso di cellule positive del HIV-1, come le sequenze ottenute possono essere paragonate alle sequenze di riferimento disponibili per questi plasmidi. Quando si utilizza cellule positive del HIV-1, è importante considerare il sottotipo di HIV-1 (primer disegnati per salti mortali sono specifici al sottotipo B) e la frequenza di infezione della popolazione cellulare se poco o nessun provirus vengono amplificato. Sequenze dell'iniettore possono essere per volta/ridisegnato per abbinare altri sottotipi. Inoltre, un bene che contiene un controllo positivo dovrebbe essere incluso in ogni PCR eseguita.
Salti mortali ha superato i limiti della precedente analisi di sequenziamento, compreso SPS. FLIPS, attraverso amplificazione e sequenziamento vicino a full-length provirus di HIV-1, è in grado di determinare la potenziale replica-competenza del provirus di HIV-1. Questo non era possibile utilizzando SPS, che solo regioni sub-genomiche in sequenza e quindi selezionati per le sequenze con siti di legame del primer intatto. Inoltre, FLIPS supera i limiti associati all'utilizzo più amplificazione e primer di sequenziamento, come è stato impiegato da precedente full-length sequenziamento saggi1,4. Attraverso due cicli di PCR indirizzando le regioni LTR di HIV-1 combinate con NGS, FLIPS diminuisce il numero e la complessità degli iniettori richiesto. Salti mortali è quindi meno suscettibile alle conseguenze del primer disadattamento, vale a dire l'identificazione erronea del provirus difettoso e un'incapacità di amplificare alcune provirus all'interno di una popolazione. Il protocollo di FLIPS è anche più efficiente e consente un throughput più elevato del sequenziamento rispetto ai metodi precedenti.
Evidentemente, FLIPS fornisce vantaggi rispetto ai metodi esistenti che determinano la composizione genetica di provirus di HIV-1. Tuttavia, è importante riconoscere i limiti di lanci. In primo luogo, il dosaggio di salti mortali non è stato sviluppato come uno strumento per misurare le dimensioni del bacino di HIV-1 latente, come analisi per determinare se FLIPS amplifica ogni provirus di HIV-1 presenti in una popolazione delle cellule non sono state completate. Salti mortali è invece utile per effettuare confronti relativi della composizione del serbatoio tra cellulari differenti popolazioni2. In secondo luogo, la replica-competenza del intatta provirus di HIV-1 non può essere determinata con certezza senza analisi in vivo , ad esempio quelle eseguite da Ho et al. 4. in terzo luogo, salti mortali non è progettato per determinare il sito di integrazione del provirus di HIV-1.
Piccole variazioni al protocollo FLIPS possono aumentare la sua applicazione. Ad esempio, le variazioni di primer sequenze possono consentire diverse e molteplici sottotipi di HIV-1 ad essere amplificato ed ordinato. Sequenziamento dei virions del plasma HIV-1 è possibile attraverso l'aggiunta di sintesi del cDNA prima del PCR annidata. Futuro utilizzo dei metodi di sequenziamento di singola molecola eliminerà la necessità per l'assemblaggio de novo .
Sequenziamento genetico di integrato provirus di HIV-1 ha aumentato la nostra comprensione del bacino latente di HIV-1. Flip è uno strumento importante per gli studi futuri delucidando la composizione e la distribuzione del serbatoio latente. Tuttavia, l'applicazione di lanci può estendersi oltre il serbatoio. Gli studi futuri possono utilizzare i salti mortali per determinare obiettivi particolari per tecnologia CRISPR-Cas, o contribuire all'identificazione di codifica e regioni non codificanti, che rendono il virus più reattivo alla latenza agenti di retromarcia. Ricombinazione virale può essere meglio compresa guardando i siti di giunzione di ampie delezioni interne.

Caratterizzazione genetica del bacino di HIV-1 latente, che persiste in individui sulla terapia antiretrovirale a lungo termine (arte), è stato fondamentale per la comprensione che la maggioranza di provirus integrato sono difettosi e replica-incompetente1 , 2. durante il processo di trascrizione inversa, gli errori vengono introdotti nella sequenza proviral integrata. Alcuni meccanismi che generano difettosi sequenze proviral includono il soggetta a errori di enzima trascrittasi inversa dell'HIV-13, modello di commutazione4, e/o indotta da APOBEC hypermutation5,6. Due recenti studi hanno trovato che circa il 5% del provirus di HIV-1 isolato da individui sull'arte a lungo termine sono geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente e può contribuire a rimbalzo rapido nei livelli del plasma HIV-1 al momento della cessazione dell'arte 1 , 2 , 7. gli studi precedenti hanno identificato che replica-competente provirus di HIV-1 persistere nelle ingenuo e riposo memoria CD4+ T cell sottoinsiemi (compresi central, transitorio e cellule effettrici T di memoria), che indica l'importanza di targeting per queste cellule in futuro strategie di eradicazione2,8,9.
Primi approfondimenti la distribuzione, la dinamica e la manutenzione del serbatoio latente di HIV-1 sono stati ottenuti attraverso l'utilizzo di metodi di sequenziamento singolo-proviral (SPS) che caratterizzano geneticamente sub-regioni del genoma dell'HIV-110 ,11,12,13. SPS è uno strumento versatile, in grado di sequenziare un singolo provirus di HIV-1 all'interno di una singola cellula infettata. Tuttavia, SPS è in grado di determinare la replica-competenza del provirus, poiché solo sequenze sub-genomica provirus regioni e manca che contengono grandi omissioni all'interno di siti di legame del primer. Uno studio precedente ha dimostrato che SPS sopravvaluta le dimensioni del serbatoio replica-competente di 13 - 17 volte tramite sequenziamento selettivamente intatte regioni sub-genomiche2.
Per affrontare le limitazioni di SPS, Ho et al. 4 e Bruner et al. 1 sviluppato analisi di sequenza vicino a full-length provirus di HIV-1. Questo ha permesso la frequenza di geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente, provirus di HIV-1 in individui sull'arte a lungo termine deve essere determinato. Queste analisi amplificato ed ordinato (via Sanger sequenziamento) regioni sub-genomiche che sono stati poi assemblate per ottenere un provirus di HIV-1 sequenza di (intatto o difettoso). Tre limiti di questo approccio sono: 1) l'uso del primer di sequenziamento più aumenta il rischio di introdurre inavvertitamente difetti nella sequenza proviral, 2) primer disadattamento può impedire l'amplificazione del provirus particolare e 3) spesso i proviral intera sequenza non può essere risolto a causa della tecnicità di questi metodi.
Per superare le limitazioni delle esistenti analisi di sequenziamento proviral HIV-1 Full-Length, abbiamo sviluppato il Full -Length hondividual Proviral Sequencing (Flip) saggio. Flip è un sequenziamento di nuova generazione (NGS)-analisi di base che amplifica e sequenze vicino provirus di HIV-1 (intatto o difettosi) Full-Length in maniera efficiente e ad alta velocità. Salti mortali offre vantaggi rispetto le analisi precedenti, poiché limita il numero dei primer utilizzati; di conseguenza, diminuisce la probabilità di primer disadattamento, che può limitare la popolazione di provirus catturato o involontariamente introdurre difetti in una sequenza virale. Flip è anche tecnicamente meno impegnativo di saggi precedenti e prevede 6 passaggi principali: cellule Lisi 1) di infezione da HIV-1, 2) amplificazione del singolo provirus di HIV-1 tramite nested PCR eseguita a limitare la diluizione usando gli iniettori specifici per altamente conservato HIV-1 5' e 3' U5 LTR regione (Figura 1A), 3) purificazione e quantificazione dei prodotti amplificati, 4) preparazione della biblioteca di provirus amplificato per NGS, 5) NGS e 6) montaggio de novo di provirus in sequenza per ottenere contigs di ciascuno provirus individuali.
Sequenze generate da salti mortali possono subire un processo rigoroso di eliminazione per identificare quelli che sono geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente (Figura 1)2. Provirus geneticamente intatti mancano tutti i difetti noti che provocare la generazione di un provirus replica-incompetente. Questi difetti comprendono: sequenze di inversione, ampie delezioni interne, codoni di stop hypermutation/deleteri, frameshift o mutazioni in 5' imballaggio segnale o principali della giuntura sito donatore (MSD).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig1.jpg"> Figura 1: fasi critiche nell'analisi di sequenziamento proviral individuali Full-Length (Flip). (A) genoma di HIV-1 DNA con siti di legame del primer 5' e 3' regioni U5 LTR utilizzato da salti mortali per amplificare vicino a full-length provirus di HIV-1 (difettoso e intatto) tramite PCR annidata. (B) Layout di una piastra PCR a 96 pozzetti contenenti 80 pozzetti dei campioni (20 pozzi per ogni diluizione), 4 pozzi di controllo negativo e positivo 1 controllo bene. (C) processo di eliminazione utilizzato per identificare geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente, provirus di HIV-1. Questa figura è stata modificata da Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Diluire a 5 mM per PCR nidificata</td></tr><tr><td>Soluzione sostitutiva Nonidet P 40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K (20 mg/mL)</td><td>Promega</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td></td><td></td> a 96 <td>pozzetti È possibile utilizzare qualsiasi termociclatore a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone ad alta fedeltà [600 mM Tris-SO4 (pH 8,9), 180 mM (NH4)2SO4]</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgSO4</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>PCR Nucleotide Mix, 10 mM</td><td>Promega</td><td>C1141</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure H2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>primer PCR1 e PCR2</td><td></td><td></td><td>dissalati. Diluire a (100 &micro; M) con piastra PCR H2O</td></tr><tr><td>96 pozzetti, mezza gonna, angolo a tacca singola, sigilla adesiva</td><td>Microseal Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td>Necessario per sigillare piastre PCR a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Clone molecolare infettivo HIV-1 NL4-3 (pNL4-3)</td><td>Il seguente reagente è stato ottenuto attraverso il NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) dal Dr. Malcolm Martin (Cat# 114).</td><td></td><td>Diluito a 105 copie/mL e utilizzato come</td></tr><tr><td>centrifuga per PCR</td> a controllo positivo, E-GEL <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48, 1% Agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>G800801</td><td>Gel prefabbricati all'1% di agarosio (due gel utilizzati per piastra da 96 pozzetti). Qualsiasi gel di agarosio all'1% può essere sostituito. Contiene bromuro di etidio.</td></tr><tr><td>DirectLoad Marcatore DNA ad ampio raggio</td><td>Sigma</td><td>D7058</td><td>È possibile sostituire qualsiasi scala con una portata fino a 10 kb</td></tr><tr><td>Dispositivo Mother E-Base</td><td>Invitrogen</td><td>EBM03</td><td>Necessario per l'esecuzione di gel di agarosio prefabbricati a 48 pozzetti all'1%</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi sistema di visualizzazione per gel di agarosio contenenti bromuro di etidio</td></tr><tr><td>Sigillatura</td> <td>a caldo pelabile PlateMaxAxygen</td><td>HS-200</td><td>Pellicola termosaldante per la conservazione a lungo termine</td></tr><tr><td>Piastra di conservazione da 0,8 mL a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0765</td><td>Piastra da 96 pozzetti da 0,8 mL necessaria per la purificazione PCR basata su biglie magnetiche</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP (kit di purificazione PCR)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Kit di purificazione PCR basato su biglie magnetiche. Altri kit di purificazione PCR possono essere sostituiti qui (ad es. Kit di purificazione PCR QIAquick (Qiagen Cat#28106)</td></tr><tr><td>Alcool etilico, puro. 200 proof, per biologia molecolare</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Stand-96</td><td>Invitrogen</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore</td><td></td><td></td> per micropiastre <td>Buffer opzionale</td></tr><tr><td>EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Tampone di eluizione</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen kit per il dosaggio del dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>Un colorante a base di fluorescenza per misurare la concentrazione di dsDNA</td></tr><tr><td>Lettore</td><td></td><td></td><td></td>di micropiastre</tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di DNA Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Kit di indice Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti a guscio rigido</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td>Necessario per il kit di preparazione della libreria di DNA Nextera XT</td></tr><tr><td>Kit di quantificazione della libreria - Illumina/Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>È possibile sostituire altri kit di quantificazione della libreria (ad es Kit di quantificazione della libreria di DNA JetSeq Lo-Rox (Bioline Cat#BIO-68029)</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technology</td><td></td><td>Sistema di elettroforesi automatizzato . Utilizzare in combinazione con un kit DNA ad alta sensibilità</td></tr><tr><td>Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Illumina MiSeq Platform</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amplificazione del vicino full-length provirus di hiv-1 per il sequenziamento di nuova generazione

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Il dosaggio di Full-Length individuali Proviral Sequencing (Flip) è un metodo efficiente e ad alta velocità progettato per amplificare e la sequenza singola, nei pressi di provirus di HIV-1 (intatto e difettoso), full-length. RIBALTA permette di determinare la composizione genetica di HIV-1 integrato all'interno di una popolazione delle cellule. Attraverso l'identificazione di difetti all'interno di sequenze provirale di HIV-1 che si verificano durante la trascrizione d'inversione, come grandi omissioni interne, fermata deleteri codoni/hypermutation, mutazioni frameshift e mutazioni/delezioni in cis elementi sostituti necessari salti mortali, per maturazione del virione, è in grado di identificare integrato provirus incapace di replica. Il dosaggio di salti mortali possa essere utilizzato per identificare provirus di HIV-1 che mancano di questi difetti e sono quindi potenzialmente replica-competente. Il protocollo di salti mortali coinvolge: lisi delle cellule di infezione da HIV-1, nested PCR di vicino a full-length provirus di HIV-1 (utilizzando primers mirati al HIV-1 5' e 3' LTR), purificazione del DNA e quantificazione, preparazione libreria per Next-generation Sequencing (NGS), NGS, Assemblea de novo di contigs proviral e un semplice processo di eliminazione per l'identificazione di provirus replica-competente. Salti mortali fornisce vantaggi rispetto ai tradizionali metodi progettati per sequenza integrato provirus di HIV-1, come singolo-proviral sequenziamento. Salti mortali amplifica e sequenze vicino a full-length provirus abilitazione competenza di replica deve essere determinato e utilizza anche meno primer di amplificazione, prevenire le conseguenze di mancate corrispondenze primer. Flip è uno strumento utile per la comprensione del panorama genetico dell'integrato provirus di HIV-1, soprattutto all'interno del serbatoio latente, tuttavia, il suo utilizzo può estendere a qualsiasi applicazione in cui è necessaria la composizione genetica di HIV-1 integrato.

Il dosaggio di FLIPS amplifica e sequenze singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1. Il protocollo prevede 6 passaggi per ottenere vicino a sequenze proviral integrali. Tali passaggi includono: lisi delle cellule, la PCR annidata del provirus HIV-1 Full-Length (intatto e difettoso), la purificazione del DNA e la quantificazione, sequenziamento preparazione libreria, NGS, infette e sequenziato Assemblea de novo del provirus. Alla fine di ogni passo può essere considerata un checkpoint in cui la qualità del prodotto (ad es. amplificati del DNA, DNA purificato, biblioteca di sequenziamento o sequenza) può essere valutata prima del passaggio successivo. Una panoramica della valutazione effettuata alla fine di ogni passaggio e i risultati attesi è descritto di seguito.
In seguito la PCR annidata, prodotti amplificati vengono eseguiti su un gel di agarosio 1% (Figura 3). La qualità iniziale del PCR può essere determinata mediante ispezione dei controlli positivi e negativi. Pozzetti di controllo negativo contenente prodotto amplificato indicano contaminazione e pozzetti di controllo positivo assente del prodotto amplificato indicano insufficiente amplificazione. Successivamente, pozzetti contenenti prodotto amplificato sono selezionati per il sequenziamento. Per evitare pozzetti contenenti miscele di più amplificato provirus, solo pozzetti contenenti prodotto amplificato eseguita alla diluizione di End-Point sono considerati per il sequenziamento. Secondo la distribuzione di Poisson, la diluizione di End-Point si trova quando il 30% dei pozzi sono positivi per prodotto amplificato. A questa diluizione, c'è un 80% probabilità questi pozzetti contengono un singolo provirus amplificato. Inoltre, pozzetti contenenti più amplificato provirus di lunghezze diverse possono essere visualizzati in questa fase come bande multiple apparirà sul gel. Questi pozzi non devono essere selezionati per la sequenziazione (Figura 3).
Dopo purificazione del provirus amplificato selezionato per il sequenziamento, quantificazione garantisce che nessun DNA provirale è perso durante la fase di purificazione. Se la concentrazione di DNA di un provirus amplificato è &lt; 0,2 ng / µ l, il restante campione in PCR2 piastra può essere purificato. Un simile punto di arresto si verifica dopo la preparazione della biblioteca, in cui ogni singola biblioteca è quantificato. In questo modo provirus individuali sono stati opportunamente frammentato, etichetta e amplificato prima del sequenziamento. Provirale singole librerie sono in pool in quantità equimolari a una concentrazione finale di biblioteca di 4 nM (o come specificato dal provider di sequenziamento). Se la concentrazione di una singola libreria proviral è troppo bassa, può essere escluso dal pool di biblioteca di sequenziamento, o la singola biblioteca preparato ancora una volta. Prima del sequenziamento insieme confermando le lunghezze medio frammento viene eseguito un controllo finale della concentrazione della biblioteca in pool.
Passaggi di controllo di qualità prima della fase di assemblaggio del de novo assicura la qualità del legge utilizzato per assemblare il contig proviral finale. Tali passaggi includono: rimozione delle sequenze di adattatore, taglio 5' e 3' nucleotidi, un limite di qualità rigorosi e trascurando brevi letture. CLC Genomics Workbench può fornire report di controllo di qualità che può essere utilizzato prima di valutare la qualità iniziale delle letture e impostazioni della Guida di taglio e poi dopo per determinare se l'operazione di taglio sarebbe stato sufficiente per rimuovere aree di bassa qualità. Inoltre, per l'assemblaggio de novo , la qualità della contigs assemblato può essere valutata per profondità sufficiente (&gt; 1000 X) e uniformità di copertura (Figura 4A). Popolazioni miste possono essere identificati anche in questa fase. Miscele di più Full-Length (~ 9 kb) provirus vengono identificate attraverso la presenza di SNPs multipli con una frequenza superiore al 40%, considerando che miscele di short (contenente una grande omissione interna) e full-length provirus possono essere identificate da irregolare leggere la copertura dopo il mapping a un full-length di riferimento dal partecipante stesso (Figura 4B).
A seconda dell'applicazione, l'allineamento finale possa essere visualizzato utilizzando strumenti come ggtree disponibile come pacchetto in "r: A linguaggio e ambiente per il calcolo statistico"27. In uno studio recente, salti mortali è stato utilizzato per provirus di HIV-1 sequenza da ingenuo, centrale, transitorio ed effettrici memoria CD4+ T cellule isolate da individui sull'arte a lungo termine, con lo scopo di identificare se sottoinsiemi a cellula particolare ha mostrato maggiore proporzioni di geneticamente intatti e potenzialmente competenti replica HIV-12. Qui, la rappresentazione visiva delle sequenze isolato da uno dei partecipanti di questo studio (partecipante 2026) è presentato (Figura 5). In questo partecipante, la maggioranza (97%) delle sequenze era difettosa, con intatti sequenze trovate effettrici e transitorio memoria CD4+ T cellule. Questo strumento di visualizzazione è utile per mostrare il numero di sequenze con le grandi omissioni interne e la loro posizione nel genoma. Possono essere annotata ulteriormente per indicare sequenze con codoni di stop deleteri, frameshift mutazioni e delezioni/mutazioni nel sito MSD e/o segnale di imballaggio.
Una applicazione del dosaggio FLIPS è l'identificazione di geneticamente intatti e potenzialmente replica-competente provirus di HIV-1. In un recente studio di 531 sequenze isolate da CD4+ T cellule da 6 partecipanti sull'arte a lungo termine, 26 (5%) geneticamente intatti provirus di HIV-1 sono stati identificati2. Il restante provirus difettoso incluso quelli con sequenze di inversione (6%), grandi delezioni interne (68%), fermata deleteri codoni/hypermutation (9%), mutazioni frameshift (1%) e difetti del segnale di imballaggio e/o mutazioni nel sito MSD (11%) .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig2.jpg"> Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro per il montaggio del de novo del provirus di HIV-1. i principali passaggi del flusso di lavoro includono: 1) sequenza leggi di controllo di qualità, 2) Unione di coppie sovrapposte, 3) Assemblea de novo e 4) rimappatura e costruzione del consenso è state colorate di rosso, blu, verde e arancio, rispettivamente. Questa figura è stata modificata da Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig3.jpg"> Figura 3: esempio gel dell'agarosi del PCR amplificato provirus di HIV-1. Pozzetti 1, 2, 3, 6, 9 e 10 contengono amplificato provirus di HIV-1. Ben 10 contiene un provirus con una grande omissione interno, ben 2 contiene co-amplificazione di due provirus di HIV-1 di diverse lunghezze (miscela), e contiene ben 12 controllo positivo. Nota la percentuale di pozzetti contenenti prodotto amplificato è 60%, che è di sopra della percentuale richiesta per isolare i singoli modelli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig4.jpg"> Figura 4: esempio di output di lettura mappatura. (A) esempio che illustra anche la copertura per l'amplificazione di un singolo full-length provirus di HIV-1. A seguito di Assemblea de novo , tutte le letture vengono mappate a del contig assemblati per produrre una sequenza di consenso. La piattaforma software consente le letture mappate da ispezionare per sufficiente e anche la copertura. (B) esempio dimostrando co-amplificazione di due provirus di HIV-1 di diverse lunghezze (miscela). Per determinare le miscele, letture sono mappate a una sequenza di riferimento Full-Length (~ 9 kb) dal partecipante stesso e leggere mappatura ispezionato. La presenza di copertura irregolare indica una miscela. Questa figura è riprodotto con permesso da Qiagen14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58016/58016fig5.jpg"> Figura 5: Esempio di visualizzazione delle sequenze proviral di HIV-1 isolato da CD4+ T cell sottoinsiemi da un individuo sull'arte a lungo termine. Proviral sequenze individuali HIV-1 sono rappresentati da linee orizzontali. Questa figura è stata modificata da Hiener et al. 2 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58016/58016fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Full-Length individuo proviral sequenziamento (Flip) fornisce un metodo efficiente e ad alta produttività per l'amplificazione e sequenziamento del singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1 (intatto e difettoso) e permette per la determinazione del loro potenziale replica-competenza. Salti mortali supera i limiti delle precedenti analisi progettate per sequenziare il serbatoio latente di HIV-1.

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'HIV, come determinare la composizione genetica dei provirus hiv e dei diversi tipi di cellule. Identificare in particolare quelli geneticamente intatti e potenzialmente competenti per la replicazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di amplificare quasi a figura intera i provirus hiv da singole cellule infettate da HIV e quindi sequenziarli entro il sequenziamento di prossima generazione.Per iniziare, preparare tutti i buffer come descritto nel protocollo di testo. Ottenere un pellet cellulare e aggiungere cento microlitri di tampone dilisi per milione di cellule. Mescolare pipettando su e giù.Lisci le cellule incubando in un ciclore termico a 55 gradi Celsius per un'ora e quindi aggiungere 85 gradi Celsius per 15 minuti. Per iniziare ad amplificare singoli provirus del DNA HIV-1 mescolare i reagenti per la PCR del primo ciclo come elencato nella tabella uno del protocollo di testo. Aggiungere 38 microlitri a 85 pozzali in una piastra PCR da 96 po' ed etichettare questa piastra come PCR 1.Successivamente, spostare la piastra PCR 1 in un'area chiara designata per l'aggiunta di DNA genomico. L'uso del tricloruro diluisca serialmente il DNA genomico da un rapporto da uno a tre a un rapporto da uno a 81 assicurandosi di preparare 45 microlitri di ogni diluizione. Aggiungere due microlitri di DNA genomico diluito a ciascun pozzo campione e due microlitri di tricloruro ad ogni pozzo di controllo negativo.Sigillare l'intera piastra ad eccezione del pozzo di controllo positivo. Passare quindi a un'area designata per l'aggiunta del controllo positivo. Aggiungere due microlitri del controllo positivo al pozzo corrispondente e quindi sigillare completamente la piastra.Utilizzare uno spinner a piastre PCR per ruotare brevemente la piastra PRC 1 ed estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzali. Eseguire la piastra PCR 1 nel ciclore termico come indicato nel protocollo di testo. Quindi, mescolare i reagenti per il secondo ciclo di PCR come elencato nella tabella uno.Aggiungere 28 microlitri di questo mix PCR 2 a 85 pozzali di una nuova piastra PCR da 96 poggi. Etichettare questa piastra come PCR 2. Utilizzando uno spinner a piastre, ruotare brevemente la piastra PCR 1 per estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzali.Aggiungere 80 microlitri di tris cloridrato ad ogni pozzo di questa piastra. Successivamente, utilizzare una pipetta a canale mutli per trasferire due microlitri da ogni pozzo della piastra PCR 1 ai pozzi corrispondenti nella piastra PCR 2. Sigillare la piastra PCR 2 con involucro adesivo chiaro.Ruotare brevemente la piastra PCR 2 nello spinner della piastra. Nel frattempo, sigillare la piastra PCR 1 con una pellicola termosigillante per la conservazione a lungo termine a meno 20 gradi celsius. Eseguire la piastra PCR 2 in un ciclore termico come indicato nel protocollo di testo.Quindi ruotare brevemente la piastra PCR 2 per estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzi. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 60 microlitri di tris cloridrato ad ogni pozzo. Successivamente, eseguire 15 microlitri di ciascun pozzo su due gel di agarosio dell'uno per cento ben prefabbricati che contengono bromuro di etidio.Identificare i pozzi contenenti il prodotto amplificato e le loro dimensioni approssimative e salvare l'immagine del gel. Successivamente, determinare la diluizione alla quale non più del 30% dei pozzi sono positivi per il prodotto amplificato. In primo luogo, utilizzare uno spinner a piastre per ruotare brevemente la piastra PCR 2 ed estrarre eventuali contenuti residui dai lati dei pozzali.Trasferire 40 microlitri dai pozzi contenenti prodotto amplificato ai pozzi corrispondenti di una nuova piastra midi da 96 pozza. Successivamente, impostare un kit di purificazione a base di alimentazione magnetica assicurandosi di portare le perline magnetiche a temperatura ambiente e preparare una soluzione fresca dell'80% di etanolo. Una volta che le perline raggiungono il vortice a temperatura ambiente, assicurarsi che vengano completamente rimorsi.Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 microlitri di perline ai 40 microlitri di prodotto amplificato in ogni pozzo della piastra midi. Mescolare con pipettando delicatamente su e giù 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Quindi, trasferire la piastra su un supporto magnetico e lasciarla riposare per due minuti. Successivamente, rimuovere e scartare il supernatante. Con la piastra ancora sul supporto, lavare le perline aggiungendo duecento microlitri della soluzione di etanolo all'80% ad ogni pozzo.Incubare a temperatura ambiente per 30 secondi, quindi rimuovere e scartare il supernatante. Ripetere questo processo di lavaggio una volta dall'aggiunta dell'etanolo allo scartamento del supernatante. Utilizzando una pipetta multicanale rimuovere l'etanolo in eccesso.Lasciare asciugare le perline all'aria per 15 minuti. Dopo questo, rimuovere la piastra dal supporto. Aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione ad ogni pozzo e mescolare tubazione delicatamente su e giù 10 volte.Incubare a temperatura ambiente per due minuti. Riposizionare la piastra sul supporto magnetico e lasciarla riposare per due minuti. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 25 microlitri del supernatante ai pozzi corrispondenti di una nuova piastra PCR da 96 potte.Successivamente, utilizzare un fotometro spettrale per determinare e registrare la concentrazione approssimativa di ogni prodotto DNA amplificato. Impostare un kit di quantificazione del DNA a doppio filamento e diluire il buffer a una volta in acqua sterile priva di DNA. Aggiungere 99 microlitri del tampone a un numero appropriato di pozzi vuoti in una piastra di coltura del tessuto inferiore piatto.Quindi, aggiungere cento microlitri di buffer a tre pozzi vuoti. Per misurare ogni prodotto amplificato aggiungere un microlitro di DNA purificato in triplice copia ad ogni tampone ben contenente. Diluire il DNA a doppio filamento lambda 10 volte da due nanogrammi per microlitro al punto zero nanogrammi per microlitro per preparare gli standard.Aggiungere cento microlitri di ogni standard di DNA a doppio filamento a tre pozzi. Diluire il colorante di florescence da uno a duecento con tampone. Aggiungere rapidamente cento microlitri a ciascun pozzo che contiene un campione, vuoto o standard e mescolare pipettando su e giù.Successivamente, coprire la piastra con un foglio per evitare il contatto con la luce. Utilizzando un lettore di micropiatte, registrare l'emissione di florescence. Utilizzare le misurazioni registrate per determinare la concentrazione di DNA a doppio filamento in ogni campione.Quindi diluire ogni prodotto purificato con acqua a una concentrazione di zero punti due nanogrammi per microlitro. Dopo la PCR annidata, i prodotti amplificati vengono eseguiti su un gel di agarosio dell'uno per cento. La qualità iniziale della PCR può essere determinata ispezionando i controlli.Poiché i controlli negativi contenenti prodotto amplificato indicano la contaminazione e i controlli positivi senza prodotto amplificato indicano un'amplificazione insufficiente. Solo i pozzi eseguiti alla diluizione del punto finale che contengono singoli provirus amplificati sono considerati per il sequenziamento. Mentre i pozzi contenenti più provirus amplificati di diverse lunghezze possono essere visualizzati in questa fase, non devono essere selezionati per il sequenziamento.Per l'assemblaggio de novo, la qualità dei contig assemblati può essere valutata per una profondità e un'evenienza sufficienti di copertura. Le popolazioni miste possono anche essere identificate in questa fase dalla presenza di una copertura irregolare. La rappresentazione visiva delle sequenze isolate da un partecipante rivela che il 97% delle loro sequenze sono difettose.Con sequenze intatte trovate in effector e memoria transitoria CD4 cellule T positive. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che solo i prodotti amplificati ottenuti alla diluizione limitante, cioè dove non più del 30% dei pozzi sono positivi, contengono un singolo provirus. Seguendo questa procedura, i prodotti amplificati possono essere sequenziati per determinare la composizione genetica dei provirus HIV.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'HIV per esplorare la distribuzione di provirus HIV geneticamente intatti e diversi tipi di cellule nei pazienti in terapia per determinare dove si nascondono provirus competenti geneticamente intatti e potenzialmente replicanti. Non dimenticare che lavorare con cellule infettate da HIV può essere pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale appropriati e lavorare in un laboratorio certificato dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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