Name: Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Scopri come isolare le proteine FCP dalla diatomea Cyclotella meneghiniana e incorporarle in liposomi con lipidi di tilacoidi. Questo metodo consente di studiare il trasferimento di energia eccitazionale in condizioni controllate di ioni e pH.

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Ringraziamo la Rana Adeel Ahmad per assistenza nella purificazione di FCP. Prof. ssa Claudia Büchel è riconosciuto per le utili discussioni e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da German Research Foundation LD (DI1956-1/1) e la fondazione Humboldt per una borsa di Feodor-Lynen di LD

Nota: Fotosintetici complessi quali FCPs sono altamente vulnerabili alla luce e al calore. Sempre lavorare sul ghiaccio e sotto una luce molto fioca.
1. isolamento di FCP dalle cellule
<ol><li>
Thylakoid isolamento dalle cellule di c. meneghiniana
	<ol>
<li>C. meneghiniana in cinque palloni 500 mL che ciascuno riempito con 300 mL di ASP-medio23,25 e 50 milioni di cellule si sviluppano. Collegare le beute con un tappo di cotone e permettono alle cellule di crescere per la fase di crescita esponenziale per circa una settimana su un agitatore a 120 giri/min con un 16 h luce e fase scura di 8h alle 40 µmol photons/(m²s) bianco luce e una temperatura compresa tra 15-18 ° C. Verifica che il numero di cellulare è tra 1,5 milioni di cellule/mL con un alloggiamento del contatore di cella.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 4.000 x g in un rotore preraffreddato con fiale di 500 mL centrifuga (4 ° C) per 15 min in una centrifuga ad alta velocità. Pipettando, risospendere il pellet cellulare in 12 mL di tampone di omogeneizzazione (HB, tabella 1).<ol>
<li>Trasferire la sospensione in una provetta di plastica singolo 50 mL. Conservare i campioni a-80 ° C o passare al punto 1.1.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pre-raffreddare il laminatoio del branello e attrezzature. Riempire il becher 50ml del mulino perlina al 75% con una miscela di microsfere di vetro e aggiungere la sospensione cellulare. Per distruzione cellulare, usare 7x45 s impulsi a piena velocità con 30 s di raffreddamento tra ogni impulso. Prendere 20 µ l di celle interrotte per controlli di qualità nel passaggio 1.1.6.</li>
		<li>Filtrare le celle interrotte sopra un imbuto di vetro e lavare versando l'HB sopra le perline di vetro fino a quando non appaiono chiare. Piscina la frazione di lavare con il filtrato. Tenere il volume finale inferiore a 150 mL.</li>
		<li>Centrifugare il campione per 15 min a 140 x g usando tre provette di plastica da 50 mL a pellet i detriti cellulari. Attentamente trasferire il surnatante a 20 mL in policarbonato ultracentrifugazione fiale e scartare il pellet.<ol>
<li>Riempire i flaconi con HB, equilibrare il peso e centrifugare in un rotore adatto per 1 h a 300.000 x g e a 4 ° C per appallottolare le membrane tilacoidali.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare il tempo di centrifugazione per controllare la proporzione di cellule perturbate da microscopia a 400 ingrandimenti con i 20 µ l di campione preso a 1.1.3. Calcolare il rapporto tra cloroplasto gratis e cloroplasto contenente frustules (gusci di silice). Nota: Pareti della cellula della diatomea sono costituite da silice, che sono visibile come altamente diffracting sostanza nel microscopio. Cloroplasti che si verificano punti verdi come avrebbe dovuto essere rilasciati dalle cellule se ha funzionato la distruzione cellulare.</li>
		<li>Risospendere il pellet di membrana con come piccolo tampone di lavaggio come possibile (0,5-1 mL) utilizzando il pennello di un pittore piccolo. Riempire i flaconi di ultracentrifugazione in policarbonato con lavaggio tampone (tabella 1), equilibrare il loro peso e centrifugare per 20 min a 200.000 x g e a 4 ° C.<ol>
<li>Risospendere le membrane lavate con pennello di un pittore. Aggiungere tampone di lavaggio solo se necessario per mantenere la concentrazione di thylakoid più in alto possibile. Tutti i tilacoidi nel flacone di un campione (15 mL) della piscina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pre-diluire i campioni utilizzando 10 µ l di campione con 90 µ l di acetone 100%. E centrifugare a 12.000 x g per 5 min a pellet proteina precipitata. Prendere 10 µ l della prediluizione e mescolare con 990 µ l di acetone 90%.<ol>
<li>Misurare l'assorbanza (ABS) di clorofilla a e c a 664 nm e 630 nm in 90% di acetone. Sottrarre l' ABS750nm da entrambi i valori. Determinare il contenuto di clorofilla totale utilizzando la seguente formula:24 1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq1.jpg"> 2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58017/58017eq2.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquotare tilacoidi in porzioni di 0,5 mg di clorofilla totale in un di provette da 1,5 mL, congelarli in azoto liquido e conservarli a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Separazione e concentrazione di complessi FCP
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di gradiente di saccarosio e riempire le provette ultracentrifuga fino alla parte superiore meno il volume di carico (300 – 500 µ l). Congelare le provette a-20 ° C fino a quando sono completamente congelati. Lasciare le provette per lo scongelamento a + 4 ° C, che dura 3-4 ore per un tubo da 17 mL.<ol>
<li>Ripetere il ciclo gelo-disgelo due volte per affinare la sfumatura per una migliore risoluzione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare i campioni ottenuti in 1.1.9 pari a 0,5 mg di clorofilla e regolare con buffer B1 (tabella 1) ad un volume finale di 2 mL. Per solubilizzazione, aggiungere n-dodecil-β-D-maltopyranoside (b-DDM) ad una concentrazione finale di 20 mM.<ol>
<li>Capovolgere la provetta 3 volte e metterlo in ghiaccio per 20 minuti con agitazione delicata per evitare di schiuma. Centrifugare per 5 min, 12.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata tabella superiore a + 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Caricare il surnatante sulla sfumatura. Non caricare più di 125 µ g di clorofilla totale al gradiente se 17 mL fiale vengono utilizzati. Centrifuga per 22 h a 100.000 x g e + 4 ° C.<ol>
<li>Recuperare le frazioni FCP marrone desiderate dal gradiente usando una siringa (Figura 2A). Prendere un 5 µ l aliquota e diluirla con 995 µ l di B1a.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Misurare lo spettro di assorbanza (ABS) tra 370-750 nm in uno spettrofotometro UV-VIS. Utilizzare cuvette semimicro vetro ottico.<ol>
<li>Aprire il software di gestione di spettri, andare in modalità spettro e registrare una previsione da 370 a 750 nm seguita da misure campione. Utilizzare le seguenti impostazioni: scansione velocità, 200 nm/min; dati passo, 0.5 nm; risposta, media.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Misurare il volume del campione recuperato con una micropipetta. Lavare i complessi FCP aggiungendo due volte il volume recuperato con buffer B1 (tabella 1). Concentrare in un concentratore di membrana con un taglio a 1.000 x g e + 4 ° C per un ABS672nm di almeno 20 kDa 30. Nota: La concentrazione di b-DDM potrebbe aumentare a causa di arricchimento micella nel vano del campione. Questo potrebbe portare ad ulteriore solubilizzazione dei complessi FCP! Evitare eccessiva solubilizzazione aggiungendo detergente buffer liberi B1 se ulteriori fasi di lavaggio sono tenuti a rimuovere residuo saccarosio.</li>
		<li>Prendere un 20 µ l aliquota per i controlli. Shock congelare i campioni in azoto liquido e conservarli a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig2.jpg"> Figura 2: purificazione di FCP, controlli spettroscopici e purezza check. (A) l'aspetto tipico di un gradiente di densità di saccarosio dopo centrifugazione durante la notte. Tutte le bande marroni contengono il pool FCP costituito FCPa e FCPb. pigm. - unbound pigmenti, PS - fotosistema spettri di assorbanza (B) di FCP prima (linea blu) e dopo concentrazione (linea tratteggiata arancione) utilizzando dispositivi centrifughi con 30 kDa cutoff . In particolare, i carotenoidi sono soggetti a perdita da FCP, che si tradurrebbe in assorbanza inferiore nella regione tra 500-550 nm. Grafici sono normalizzati alla clorofilla Qy massima a ~ 670 nm. (C) spettri di emissione di clorofilla a con eccitazione di chl c (465 nm) per il test di trasferimento di energia di eccitazione funzionale. Se l'energia Trasferisci c chl chl un è ostacolato, una band di fluorescenza ulteriori ~ 640 nm (chl c) si sarebbe verificato. Grafici sono normalizzati per l'emissione massima. (D) spettri di eccitazione registrata a 675 nm (chl una fluorescenza massima) per il test di trasferimento di energia alla chl un da tutti i pigmenti assorbenti tra 370 nm e 600 nm. Se l'energia si trasferisce a chl un è meno efficiente, la resa di fluorescenza farebbe diminuire soprattutto tra 550 e 465 nm. I grafici sono normalizzati al massimo circa 440 nm. Gli spettri in (B), (C) e (D) sono quasi identici se la concentrazione ha funzionato bene. (E) si verifica per la purezza della FCP isolata utilizzando un gel di Tris-tricine28. FCPa e FCPb hanno subunità tra 18-19 kDa. Tutte le proteine visibile argento-macchiate più grandi di 20 kDa sono contaminanti. Thyl. -Tilacoidi <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="3"><li>
Spettroscopici e gel a base di controlli
	<ol>
<li>Annotare l'assorbanza tra 370-750 nm di 5 µ l di FCP in 995 µ l di B1a dopo passo 1.2.5. Confrontarlo con lo spettro ottenuto nel passaggio 1.2.4. Utilizzare la stessa strumentazione e impostazioni come descritto al punto 1.2.4.<ol>
<li>Esportare i dati come CSV e importare i dati in un foglio di calcolo. Due spettri al massimo di chl di normalizzare nella banday Q di circa 672 nm come raffigurato nella Figura 2B.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Calcolare il fattore di diluizione dei campioni dal punto 1.2.4 e 1.3.1 dividendo l' ABS misurato672nm dalla desiderata ABS672nm di 0,03. Diluire i campioni di conseguenza con B1a e trasferirli cuvette di fluorescenza di vetro speciale.</li>
		<li>Registrare chl uno spettro di emissione di fluorescenza con una Spettrofluorimetro per rivelare il trasferimento di energia luce intatta da chl c alla chl un (Figura 2).<ol>
<li>Utilizzare il software di spettrometro e andare per la modalità di misurazione dello spettro con le seguenti impostazioni: modalità, emissione; a taglio larghezza eccitazione e emissione, 3 nm; sensibilità, medio; velocità di scansione, 100 nm/min; dati passo, 0.5 nm; lunghezza d'onda di eccitazione, 465 nm; emissione, 600-800 nm. Eseguire autozero e misura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Registrare spettri di eccitazione con lo stesso campione e attrezzature per rivelare il trasferimento di energia intatto da tutti i pigmenti alla chl (Figura 2D). Modificare le impostazioni per: modalità, eccitazione; lunghezza d'onda di emissione, 675 nm; eccitazione, 370-600 nm. Registrare gli spettri.<ol>
<li>Correggere con uno spettro di rodamina nello stesso intervallo per proprietà spettrali della lampada – cf. istruzioni nel manuale dell'utente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Campioni di mix FCP corrispondenti a 1 µ g di chl un con 10 µ l di tampone di caricamento SDS. Incubare per 10 minuti a 25 ° C. Centrifugare per 5 min a 12000 x g in una centrifuga di piano d'appoggio.<ol>
<li>Caricare il surnatante su un gel di Tris-tricine28. Separarlo per 2 ore a 150 V e argento-macchia dopo separazione40. Nota: Le subunità FCP separano in due bande proteiche prominente tra 18-19 kDa, che sono costituenti di FCPa e FCPb29 (Figura 2E).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione dei liposomi e incorporazione di FCP
<ol><li>
Preparazione della miscela del lipido e detergente micelle lipidiche Nota: i lipidi sono suscettibili di combinato con circostanze ossidative di temperature calde. Cercare di mantenere i lipidi refrigerati e sotto un'atmosfera di2 N.<ol>
<li>Calcolare i rapporti del lipido thylakoid desiderata per c. meneghiniana secondo Vieler et al. 200730. Fare riferimento all'esempio fornito nella Supplemental tabella 1. Preparare il lipido stock soluzioni consigliate dal produttore in un contenitore di prova solvente.</li>
		<li>Pipettare la quantità desiderata di lipidi in una provetta di reazione di 2 mL ed evaporare il cloroformio utilizzando un flusso di azoto delicato e cercare di diffondere i lipidi su tutta la zona della base del tubo. Lasciate il flusso di N2 fino a quando tutti i solvente è evaporato.</li>
		<li>Solubilizzare la miscela di lipidi in 29 µ l di soluzione di n-ottile β-D-glucopyranoside (OG) a 4 ° C per 4 h. Incubare la miscela di lipidi per 10 min a 30 ° C. Incubare i lipidi in un bagno sonicatore per 3 x 3 min a 25 ° C, interrotto da 30 s sul ghiaccio.<ol>
<li>Aggiungere 221 µ l di Tampone tricina e 250 µ l di tampone di dialisi x 4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare un estrusore con membrane di policarbonato 0,1 µm per un diametro definito liposoma di 50-70 nm. Montare l'estrusore con il supporto della membrana e filtro. Evitare le bolle d'aria e serrare accuratamente l'assembly.</li>
		<li>Riempire una siringa con 4 x dialisi tampone e pre-bagnato l'estrusore, fino a quando non ci sono bolle possono essere visto nella seconda siringa.</li>
		<li>Applicare il lipido-detergente-micelle all'estrusore e premere la soluzione da una siringa a altra avanti e indietro. Ripetere questo passaggio 5 volte fino a quando la soluzione appare omogenea. Nota: Questa soluzione può essere conservata a 4 ° C per diversi giorni. Non congelare!</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incorporazione di FCP complessi e rimozione dei detergenti e aggregati Nota: In questo esempio usiamo un lipido/chl un rapporto di 12:1, che corrisponde a un rapporto lipidi/proteine circa 100: 1.<ol>
<li>Aggiungere FCP uguale a 20 µ g di chl un in un volume totale di 500 µ l di tampone di B1a a 250 μL dell'estruso del lipido-micelle e 250 µ l di tampone di dialisi: 4x. Incubare i campioni per 3 x 3 min a 25 ° C in un thermomixer a 1.500-3.000 giri/min interrotto da una pausa di 30 s sul ghiaccio.</li>
		<li>Tagliare il coperchio del tubo di reazione 1,5 mL quattro appena sotto la parte superiore dà un anello che si inserisce ancora sul coperchio. Preparare pezzi di 1,5 x 1,5 cm della membrana di dialisi e lavarli in 20 mL di tampone dialisi 1x</li>
		<li>Riempire 250 µ l di campione per ogni coperchio. Appoggiare delicatamente, la membrana sul coperchio in modo che il vano è completamente riempito con il campione e si verificano senza bolle d'aria. Stringere l'anello di tubo di reazione sull'Assemblea al fine di avere un vano chiuso.</li>
		<li>Dializzare i campioni in 50 mL di tampone di dialisi durante la notte: 1x (12-16 h) sul ghiaccio su un agitatore di barilatura. Sostituire il buffer di dialisi peritoneale con una fresca e aggiungere 7 mg di adsorbente perline per rimuovere i rimanenti detergenti per almeno 6 ore.</li>
		<li>Sostituire di nuovo il buffer di dialisi e Dializzare per un altro 12 h. recuperare i liposomi forando la membrana di dialisi con una punta di una micropipetta 200 µ l e aspirare tutti i liposomi dal coperchio del tubo di reazione.</li>
		<li>Passaggio facoltativo: se elevata purezza (&gt; 95%) è necessario. Preparare un gradiente di densità discontinua in 17 mL fiale ultracentrifugazione con passaggi contenente 6%, 10%, 15% e 20% copolimero epicloridrina di saccarosio nel buffer di dialisi. Caricare i liposomi sulla parte superiore e ultracentrifuga a 100.000 x g per 4 h in un rotore oscillante.<ol>
<li>Recuperare la banda superiore marrone con una siringa, diluire il campione 1:5 con DP e procedere al passaggio successivo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifugare i liposomi FCP in almeno 2 mL di 1x buffer di dialisi per 1,5 h a 100.000 x g e a 4 ° C. Recuperare i liposomi ruotando il tubo da centrifuga con un angolo di 45°. Consentire i liposomi spostare verso il basso per 1 min (Figura 3A).</li>
		<li>Recuperare i liposomi FCP in un volume finale di 25-50 µ l. evitare di disturbare il precipitato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controlli 1: assorbanza, spettroscopia di fluorescenza
	<ol>
<li>Aggiungere un'aliquota di 3 µ l di FCP-liposomi ad un volume finale di 1 mL di 1x buffer di dialisi e centrifugare per 5 min a 12.000 x g.<ol>
<li>Annotare l'assorbanza tra 370 e 750 nm di FCP-liposomi con la stessa attrezzatura come descritto in 1.2.4. Normalizzare lo spettro al massimo della regioney Q della chl un (670-680 nm) e confrontarlo con lo spettro normalizzato di solubilizzate FCP (Figura 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare FCP-liposomi in 1 mL di DP con un'assorbanza (ABS) = 0.03 per quanto riguarda il massimo tra 670-680 nm. Regolare la FCP solubilizzate in detergente dal punto 1.2.6 ABS stesso diluendo con B1a.</li>
		<li>Registrare spettri di assorbanza di entrambi i campioni come descritto in 1.2.4. Registrare chl uno spettro di emissione di fluorescenza di entrambi i campioni come descritto in 1.3.3. Nota: Il rendimento di fluorescenza è diminuito nel campione FCP-liposoma (Figura 3D e cfr discussione.)</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig3.jpg"> Figura 3: isolamento di FCP proteoliposomi seguita da controlli spettroscopici e imaging confocale. (A) recupero di liposomi FCP dopo la centrifugazione. Girare il tubo di centrifugazione a 45° e attendere circa 1 min - liposomi si sposterà verso il basso mentre la FCP aggregati che non sono incorporati in liposomi stick per la parete del tubo. (B) confronto degli spettri di assorbanza di FCP solubilizzate in detersivo (blu) e FCP in liposomi (arancione) (C) gli stessi spettri come in (B) normalizzato alla chl un massimo nella regione rossa (~ 670 nm - Qy picco); FCP solubilizzate in detersivo (blu) e FCP in liposomi (arancione). Potenzialmente, ci potrebbe essere una perdita di pigmento principalmente dei carotenoidi visibile nella regione dei 500-550 nm. Il clustering di FCP nei liposomi può portare a un allargamento del picco e un leggero spostamento della chl un massimo (~ 670 nm) al rosso. (D) spettri di emissione di FCP solubilizzate in detersivo e FCP in liposomi. Clustering di FCP nel liposoma migliora energici interazioni dei complessi FCP che abbassa il rendimento di fluorescenza (curva arancia) e i massimi di emissione si sposta leggermente al rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Liposomi FCP con composizione lipidica naturale forniscono uno strumento pratico, semplice e riproducibile per indagare le proprietà spettroscopiche in vitro. L'ambiente del lipido in liposomi FCP ricorda la situazione all'interno della membrana tilacoide, dando luogo a risultati sperimentali che sono più vicini alle condizioni naturali.
Ci sono diversi vantaggi di usando c. meneghiniana come sistema modello per antenna FCP. Si sviluppa relativamente veloce ed è più robusto r...

Gli organismi fotosintetici come le diatomee devono affrontare condizioni di luce mutevoli e rispondere con meccanismi sofisticati di acclimatazione che sostengono ad alta efficienza fotosintetica e proteggono da danno foto-ossidativo causato dalla luce eccessiva. Un importante processo di luce-protettivo negli eucarioti fotosintetici è l'alta energia tempra (qE) di luce assorbita che si presenta come il principale contributo per la tempra non fotochimica (NPQ) sotto condizioni di luce lo stress1,2 ,3. Il luce complessi antenna raccolta (LHC) sono coinvolti nella regolazione delle vie di trasferimento di energia di eccitazione. In risposta a luce alta indotta basso pH nel lume cloroplasto, gli interruttori del sistema antenna dalla luce raccolta allo stato dissetante. Questo stato che tende a dissipare energia protegge fotosistema (PS) e altri complessi nella membrana tilacoide da foto-ossidazione. Negli eucarioti fotosintetici, la qE solitamente è indotta da due fattori1,2,3. Un fattore è la luce specializzata raccolta della proteina che risponde al basso pH. La proteina PsbS induce il qE in più piante4. LhcSRs5, modulata da attività PsbS, indurre il qE alghe verdi6. Le diatomee possiedono proteine Lhcx-like che strutturalmente correlata alla LHCSRs7,8,9,10.
Il secondo fattore di qE è il ciclo della xantofilla dove i carotenoidi dell'antenna sono convertiti in un formato di foto-protettivo dal de-epossidazione e ripristinati da epossidazione. Nelle piante e alghe verdi, violaxantina viene convertito in zeaxantina. A diatomee, diadinoxanthin viene convertito in diatoxanthin, che quindi correla con il grado di NPQ11. La luce della diatomea raccolta antenna possiede alcune peculiarità, anche se è evolutiva legate alla pianta e LHCs d'alghe. L'interruttore da luce raccolta foto-protezione è estremamente veloce e la capacità NPQ è superiore rispetto a piante12. Questo potrebbe essere una ragione perché le diatomee sono molto successo in diverse nicchie ecologiche, in modo che essi sono responsabili fino al 45% della produzione primaria netta oceanico13. Di conseguenza, della diatomea luce sistemi di raccolta sono un interessante oggetto di ricerca di fotosintesi.
Diatomee, come le specie centric Cyclotella meneghiniana, possiedono luce intrinseca thylakoid prende i pigmenti hanno sistemi di raccolta associare - fucoxantina, clorofilla (chl) a e c, quindi FCP. luce raccolta proteine, quali FCPs, sono incorporato nel sistema della membrana tilacoide formati da diversi strati di membrana. Diatomee formano le fasce dei tre tilacoidi. Questo complesso situazione rende difficile per loro studiare a livello molecolare nella membrana tilacoide. Inoltre, molti componenti contribuiscono alla regolazione della luce raccolta (Vedi sopra). Di conseguenza, in molti approcci, i complessi sono stati isolati dalla membrana utilizzando un detergente delicato, come n-dodecil-β-D-maltopyranoside (β-DDM), che solubilizzano la membrana, ma mantenere intatti i complessi FCP. Molti studi spettroscopici sono stati eseguiti utilizzando solubilizzate FCP per indagare intramolecolare energia trasferimento14,15,16,17. Tuttavia, questo approccio ex era limitato poiché il regolamento del trasferimento di energia ha bisogno eccitoniche interazione con altri complessi antenna o fotosistema. Quindi, questi generi di studi non possono essere effettuati con solubilizzate complessi perché l'interazione fra i complessi è perso.
Una caratteristica importante nella regolazione dell'antenna è il "affollamento molecolare" del fotosistema nella membrana tilacoide18e dell'antenna. Precedentemente, è stato realizzato un approccio semplice per simulare questo effetto in vitro. Il detersivo è stato rimosso, che porta all'aggregazione casuale di complessi antenna. Anche se alcuni dati ragionevoli è stati ottenuti da questo approccio17,19, la rimozione del detersivo non riflette la situazione in vivo e presenta alcune limitazioni, poiché i complessi non interagiscono nel loro terziari regolari struttura.
L'uso dei liposomi supera molte delle limitazioni ex. La struttura terziaria è ancora completamente intatta. La membrana del liposoma fornisce un ambiente quasi nativo per i complessi dell'antenna. La membrana separa l'interno del liposoma dall'ambiente esterno. Con questi mezzi, liposomi forniscono due scomparti di reazione per studi di gradienti ionici e pH pure per quanto riguarda i processi di trasporto. Ulteriormente, i parametri del sistema sperimentale possono essere controllati più facilmente per gli studi nella membrana tilacoide. Liposomi già sono stati indicati per essere un ottimo strumento per lo studio di complessi fotosintetici. Degli obiettivi principali in passato era sulla pianta LHC dove l'effetto della composizione lipidica alterato è stato testato su LHC II20. In altri approcci, interazione proteina-proteina tra diversi LHC II sono stati studiati21. Inoltre, alcuni studi in alghe verdi sono stati effettuati che descrivono il clustering spontanea tra LHC22. Considerando l'importanza di diatomee per gli ecosistemi acquatici, relativamente pochi studi sono stati effettuati con complessi antenna di diatomee. Due studi hanno studiato i complessi antenna della centrica Cyclotella meneghiniana, dove il clustering della FCP antenna23 e reattività di FCP a gradienti elettrochimici24 sono stati indicati. Così, i liposomi sono un ottimo strumento per lo studio della diatomea antenne e loro interazione e regolazione in condizioni quasi native. I liposomi sono versatili da molte condizioni come composizione lipidica, liposoma dimensioni, densità di proteina e la fase acquosa circostante può essere controllata. Inoltre, il metodo richiede basse quantità di campioni. Il sistema sperimentale è robusto e altamente riproducibili. La compartimentazione dei liposomi permette lo studio di pH e gradienti ionici, che sono importanti fattori nella regolazione dei complessi antenna.
Qui, descriviamo l'isolamento di complessi antenna FCP da c. meneghiniana e la loro incorporazione in liposomi con composizione lipidica naturale thylakoid. Inoltre, forniamo dati esemplari per la caratterizzazione spettroscopica di FCP solubilizzate e confrontarli con FCP in liposomi. Il metodo riassume conoscenze e protocolli standardizzati ottenuti dai miglioramenti di Gundermann e Büchel 201223, Natali et al 201622e Ahmad e Dietzel 201724.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58017/58017fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica del flusso di lavoro. (1) fa riferimento al paragrafo 1 che descrive la crescita delle cellule, rottura e tilacoidale isolamento con seguito di FCP separazione su gradienti di densità di saccarosio; M. c. -Cyclotella meneghiniana cellule. (2) preparazione della miscela di lipidi naturali thylakoid (MGDG, DGDG e SQDG) descritto nel paragrafo 2 e creazione di micelle lipidiche-detergente con octylglycoside (OG). Una dimensione definita del lipido-micella avviene mediante estrusione utilizzando membrane di un diametro dei pori definiti. FCP e lipido-micelle sono unificate presso un lipide predefinito: rapporto proteine e i detergenti OG e β-DDM vengono rimossi tramite controllata dialisi formando FCP proteoliposomi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58017/58017fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr>Fiale <td></td><td></td><td></td><td>da centrifuga da 500 ml</td></tr><tr><td>centrifuga ad alta velocità</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill VI 2</td><td>Edmund-B&uuml; hler (edmund-buehler.de)</td><td></td><td>versione più recente: Vibrogen-Zellm&uuml; hle Vl 6</td></tr><tr><td>Silibeads S 400 &micro; m</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>5223-7</td><td></td></tr><tr><td>Silibeads S 1,-1,3 mm</td><td>Sigmund-Lindner.com</td><td>4504</td><td></td></tr><tr><td>Imbuto filtrante VitraPOR - por1</td><td>ROBU GmbH</td><td>21121</td><td></td></tr><tr><td>fiale di ultracentrifuagtion in policarbonato (30 mL) per T-865</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>314348</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Discovery 90SE</td><td>Sorvall</td><td>n.a.rotor</td><td></td></tr> <tr><td>T 865</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>51411</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Cell Counter Chamber (migliorata)</td><td>Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)</td><td>T729.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop Primostar (7)</td><td>Optik-Pro (optik-pro.de)</td><td>51428</td><td></td></tr><tr><td>cuvette in vetro ottico (6040-OG)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>"6040-10-10"</td><td></td></tr><tr><td>V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>V-630</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Provette ultra-trasparenti 17 ml per AH629</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>rotore AH629-17-mL</td><td>ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)</td><td>54285</td><td></td></tr><tr><td>Membrana concentrator_Centriprep taglio 30 kDa</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>4307</td><td></td></tr><tr><td>Biometra Minigel-Twin</td><td>Analytik Jena AG (analytik-jena.de)</td><td>846-010-100</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad (bio-rad.com)</td><td></td><td></td>1610449</tr><tr><td>foglio di calcolo per ufficio libero</td><td>La base del documento</td><td>https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/</td><td></td></tr> <tr><td>cuvette di vetro speciali per fluorescenza (101-0S)</td><td>Hellma Analytics (hellma-analytics.com)</td><td>101-10-20</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofluorimetro FP-6500 (incl. software)</td><td>Jasco (jasco.de)</td><td>FP-6500</td><td></td></tr><tr><td>Buffer di caricamento SDS Roti-Load</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>n-ottil &beta;-D-glucopiranoside</td><td>ANATRACE (anatrace.com)</td><td>O311</td><td></td></tr><tr><td>Monogalattosil diacliglicerolo (MGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1300</td><td>fare soluzione madre in cloroformio</td></tr><tr><td>Digalattosil diacilglicerolo (DGDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1310</td><td>fare soluzione madre in cloroformio</td></tr><tr><td>Sulphoquinovosil Diacylglycerol (SQDG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>59-1230</td><td>make soluzione madre in cloroformio</td></tr><tr><td>L-alfa-Fosfatidilglicerolo (PG)</td><td>Larodan AB (larodan.com)</td><td>37-0150</td><td>make soluzione madre in cloroformio</td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidilcolina</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>P3782 SIGMA</td><td>make soluzione madre nel bagno di sonicatore di cloroformio</td></tr><tr><td>S-50TH</td><td>Sonicor (getmedonline.com</td><td>SONICOR-S-50TH</td><td></td></tr><tr><td>mini-estrusore</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in policarbonato Nuleopore</td><td>Avanti Polar Lipids (Avanti.com)</td><td>610005</td><td></td></tr><tr><td>membrana per dialisi Visking 14 kDa cutoff</td><td>ROTH (carlroth.com)</td><td>0653.1</td><td>bollire in acqua distillata prima dell'uso</td></tr><tr><td>Biobeads SM2 Adsorbente</td><td>Biorad (Bio-rad.com)</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio epicloridrina copolimero - Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di ultracentrifuazione in policarbonato (2,7 mL) per TFT 80.4</td><td>Beranek Laborger&auml; te (Laborgeraete-beranek.de)</td><td>252150</td><td></td></tr><tr><td>rotore TFT 80.4</td><td>Millipore (merckmillipore.com)</td><td>54356</td><td></td></tr><tr><td>materiale elencato in ordine di aspetto </td><td></td><td></td><td>Per istruzioni di sicurezza specifiche, fare riferimento alle schede di sicurezza dei materiali e ai relativi manuali. I materiali e le sostanze standard di laboratorio non sono elencati.</td></tr></tbody></table>

isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea cyclotella meneghiniana in liposomi con i lipidi thylakoid

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Le prestazioni fotosintetiche delle piante, alghe e diatomee dipendono fortemente la regolazione veloce ed efficiente di raccolta luce ed energia dei processi di trasferimento nella membrana tilacoide dei cloroplasti. Trasferimento efficiente alla reazione fotosintetica centri anche per quanto riguarda foto-protezione dalla luce eccessiva e la luce raccolta dell'antenna di diatomee, le cosiddette proteine di legame di fucoxantina clorofilla a/c (FCP), sono necessari per l'assorbimento della luce. Il passaggio tra queste due funzioni è una questione di vecchia data di ricerca. Molti di questi studi sono stati effettuati con FCP in micelle detergente. Per gli studi di interazione, i detergenti sono stati rimossi, che ha condotto ad un'aggregazione aspecifica dei complessi FCP. In questo approccio, è difficile distinguere tra manufatti e fisiologicamente rilevanti dati. Quindi, più preziose informazioni sulla FCP e altra luce di membrana associata complessi di raccolta possono essere ottenuti dallo studio di interazioni proteina-proteina, il trasferimento di energia e altre caratteristiche spettroscopiche se sono incorporati nel loro ambiente nativo del lipido. Il vantaggio principale è che i liposomi hanno una dimensione definita e un rapporto definito dei lipidi/proteine mediante il quale viene controllata nella misura di FCP clustering. Ulteriormente, i cambiamenti della composizione ionica e pH che regolano la luce raccolta in vivo facilmente possono essere simulati. In confronto la membrana tilacoide, i liposomi sono più omogeneo e meno complessa, che lo rende più facile ottenere e comprendere dati spettroscopici. Il protocollo descrive la procedura di FCP isolamento e purificazione, preparazione dei liposomi e incorporazione di FCP in liposomi con composizione lipidica naturale. Risultati da un'applicazione tipica sono data e discusse.

Il protocollo descrive l'isolamento della frazione totale di FCP da Cyclotella meneghiniana e incorporazione in liposomi con composizione lipidica nativa. L'isolamento di thylakoid è altamente riproducibile, ma la resa di thylakoid potrebbe cambiare. Il risultato è accettabile se più del 50% di tutti i pigmenti sono recuperati nel passaggio 1.1.4. Più dell'80% è ottimale.
La solubilizzazione dei tilacoidi è un passo fon...

Qui, presentiamo un protocollo per isolare le proteine che legano fucoxantina clorofilla a/c (FCP) da diatomee e incorporarli nei liposomi con composizioni lipidiche naturali per studiare il trasferimento di energia di eccitazione su cambiamenti della composizione dello ione.

Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Questo metodo può aiutarci a comprendere le questioni chiave nella ricerca sulla fotosintesi, come la dissolvenza dell'energia luminosa catturata e dei complessi di raccolta della luce, la sua cinetica e l'efficienza del trasferimento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i liposomi forniscono un compartimento della membrana simile allo stato nativo di una membrana tilacoidale, consentendo studi sui cambiamenti di ioni e pH durante la fotosintesi. Per iniziare il protocollo, centrifugare le cellule di C. meneghiniana precedentemente preparate a 4, 300 volte G in un rotore pre-raffreddato a quattro gradi Celsius con fiale da centrifuga da 500 millilitri per 15 minuti.Risospendere il tampone di omogeneizzazione dei pellet cellulari agitando e pipettando. Trasferire la sospensione in un unico tubo di plastica adatto e limitare il volume finale a 12 millilitri. Quindi, pre-raffreddare il macina perline e l'attrezzatura per circa 60 minuti.Riempire il becher da 50 millilitri fino al 75% con una miscela di perle di vetro e aggiungere la sospensione cellulare. Mescolate con una spatola o una bacchetta di vetro e aggiungete HB se necessario. Per la disgregazione delle celle, utilizzare impulsi di sette per 45 secondi alla massima velocità, con 30 secondi di raffreddamento tra ogni impulso.Filtrare le cellule disgregate su un imbuto filtrante di vetro e lavarle versando l'HB sulle perle di vetro fino a quando non appaiono chiare. Quindi, raggruppare la frazione di lavaggio con il filtrato e mantenere il volume finale inferiore a 150 millilitri. Centrifugare il campione per 15 minuti a 140 volte G utilizzando tre provette di plastica da 50 millilitri per pellettare i detriti cellulari.Trasferire con cautela il surnatante in fiale di ultracentrifugazione in policarbonato da 20 millilitri ed eliminare il pellet. Riempi le fiale con HB. Equilibrare il peso. Centrifugare in un rotore adatto per un'ora a 300, 000 volte G e quattro gradi Celsius per pellettare le membrane tilacoidali.Risospendere il pellet a membrana con il minor quantità possibile di tampone di lavaggio, utilizzando un piccolo pennello da pittore. Riempire le fiale di ultracentrifugazione in policarbonato con il tampone di lavaggio. Equilibra il loro peso.Centrifugarli per 20 minuti a 200, 000 volte G e quattro gradi Celsius. Risospendere le membrane lavate con il pennello da pittore. Raggruppare tutti i tilacoidi in una fiala campione da 15 millilitri.Riempire le provette per ultracentrifugazione con una soluzione a gradiente di saccarosio fino in cima per un volume di un millilitro. Congelare le provette a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono completamente congelate. Quindi, lasciare scongelare i tubi a quattro gradi Celsius.Successivamente, utilizzare i campioni corrispondenti a 125 microgrammi di clorofilla e regolarli con il tampone B1 a un volume di 0,9 millilitri. Per la solubilizzazione, aggiungere N.Dodecyl Beta D maltopyranoside a una concentrazione finale di 20 millimolari. Capovolgere il tubo tre volte.Metterlo sul ghiaccio per 20 minuti agitando delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Centrifugare per cinque minuti a 12.000 volte G in una centrifuga da tavolo pre-raffreddata a quattro gradi Celsius. Caricare il surnatante sul gradiente e non caricare più di 125 microgrammi di clorofilla totale per gradiente se si utilizzano fiale da 17 millilitri.Centrifugare per 22 ore a 100, 000 volte G e quattro gradi Celsius. Recuperare le frazioni di FCP marroni desiderate dal gradiente utilizzando una siringa. Stimare il volume.Quindi, rimuovere un'aliquota da cinque microlitri e diluirla con 995 microlitri di B1A. Quindi, misurare il volume del campione recuperato con una pipetta da cinque millilitri. Lavare i complessi FCP aggiungendo il doppio del volume recuperato con tampone B1 privo di detergenti.Concentrare i campioni in un concentratore a membrana con un cutoff di 30 kilodalton a 1.000 volte G e quattro gradi Celsius con un'assorbanza a 672 nanometri di almeno 20. Pipettare i liquidi in una provetta di reazione da due millilitri e far evaporare il cloroformio con un leggero flusso di azoto e distribuire i lipidi su tutta l'area della base della provetta. Lasciare fluire l'azoto fino a quando tutto il solvente è evaporato.Solubilizzare la miscela lipidica in 29 microlitri di N Octyl beta d glucopiranoside a quattro gradi Celsius per quattro ore. Incubare la miscela lipidica per 10 minuti a 30 gradi Celsius. Quindi, incubare la miscela lipidica in un bagno di sonicazione a 25 gradi Celsius per tre volte per tre minuti.Mettere la miscela sul ghiaccio per 30 secondi tra ogni sonicazione. Aggiungere 221 microlitri di tampone tricina e 250 microlitri di tampone per dialisi quadruplo. Utilizzare un estrusore con membrane in policarbonato da 0,1 micron per ottenere un diametro definito del liposoma di 50-70 nanometri.Assemblare l'estrusore con la membrana e il supporto del filtro. Sciacquare e inumidire l'apparecchiatura, lavorare con attenzione e lentamente per evitare bolle d'aria e serrare accuratamente il gruppo. Riempire una siringa con un tampone per dialisi quattro volte e pre-bagnare l'estrusore fino a quando non si vedono bolle nella seconda siringa.Applicare le micelle del detergente lipidico sull'estrusore e premere la soluzione da una siringa all'altra avanti e indietro. Ripetere questo passaggio cinque volte, fino a quando la soluzione appare omogenea. Passare all'incorporazione dei complessi FCP e aggiungere FCP pari a 20 microgrammi di clorofilla a in un volume totale di 500 microlitri di tampone B1A a 250 microlitri di micelle lipidiche estruse più 250 microlitri di DP quadruplo. Incubare i campioni per tre intervalli di tre minuti ciascuno a 25 gradi Celsius in un termomiscelatore a 1.500-3.000 giri/min, interrotto da una pausa di 30 secondi sul ghiaccio.Tagliare il coperchio di quattro provette di reazione da 1,5 millilitri appena sotto la parte superiore, ottenendo un anello che si adatta ancora al coperchio. Preparare pezzi di membrane per dialisi di 1,5 x 1,5 centimetri e lavarli in 20 millilitri di tampone per dialisi. Riempire ogni coperchio con 250 microlitri di campione.Appoggiare con cura la membrana sul coperchio in modo che lo scomparto sia completamente riempito con il campione e non si formino bolle d'aria. Serrare l'anello del tubo di reazione sul gruppo in modo che lo scomparto sia chiuso. Dializzare i campioni in 50 millilitri di tampone per dialisi in una sola volta per una notte per 12-16 ore su ghiaccio su un agitatore a rotolamento.Sostituire il tampone con un nuovo tampone per dialisi e aggiungere sette milligrammi di perle adsorbenti per rimuovere i detergenti rimanenti per almeno sei ore. Sostituire nuovamente il tampone per dialisi e dializzare i campioni per altre 12 ore. Recuperare i liposomi perforando la membrana di dialisi con una punta per micropipetta da 200 microlitri e aspirare tutti i liposomi dal coperchio del tubo di reazione.Centrifugare i liposomi FCP in almeno due millilitri di tampone per dialisi 1X per 1,5 ore a 100.000 volte G e quattro gradi Celsius. Recuperare i liposomi ruotando la provetta da centrifuga con un angolo di 45 gradi. Lascia che i liposomi si spostino verso il basso per un minuto.Recuperare i liposomi FCP in un volume finale di 25-50 microlitri ed evitare di disturbare il precipitato. Le differenze negli spettri di assorbanza normalizzati indicano la perdita di pigmento, che si verifica nella regione spettrale tra 500 e 550 nanometri, dove i carotenoidi vengono assorbiti. La perdita di pigmento è accettabile se i complessi sono ancora funzionali, indicati da spettri di emissione ed eccitazione simili.La resa di fluorescenza della clorofilla derivante dalla FCP nei liposomi è ridotta a causa dell'interazione eccitonica nei cluster di FCP. L'impatto di un gradiente di ioni potassio sulla resa di fluorescenza FCP è stato testato in presenza di tampone standard, che diminuisce del 30% se viene aggiunto cloruro di potassio. Il gradiente di potassio è stato rilasciato dalla valinomicina, che ripristina la fluorescenza FCP al livello iniziale e corrobora l'ipotesi che i complessi FCP rispondano ai gradienti di concentrazione di ioni potassio in vivo.Seguendo questa procedura, possono essere applicati altri metodi come la fluorescenza tamrasol, la spettroscopia a pompa e la spettroscopia a singola molecola per studiare ulteriori questioni nel trasferimento dell'energia luminosa.

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Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.

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Forniamo un protocollo per in vitro test di auto-organizzazione della mente e la mia su un doppio strato lipidico supportati in una camera aperta. Inoltre, descriviamo come racchiudere il dosaggio del lipido-clad PDMS microcompartments per simulare condizioni in vivo di confinamento di reazione.

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Presentiamo un protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento di enzimi e altri componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche e micrometriche.

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Scopri come isolare le proteine FCP dalla diatomea Cyclotella meneghiniana e incorporarle in liposomi con lipidi di tilacoidi. Questo metodo consente di studiare il trasferimento di energia eccitazionale in condizioni controllate di ioni e pH.

Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid

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