Name: Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri metodi per rilevare l'incorporazione di ribonucleotidi nel DNA del lievito usando elettroforesi su gel alcalino e Southern blot strand-specifico. Questa tecnica permette di quantificare la densità e gli effetti mutageni.

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Ringraziamo tutti i membri attuali ed ex Kunkel Lab per il loro lavoro e discussioni relative al protocollo e riutilizzare i dati presentati qui. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Z01 ES065070 a T.A.K. dalla divisione di ricerca intramurale degli istituti nazionali di salute (NIH), National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS).

1. alcalino idrolisi e Strand-specifico del sud della macchia (Figura 1)
<ol><li>Crescita delle cellule e isolamento di DNA genomic<ol>
<li>Isolare il DNA genomico utilizzando un kit di purificazione di DNA seguendo le istruzioni del produttore del lievito lievito. Utilizzare le culture che sono in fase esponenziale di crescita tra (una densità ottica pari a 0,5) e 1. Risospendere il pellet di DNA finale in 35 mL di 1x buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)).</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di 5 mg/mL RNasi al DNA ed incubare per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Precipitare il DNA utilizzando 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M (pH 5.2) e 2,5 volumi di etanolo al 100% per 20 min su ghiaccio.</li>
		<li>Centrifuga a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Lavare la pallina due volte con 500 mL di etanolo al 70%. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Asciugare il pellet sul banco e risospendere in 35 ml di 1x buffer di TE.</li>
		<li>Quantificare il DNA utilizzando un fluorimetro (Tabella materiali) con il dsDNA BR Assay kit.</li>
		<li>Precipitare 5 mg di DNA da ogni campione utilizzando 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M, volumi di pH 5.2 e 2.5 di 100% EtOH per un volume totale di 200 mL (aggiungere H2O, se necessario, ulteriori 5 mg di DNA è necessario se il controllo di gel neutro è necessario). Incubare in ghiaccio per 20 min.</li>
		<li>Centrifuga a 16.000 x g per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Asciugare il pellet sul banco. Risospendere il DNA in 14 mL di H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>Elettroforesi del gel e idrolisi alcalina<ol>
<li>Aggiungere 6 mL di 1 M di KOH e incubare a 55 ° C per 2 h.</li>
		<li>Incubare i campioni su ghiaccio per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 4 mL di buffer di caricamento DNA alcalino 6x: 300mm KOH, 6 mM EDTA, pH 8.0, polysucrose 18% (Tabella materiali), 0,15% di verde di bromocresolo e 0,25% xilene cianolo FF.</li>
		<li>Eseguire il cast un gel alcalino che si compone di agarosio all'1%, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Utilizzare un pettine che permette di 24 mL di campione di DNA per essere caricato per corsia.</li>
		<li>Esegua il gel a temperatura ambiente in tampone di elettroforesi alcalina 1x: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8.0. Includere un marcatore DNA appropriato.</li>
		<li>Rotazione verso il basso i tubi brevemente e caricare l'intero 24 mL di campione in gel dell'agarosi alcalina. Elettroforesi per 30 min a 30 V, seguita da 18-20 h a 10 V.</li>
		<li>Neutralizzare il gel per 2 incubazioni di 45 minuti ciascuno, a temperatura ambiente con agitazione delicata in tampone di neutralizzazione i: 1 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl.</li>
		<li>Macchia di DNA immergendo il gel neutralizzato in 200 mL di acqua contenente una diluizione di 1/10.000 di macchia SYBR Gold per 2 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.</li>
		<li>Visualizzare il DNA utilizzando un transilluminatore UV. Alcali-sensibilità aumentata provoca la comparsa di piccoli frammenti di DNA, che indica una maggiore densità di ribonucleotidi non riparati in DNA5.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferimento del sud<ol>
<li>Trasferimento del DNA dal gel alcalino alla membrana di nylon caricato positivamente in azione capillare10. Un esempio di come questo trasferimento può essere impostato è fornito in Sambrook e di Russell manuale di10.</li>
		<li>Immergere il gel alcalino per 15 min a temperatura ambiente in tampone di trasferimento alcalino: 0,4 M NaOH, NaCl di 1m.</li>
		<li>Bagnare la membrana di nylon (tagliata alla dimensione del gel) brevemente con acqua e poi in ammollo per 5 min in tampone di trasferimento alcalino.</li>
		<li>Impostare la piattaforma di trasferimento capovolgendo 3 bicchieri in vetro (100 mL) in un pirofila di vetro. Questo piatto deve essere leggermente più grande rispetto alla dimensione del gel dell'agarosi. Impostare una lastra di vetro sopra di loro.</li>
		<li>Drappo 2 grandi pezzi di 3mm CHR cromatografia su carta (tagliare alla misura della larghezza del gel più lati più lunghi che possono drappo sopra i bordi nel serbatoio tampone) sopra la lastra di vetro.</li>
		<li>Versare tampone alcalino trasferire sopra il libro di cromatografia e riempire a metà il piatto di vetro. Appianare le bolle usando una pipetta di vetro da 5 mL.</li>
		<li>Adagiarvi il gel dell'agarosi, ancora appianare le bolle. Circondata da tutti i bordi del gel con parafilm. Versare una piccola quantità di tampone alcalino di trasferire sul gel.</li>
		<li>Posizionare la membrana pre-impregnati in nylon sulla superficie del gel. Appianare le bolle.</li>
		<li>Bagnato 2 pezzi di carta tagliato nella misura del gel dell'agarosi. Sopra la membrana e appianare eventuali bolle.</li>
		<li>Collocare una grande pila di tovaglioli di carta (tagliati a dimensioni leggermente superiori rispetto il gel di agarosio) sulla parte superiore del panino di trasferimento. Posizionare con attenzione una lastra di vetro sopra gli asciugamani di carta. Aggiungere un oggetto ponderato verso l'alto (un libro con una massa di 400 g funziona bene).</li>
		<li>Lasciare che il trasferimento procedere durante la notte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Attentamente smontare lo stack di trasferimento e immergere la membrana per 15 min a temperatura ambiente in tampone di neutralizzazione II: 0.5 M Tris-HCl, pH 7,2, NaCl di 1m.</li>
		<li>Crosslink il DNA per la membrana di nylon caricato utilizzando un reticolante UV. Posizionare la membrana nel reticolante e utilizzare l'impostazione di autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della sonda del sud Nota: L'approccio descritto qui per rilevare siti alcali-sensibile nella nascente leader-contro in ritardo-filo del filo del DNA si basa su un protocollo precedentemente pubblicato11. Per il nostro esperimento, il rilevamento viene eseguita presso il gene reporter URA3 che è stato inserito in uno dei due orientamenti (OR1 o OR2) adiacenti l'origine di replicazione di ARS306 sul cromosoma III (Figura 3A). La presenza di siti alcali-sensibile in DNA genomic di lievito è un indicatore di incorporazione ribonucleotide, permettendo l'uso di ribonucleotidi come biomarcatori del DNA polimerasi attività12,13,14. Questo approccio, utilizzando una sequenza di DNA adiacente per l'efficiente ARS306 origine di replicazione, destinazione dovrebbe essere suscettibile di altre posizioni genomiche e geni bersaglio pure.<ol>
<li>PCR-amplificare una 520-base di segmento di coppia del gene del reporter URA3 utilizzando la seguente coppia di primer: URA3-F1 (a 5 minuti-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) e URA3-R1 (a 5 minuti-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>Eseguire la reazione di PCR utilizzando 10-20 ng di DNA genomico di lievito come un modello, 4 μL di ogni primer (10 stock μM), 10 μL di 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 8 μL di miscela di dNTP (2,5 mM), 0,5 μL di Ex Taq DNA polimerasi (5 U / µ l) e regolare il volume finale di 100 μL con H2O.</li>
		<li>Eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 30 cicli di 95 ° C per 1 min, 55 ° C per 1 min, 72 ° C per 2 min; 72 ° C per 10 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		<li>Purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione di PCR ed eluire il DNA con 50 mL di H2O. Ciò può ora essere utilizzato come modello nella reazione radiolabeling.</li>
		<li>Utilizzare i seguenti primer per radiomarcatura strand-specifiche: uso URA3-A (a 5 minuti-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) per la visualizzazione di DNA che si accoppia alla sonda A. Ciò corrisponde al DNA nascente leader filo quando URA3 è in OR2 e tnascent lagging strand DNA quando URA3 è in OR1. Utilizzare URA3-B (a 5 minuti-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) per la visualizzazione di DNA nascente che accoppia alla sonda B. Ciò corrisponde al DNA nascente leader filo quando URA3 è in OR1 e nascente lagging strand DNA quando URA3 è in OR2 (Figura 3).<ol>
<li>Eseguire la reazione radiolabeling con 10-20 ng amplificato URA3 frammento come modello del DNA, 2 µ l di primer (stock 10 μM), 5 μL di 10 x Ex Taq Buffer (Mg2 + plus), 4 μL di dNTPs 2,5 mM (meno dCTP), 5 μL (50 μCi) di un -32P-dCTP , 0,5 μL di ExTaq DNA polimerasi (5 U / µ l) e regolare il volume finale di 50 μL con H2O. Esegui il seguente programma per radiomarcatura: 94 ° C per 5 min; 25 cicli di 94 ° C per 1 min, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min; 72 ° C per 5 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare una colonna di spin G-25 per rimuovere etichetta radioattivo non incorporata. Prima dell'aggiunta del campione radiomarcato, centrifugare la colonna per 1 min a 720 x g e togliele tampone pipettando. Caricare il prodotto di reazione radiomarcato e centrifugare per 2 min a 720 x g per eluire il probe marcato.</li>
		<li>Incubare a 95 ° C per 5 min denaturare la sonda immediatamente prima dell'ibridazione. Raffreddare brevemente su ghiaccio.</li>
	</ol></li>
	<li>Ibridazione del sud<ol>
<li>Rotoli la membrana a contatto col prodotto in una provetta di ibridazione e aggiungere 25 mL di tampone di ibridazione preparata al momento: tampone fosfato di sodio 0,5 M, pH 7.2, 7% sodio dodecil solfato (SDS), 1% albumina di siero bovino (BSA). Incubare a 65 ° C per 1-2 h con rotazione in un forno di ibridazione.</li>
		<li>Attentamente versare la soluzione e aggiungere 25 mL di tampone di ibridazione più la sonda radiomarcata. Incubare a 65 ° C per 16-18 h con rotazione.</li>
		<li>Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivo. Eseguire 5 lavaggi di 5 minuti ciascuno, a temperatura ambiente con tampone fosfato di sodio di fosfato-SDS lavaggio soluzione i: 40 mM, pH 7,2, pH di 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, 8.0.</li>
		<li>Eseguire 2 lavaggi di 15 minuti ciascuno, a 65 ° C con fosfato-SDS II di soluzione di lavaggio: tampone fosfato di sodio 40 mM, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>Rimuovere la membrana dal tubo dell'ibridazione con pinzette e posto in un protettore manicotto di plastica aperto. Coprire ed esporre a una piastra di imaging. Provare un numero di tempi che vanno da 4 h a 4D di esposizione differente.</li>
		<li>Se necessario, striscia e ri-sonda la macchia usando una sonda diversa circa 3 - 4 volte. Per mettere a nudo, incubare la membrana per 2 h a 65 ° C in 25 mL di una 50% formammide, 2 x SSPE soluzione. Nota: soluzione di riserva x SSPE 20: 3 M di NaCl, 0,2 M NaH2PO4, 0,02 M EDTA, pH 7,4.</li>
		<li>Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivo. Eseguire 2 lavaggi di 15 minuti ciascuno, a 65 ° C in fosfato-SDS II di soluzione di lavaggio.</li>
		<li>Controllare la membrana con un contatore Geiger e ripetere il protocollo "stripping" Se il segnale rimane.</li>
		<li>Eseguire la pre-ibridazione e ibridazione come descritto sopra.</li>
	</ol></li>
</ol>2. misurare il tasso di mutazione e specificità nei ceppi di S. cerevisiae
<ol><li>Preparare la coltura delle cellule<ol>
<li>Inoculare una colonia singola (colonie di 2-3 giorni a 30 ° C alla forma corretta dimensioni del prende di cellule di lievito sano) coltivata su agar YPD supplementato con adenina 100 mg/mL 5 mL di brodo YPDA completato con adenina di 250 mg/mL (il completamento di adenina è necessaria solo se il ceppo utilizzato è un auxotroph di adenina). Crescere in un incubatore shaker o in un rotatore a 30 ° C fino a quando la cultura raggiunge la saturazione (36-48 h per un ceppo senza un difetto di sviluppo severo).</li>
		<li>Rotazione verso il basso le cellule a ~ 2000 x g per 5 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e lavare le cellule con 5 mL di acqua sterile.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 500 mL di acqua sterile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluizione della coltura delle cellule e placcatura<ol>
<li>Per i controlli non-selezione, diluire le cellule in una piastra a 96 pozzetti da un fattore di 1.600.000 e piastra 100 mL di ogni cultura in un piatto completo di (COM).</li>
		<li>Per selezionare per ura3 mutanti, piastra 100 mL di cellule non diluite su un piatto di 5-FOA per un ceppo di wild type (WT). Diluire le cellule di conseguenza se il tasso di mutazione del ceppo di interesse dovrebbe essere superiore a in un ceppo WT.</li>
		<li>Per selezionare per can1 mutanti, diluire 5 volte le cellule e piastra 100 mL su un piatto contenente canavanina (CAN) per un ceppo WT. Il fattore di diluizione è 0,5.</li>
		<li>Incubare le piastre a 30 ° C fino a forma di colonie del lievito. Per i ceppi senza un difetto di crescita, 2-3 giorni è di solito sufficiente per COM e può piastre e 3-5 giorni per piastre 5-FOA. Per confrontare i tassi di mutazione tra diversi ceppi, si consiglia di scegliere il giorno stesso della crescita per contare le colonie. Conservare le piastre pronte essere contato in camera fredda (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolo del tasso di mutazione spontanea<ol>
<li>Contare le colonie visibili su ogni piatto e prendere nota dei numeri di Colonia</li>
		<li>Calcolare il tasso di mutazione usando la formula di Drake: μ = f ÷ ln (μNt). f è la frequenza di mutazione calcolata secondo il numero di mutanti diviso numero di cellule nella coltura finale. NT è il numero di cellule nella coltura finale e μ è il tasso di mutazione. Questa equazione può essere risolta con un metodo iterativo, ad esempio il metodo di Newton-Raphson. Ci sono altri metodi per la stima, compresa la prova di Lea e Coulson, per calcolare il tasso di mutazione15.</li>
		<li>Calcolare l'intervallo di confidenza assumendo registro distribuzione normale delle tariffe reputazione dei singoli isolati. L'intervallo di confidenza del 95% è più spesso utilizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analisi dello spettro di mutazione<ol>
<li>Scegliere una singola Colonia da ogni 5-FOA o può placcare e aggiornare su un piatto YPDA.</li>
		<li>Eseguire la PCR per amplificare il gene URA3 o CAN1 e la sequenza al fine di rilevare le mutazioni utilizzando i seguenti primer della Colonia: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') e URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') per entrambi l'amplificazione di PCR e sequenziamento del gene URA3 bp 800; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') e CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') per l'amplificazione e CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') e (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') per il sequenziamento del gene reporter CAN1 bp 1800.</li>
		<li>Per eseguire la PCR della Colonia, risospendere una singola Colonia in 5 μL di H2O e 1 μL di utilizzare come modello. Aggiungere 1 μL di ciascuno dei primer (5 stock μM), 2 μL di tampone di x KAPA2G 5 (Mg2 + plus), 0,5 μL di dNTP (2,5 mM), 0,5 μL di KAPA2G veloce DNA polimerasi, 12 μL di H2O.</li>
		<li>Per l'amplificazione del gene URA3 , eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 5 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 30 s; 35 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 30 s; 72 ° C per 2 min e permanenza a 4 ° C. Per l'amplificazione del gene CAN1 , eseguire il seguente programma PCR: 95 ° C per 5 min; 5 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 45 s; 35 cicli di 95 ° C per 10 s, 61 ° C per 15 s, 72 ° C per 45 s; 72 ° C per 2 min e permanenza a 4 ° C.</li>
		<li>Allineare i risultati del sequenziamento di una sequenza di riferimento utilizzando un programma come DNASTAR Seqman Pro o Sequencher per identificare mutazioni.</li>
		<li>Compilare i dati di mutazioni di tipo di mutazione (Figura 4) o mutazione posizione (Figura 5). Calcolare le tariffe di mutazione specifica per la frequenza di mutazione (il numero degli eventi osservati diviso per numero di mutanti sequenziati) moltiplicano per il tasso di mutazione globale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo i protocolli per due serie di esperimenti che vengono spesso utilizzati per analizzare semi-quantitativamente ribonucleotidi incorporati durante la replicazione del DNA e gli effetti mutageni di ribonucleotidi non riparati. Sebbene questi approcci comportano eucariote il modello S. cerevisiae, queste tecniche possono essere facilmente adattate ad altri microbi e persino più alti eucarioti.
Sondaggio per ribonucleotidi non riparati nel DNA usando l'elettroforesi alcali...

Durante la replicazione nucleare eucariotiche, ribonucleotidi sono incorporati nel genoma di tutti i tre principali replicases di DNA, DNA polimerasi (Pols) α, ε e δ1,2. Riparazione per escissione RNasi H2-dipendente ribonucleotide (RER3) rimuove la maggior parte di questi ribonucleotidi incorporati.
Un ribonucleotide nel DNA è suscettibile di idrolisi, come il gruppo dell'idrossile 2' della parte dello zucchero in grado di attaccare il legame fosfodiesterico adiacente, rilasciando un'estremità con un 2' - 3' fosfato ciclico e l'altra con un 5'-OH4. Condizioni alcaline possono notevolmente accelerare questa reazione. Così, l'idrolisi di ribonucleotidi incorporati durante l'incubazione in una soluzione di base provoca la frammentazione del DNA genomico, che possa essere visualizzata da alcalino-agarosio elettroforesi5. Questo DNA può essere trasferito ad una membrana e sondato dall'analisi del sud della macchia usando sonde di strand-specific che permettono l'identificazione dei siti alcali-sensibile causato da ribonucleotidi incorporati nel nascente leader - o in ritardo-filo del DNA, rispettivamente.
In cellule di lievito che difetta dell'attività RNasi H2, rimozione di ribonucleotidi può essere avviato quando topoisomerasi io (Top1) Nick il DNA al incorporato ribonucleotide6,7. Tuttavia, quando Top1 si unirà sul lato 3' della ribonucleotide, questo genera 5'-OH e 2' - 3' fosfato ciclico DNA finisce che sono refrattari alla religation. La mancata riparazione o l'elaborazione aberrante di questi 'estremità sporca' può portare a instabilità genomica. Inoltre, se l'incisione avviene all'interno di una sequenza ripetuta di DNA, il processo di ripristino può portare a mutazioni di omissione. Ciò è particolarmente problematico per ripetizioni in tandem, dove breve eliminazioni (di tra due e cinque coppie di basi) sono comunemente osservati in cellule RNasi H2-carenti. Gli effetti deleteri di Top1-dipendente in assenza di lievito RNasi H2 attività sono aggravate in un mutante ε di DNA polimerasi (pol2-M644G) promiscuo per incorporazione ribonucleotide durante la sintesi di filo leader nascente.
Elaborazione di ribonucleotidi in DNA conduce a mutazioni spontanee e la mutagenesi può essere rilevata utilizzando geni reporter appropriato e selezionando per il cambiamento fenotipico accompagnamento. Un test di fluttuazione o esperimento Luria e Delbrück è uno dei metodi più comunemente usati per misurare i tassi di mutazione spontanea utilizzando geni reporter selezionabile8,9. In lievito, i geni URA3 e CAN1 possono essere utilizzati come reporter nel test di mutazione in avanti, che consente il rilevamento di tutti i tipi di mutazione che provocano la perdita della funzione del gene. Il tasso di mutazione spontanea è stimato come la mediana di quello osservato per più culture parallele iniziate dalle singole colonie senza mutazioni del gene del reporter di destinazione. Un lievito ceppo RNasi H2-carente come rnh201Δ ha un tasso di mutazione spontanea nel complesso moderatamente elevato che è in gran parte causato da un'elevata incidenza di 2-5 eliminazioni di bp in tandem ripetere sequenze. Così, per caratterizzare completamente gli effetti mutageni di ribonucleotidi nel genoma, tassi di mutazione specifico necessario determinare. In questo caso, i geni reporter URA3 o CAN1 possono essere amplificati ed ordinati per determinare i tipi e le posizioni delle mutazioni, e tassi di mutazione specifica possono essere calcolati. Compilazione di mutazioni identificate in mutanti URA3 o CAN1 indipendenti multipli quindi può essere utilizzata per generare uno spettro di mutazione.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td>20</td><td>g di destrosio, 20 g di peptone, 10 g di estratto di lievito, in H2O deionizzato fino a 1 L, aggiungere 20 g di Bacto agar per terreni solidi, in autoclave.</td></tr><tr><td>Piastre</td><td></td><td></td> COM <td>1,3 g di miscela di dropout SC, 1,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi o (NH4)2SO4, 5 g di (NH4)2SO4, 20 g di destrosio, 20 g di Bacto agar deionizzato H2O fino a 1 L. Regolare il pH a 5,8. Autoclave e 30 &ndash; 35 ml per piastra.</td></tr><tr><td>Piastre</td><td></td><td></td> CAN <td>1,3 g di polvere di dropout SC-Ura, 1,7 g di lievito base azotata senza aminoacidi o (NH4)2SO4, 5 g di (NH4)2SO4, 20 g di destrosio, 20 g di Bacto agar, 25 mg di uracile e H2O fino a 1 L. Autoclave per 15 minuti a 121 &deg; C e raffreddare a 56 °C. Aggiungere 6 ml di soluzione di solfato di canavanina sterilizzata con filtro.</td></tr><tr>Piastre <td></td><td></td><td>5-FOA</td><td>1,3 g di polvere di dropout SC-Ura, 1,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi o (NH4)2SO4, 5 g di (NH4)2SO4, 20 g di destrosio, 20 g di Bacto agar, 25 mg di uracile e H2O fino a 800 ml. Autoclave per 15 minuti a 121 gradi C e raffreddare a 60 °C. Aggiungere 200 ml di soluzione sterilizzata con filtro allo 0,5% di 5-FOA.</td></tr><tr><td>L-Canavanina solfato</td><td>US Biological</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>US Biological</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 mL provetta</td><td></td><td></td> di coltura in vetro <td>Qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Rotatore di coltura in 30 &deg; Incubatore</td><td></td><td></td> a C <td>L'incubatore shaker può essere utilizzato al suo posto</td></tr><tr>Piastre <td></td><td></td><td>a fondo rotondo a 96 pozzetti</td><td>Sterile, di qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Perle di vetro da 3 mm Fisher</td><td>Scientific</td><td>11-312A</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td> a 12 canali <td>Qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA Polimerasi</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Yeast DNA Kit di purificazione</td><td>Epicentro</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorimetro</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>Modello più recente disponibile</td></tr><tr><td>dsDNA BR Kit di analisi</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>Bromocresolo verde</td><td>Eastman</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>Xilene cianolo FF</td><td>International Technologies Inc.</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminatore</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>Amersham Membrana in nylon Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 MM CHR Carta per cromatografia</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 colonna rotante</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tampone fosfato di sodio (pH 7,2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr>Contatore <td></td><td></td><td></td><td>Geiger</td></tr></tbody></table>

studiare ribonucleotide incorporazione: strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da ribonucleotide di misura

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

La presenza di ribonucleotidi in DNA nucleare ha dimostrata di essere una fonte di instabilità genomica. La misura dell'incorporazione del ribonucleotide può essere valutata da idrolisi alcalina ed elettroforesi su gel come RNA è altamente suscettibile di idrolisi in condizioni alcaline. Questo, in combinazione con l'analisi del sud della macchia può essere utilizzato per determinare la posizione e filo in cui sono stati incorporati i ribonucleotidi. Tuttavia, questa procedura è solo semi-quantitativa e potrebbe non essere abbastanza sensibile da rilevare piccole variazioni nel contenuto ribonucleotide, sebbene filo specifico del sud della macchia di sondaggio migliora la sensibilità. Come misura di uno delle conseguenze biologiche più eclatante di ribonucleotidi nel DNA, mutagenesi spontanea possono essere analizzata usando un'analisi di mutazione in avanti. Utilizzando i geni reporter appropriato, mutazioni rare che comporta la perdita della funzione possono essere selezionata e nel complesso e tassi di mutazione specifica possono essere misurati mediante la combinazione di dati provenienti da esperimenti di fluttuazione con sequenziamento del DNA del gene del reporter. Il test di fluttuazione è applicabile per esaminare un'ampia varietà di processi mutageni in background genetico specifico o le condizioni di crescita.

Trattamento del DNA genomico con alcali seguita da elettroforesi alcalina permette di rilevazione semi-quantitativa della frammentazione del DNA a causa dell'abbondanza di ribonucleotidi stabilmente incorporati. La figura 2 Mostra le immagini di gel di lievito DNA genomic trattato con o senza KOH5. La variante M644L del Pol2, la subunità catalitica della Polε, ha ridotto la capacità di incorporare ribonucleotidi, mentre il mutante M644...

Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande come il numero di ribonucleotidi incorporati nel DNA nascente, principale e ritardato nel genoma. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni quantitative e qualitative sulla densità dei ribonucleaotidici nel genoma del lievito, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i genomi dei mammiferi. L'elettroforesi su gel alcalino fornisce una visione semiquantitativa dell'incorporazione dei ribonucleotidi nell'intero genoma e il southern blotting specifico del filamento consente una maggiore sensibilità e quantificazione in uno specifico locus genomico.Per iniziare questa procedura, aggiungere sei microlitri di idrossido di potassio molare a ciascun campione di DNA genomico di lievito appena preparato e incubare a 55 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, incubare i campioni su ghiaccio per cinque minuti. Quindi aggiungere a ciascun campione quattro microlitri di tampone di caricamento del DNA alcalino 6-6.Fondere un gel alcalino composto dall'1% di agarosio, 50 millimolari di idrossido di sodio e un millimolare EDTA pH otto con un pettine che consente di caricare 24 microlitri di campione di DNA per corsia. Far girare brevemente le provette dei campioni. Caricare tutti i 24 microlitri di ciascun campione nel gel alcalino di agarosio.Includi un marcatore di dimensione del DNA appropriato. Elettroforesi a 30 volt per 30 minuti. Quindi abbassare la tensione a 10 volt ed elettroforare per 18-20 ore.Il giorno seguente, neutralizzare il gel. Immergere il gel nel tampone di neutralizzazione uno e incubare a temperatura ambiente agitando delicatamente per 45 minuti. Sostituire la miscela di tampone di neutralizzazione con un tampone nuovo.E incubare per altri 45 minuti. Per colorare il DNA, immergere il gel neutralizzato in 200 millilitri di acqua contenente una diluizione da uno a 10000 di colorante d'oro sybr a temperatura ambiente agitando delicatamente per due ore. Visualizzare il DNA utilizzando un transilluminatore UV.Il DNA del gel alcalino verrà trasferito su una membrana di nylon caricata positivamente per azione capillare. Per prima cosa immergere il gel alcalino a temperatura ambiente per 15 minuti in un tampone di trasferimento alcalino. Quindi, bagnare brevemente la membrana di nylon con acqua e immergerla in un tampone di trasferimento alcalino per cinque minuti.Impostare la piattaforma di trasferimento capovolgendo tre becher di vetro da 100 millilitri in una teglia di vetro leggermente più grande delle dimensioni del gel di agarosio. Posizionare una lastra di vetro sopra i bicchieri di vetro. Stendere due grandi pezzi di carta per cromatografia MMCHR sulla lastra di vetro.Versare il tampone di trasferimento alcalino sulla carta per cromatografia e riempire a metà il piatto di vetro. Lisciare le bolle con una pipetta di vetro da cinque millilitri. Posizionare sopra il gel di agarosio.Ancora una volta, levigando le bolle. Circondare tutti i bordi del gel con parafilm. Versare una piccola quantità di tampone di trasferimento alcalino sul gel.Posizionare la membrana di nylon preimbevuta sopra il gel e appianare le bolle. Metti due pezzi di carta per cromatografia tagliati delle dimensioni del gel di agarosio. Posizionateli sopra la membrana e livellate le bolle.Posiziona una grande pila di tovaglioli di carta sopra il sandwich di trasferimento e posiziona con cura una lastra di vetro sopra i tovaglioli di carta. Aggiungi un oggetto appesantito sulla parte superiore e lascia che il trasferimento proceda a temperatura ambiente per una notte. Il giorno successivo, smonta con cura la pila di trasferimento.Immergere la membrana a temperatura ambiente nel tampone di neutralizzazione due per 15 minuti. Reticolare il DNA alla membrana di nylon carica utilizzando un reticolante UV. Utilizzare l'impostazione di collegamento incrociato automatico.Prima di iniziare la procedura di ibridazione, preparare la sonda radiomarcata come descritto nel protocollo di testo. Arrotolare la membrana bagnata in una provetta di ibridazione e aggiungere 25 millilitri di tampone di ibridazione appena preparato. Incubare a 65 gradi Celsius con rotazione in un forno di ibridazione per una o due ore.Versare con cura la soluzione e aggiungere 25 millilitri di tampone di ibridazione più la sonda. Incubare a 65 gradi Celsius per 16-18 ore con rotazione. Quindi, versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivi.Aggiungere la soluzione di lavaggio STS fosfato uno al tubo di ibridazione e ruotare a temperatura ambiente per cinque minuti. In questo modo, eseguire cinque lavaggi di cinque minuti ciascuno con la soluzione di lavaggio fosfato STS uno. Dopo il quinto lavaggio con soluzione di lavaggio STS fosfato, lavare due volte la membrana con soluzione di lavaggio STS fosfato, due per 15 minuti ogni volta a 65 gradi Celsius con rotazione.Utilizzare una pinzetta per rimuovere la membrana dal tubo di ibridazione e posizionare la membrana in una protezione di plastica aperta. Coprire ed esporre a una piastra ai fosfori. Se necessario, rimuovere e riprovare il blot con una sonda diversa.Per rimuovere, coprire la membrana con 25 millilitri di una soluzione di formammide 2XSSPE al 50% e incubare a 65 gradi Celsius per due ore. Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivi. Aggiungere la soluzione di lavaggio STS fosfato due al tubo di ibridazione e ruotare a 65 gradi Celsius per 15 minuti.Controllare la membrana con un contatore geiger per confermare l'assenza di segnale prima di eseguire la preibridazione e l'ibridazione come dimostrato in precedenza. Queste immagini su gel hanno il DNA genomico del lievito trattato con o senza idrossido di potassio e mostrano che le cellule prive di RNH2 trattengono più ribonucleotidi nel genoma. La variante M644L della polimerasi due riduce la capacità di incorporare ribonucleotidi, mentre il mutante M644G incorpora più ribonucleotidi rispetto alla polimerasi wild type.Un gel alcalino di agarosio può essere ulteriormente sondato mediante analisi del southern blot specifico del filamento. In questo esempio, le sonde si riuniscono al filamento di DNA principale nascente all'interno del gene reporter URA3 che è stato inserito vicino ad ARS306 in due orientamenti opposti. Risultati rappresentativi del southern blotting utilizzando le sonde specifiche del filamento principale nascente mostrano un pattern di frammentazione del DNA causato dalla scissione alcalina ai ribonucleotidi e al DNA dei filamenti principali nascenti in un ceppo wild type e in ceppi che esprimono le varianti delle polimerasi alfa, delta ed epsilon che sono promiscui per l'incorporazione dei ribonucleotidi.Questo grafico mostra la quantificazione del segnale radioattivo in frazione del totale in ogni corsia dal southern blot. Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare di utilizzare sempre il DNA appena isolato dalle cellule della faccia della serratura. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della riparazione del DNA per quantificare la densità e il filamento in cui i ribonucleotidi sono stati incorporati dalle DNA polimerasi replicative.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento idrolato o HydEn-seq, per rispondere a ulteriori domande, come la posizione dei ribonucleotidi nel genoma. Non dimenticare che lavorare con materiali radioattivi può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni per evitare la contaminazione del banco di lavoro e dell'attrezzatura durante l'esecuzione di questa procedura.

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