Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura
26 luglio 2018
Ribonucleotidi sono tra i più abbondanti nucleotidi non canonico incorporati nel genoma durante la replicazione del DNA nucleare negli eucarioti. Se non correttamente rimosso, ribonucleotidi possono causare mutagenesi e danno del DNA. Qui, presentiamo due approcci sperimentali che sono utilizzati per valutare l'abbondanza di incorporazione ribonucleotide del DNA e dei suoi effetti mutageni.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande come il numero di ribonucleotidi incorporati nel DNA nascente, principale e ritardato nel genoma. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni quantitative e qualitative sulla densità dei ribonucleaotidici nel genoma del lievito, può essere applicato anche ad altri sistemi, come i genomi dei mammiferi. L'elettroforesi su gel alcalino fornisce una visione semiquantitativa dell'incorporazione dei ribonucleotidi nell'intero genoma e il southern blotting specifico del filamento consente una maggiore sensibilità e quantificazione in uno specifico locus genomico.
Per iniziare questa procedura, aggiungere sei microlitri di idrossido di potassio molare a ciascun campione di DNA genomico di lievito appena preparato e incubare a 55 gradi Celsius per due ore. Dopo due ore, incubare i campioni su ghiaccio per cinque minuti. Quindi aggiungere a ciascun campione quattro microlitri di tampone di caricamento del DNA alcalino 6-6.
Fondere un gel alcalino composto dall'1% di agarosio, 50 millimolari di idrossido di sodio e un millimolare EDTA pH otto con un pettine che consente di caricare 24 microlitri di campione di DNA per corsia. Far girare brevemente le provette dei campioni. Caricare tutti i 24 microlitri di ciascun campione nel gel alcalino di agarosio.
Includi un marcatore di dimensione del DNA appropriato. Elettroforesi a 30 volt per 30 minuti. Quindi abbassare la tensione a 10 volt ed elettroforare per 18-20 ore.
Il giorno seguente, neutralizzare il gel. Immergere il gel nel tampone di neutralizzazione uno e incubare a temperatura ambiente agitando delicatamente per 45 minuti. Sostituire la miscela di tampone di neutralizzazione con un tampone nuovo.
E incubare per altri 45 minuti. Per colorare il DNA, immergere il gel neutralizzato in 200 millilitri di acqua contenente una diluizione da uno a 10000 di colorante d'oro sybr a temperatura ambiente agitando delicatamente per due ore. Visualizzare il DNA utilizzando un transilluminatore UV.
Il DNA del gel alcalino verrà trasferito su una membrana di nylon caricata positivamente per azione capillare. Per prima cosa immergere il gel alcalino a temperatura ambiente per 15 minuti in un tampone di trasferimento alcalino. Quindi, bagnare brevemente la membrana di nylon con acqua e immergerla in un tampone di trasferimento alcalino per cinque minuti.
Impostare la piattaforma di trasferimento capovolgendo tre becher di vetro da 100 millilitri in una teglia di vetro leggermente più grande delle dimensioni del gel di agarosio. Posizionare una lastra di vetro sopra i bicchieri di vetro. Stendere due grandi pezzi di carta per cromatografia MMCHR sulla lastra di vetro.
Versare il tampone di trasferimento alcalino sulla carta per cromatografia e riempire a metà il piatto di vetro. Lisciare le bolle con una pipetta di vetro da cinque millilitri. Posizionare sopra il gel di agarosio.
Ancora una volta, levigando le bolle. Circondare tutti i bordi del gel con parafilm. Versare una piccola quantità di tampone di trasferimento alcalino sul gel.
Posizionare la membrana di nylon preimbevuta sopra il gel e appianare le bolle. Metti due pezzi di carta per cromatografia tagliati delle dimensioni del gel di agarosio. Posizionateli sopra la membrana e livellate le bolle.
Posiziona una grande pila di tovaglioli di carta sopra il sandwich di trasferimento e posiziona con cura una lastra di vetro sopra i tovaglioli di carta. Aggiungi un oggetto appesantito sulla parte superiore e lascia che il trasferimento proceda a temperatura ambiente per una notte. Il giorno successivo, smonta con cura la pila di trasferimento.
Immergere la membrana a temperatura ambiente nel tampone di neutralizzazione due per 15 minuti. Reticolare il DNA alla membrana di nylon carica utilizzando un reticolante UV. Utilizzare l'impostazione di collegamento incrociato automatico.
Prima di iniziare la procedura di ibridazione, preparare la sonda radiomarcata come descritto nel protocollo di testo. Arrotolare la membrana bagnata in una provetta di ibridazione e aggiungere 25 millilitri di tampone di ibridazione appena preparato. Incubare a 65 gradi Celsius con rotazione in un forno di ibridazione per una o due ore.
Versare con cura la soluzione e aggiungere 25 millilitri di tampone di ibridazione più la sonda. Incubare a 65 gradi Celsius per 16-18 ore con rotazione. Quindi, versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivi.
Aggiungere la soluzione di lavaggio STS fosfato uno al tubo di ibridazione e ruotare a temperatura ambiente per cinque minuti. In questo modo, eseguire cinque lavaggi di cinque minuti ciascuno con la soluzione di lavaggio fosfato STS uno. Dopo il quinto lavaggio con soluzione di lavaggio STS fosfato, lavare due volte la membrana con soluzione di lavaggio STS fosfato, due per 15 minuti ogni volta a 65 gradi Celsius con rotazione.
Utilizzare una pinzetta per rimuovere la membrana dal tubo di ibridazione e posizionare la membrana in una protezione di plastica aperta. Coprire ed esporre a una piastra ai fosfori. Se necessario, rimuovere e riprovare il blot con una sonda diversa.
Per rimuovere, coprire la membrana con 25 millilitri di una soluzione di formammide 2XSSPE al 50% e incubare a 65 gradi Celsius per due ore. Versare la soluzione in un contenitore per rifiuti radioattivi. Aggiungere la soluzione di lavaggio STS fosfato due al tubo di ibridazione e ruotare a 65 gradi Celsius per 15 minuti.
Controllare la membrana con un contatore geiger per confermare l'assenza di segnale prima di eseguire la preibridazione e l'ibridazione come dimostrato in precedenza. Queste immagini su gel hanno il DNA genomico del lievito trattato con o senza idrossido di potassio e mostrano che le cellule prive di RNH2 trattengono più ribonucleotidi nel genoma. La variante M644L della polimerasi due riduce la capacità di incorporare ribonucleotidi, mentre il mutante M644G incorpora più ribonucleotidi rispetto alla polimerasi wild type.
Un gel alcalino di agarosio può essere ulteriormente sondato mediante analisi del southern blot specifico del filamento. In questo esempio, le sonde si riuniscono al filamento di DNA principale nascente all'interno del gene reporter URA3 che è stato inserito vicino ad ARS306 in due orientamenti opposti. Risultati rappresentativi del southern blotting utilizzando le sonde specifiche del filamento principale nascente mostrano un pattern di frammentazione del DNA causato dalla scissione alcalina ai ribonucleotidi e al DNA dei filamenti principali nascenti in un ceppo wild type e in ceppi che esprimono le varianti delle polimerasi alfa, delta ed epsilon che sono promiscui per l'incorporazione dei ribonucleotidi.
Questo grafico mostra la quantificazione del segnale radioattivo in frazione del totale in ogni corsia dal southern blot. Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare di utilizzare sempre il DNA appena isolato dalle cellule della faccia della serratura. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della riparazione del DNA per quantificare la densità e il filamento in cui i ribonucleotidi sono stati incorporati dalle DNA polimerasi replicative.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento idrolato o HydEn-seq, per rispondere a ulteriori domande, come la posizione dei ribonucleotidi nel genoma. Non dimenticare che lavorare con materiali radioattivi può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni per evitare la contaminazione del banco di lavoro e dell'attrezzatura durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo studio presenta approcci sperimentali per valutare l'incorporazione di ribonucleotidi nel DNA durante la replicazione del DNA nucleare eucariotico. Mette in evidenza gli effetti mutageni potenziali dei ribonucleotidi se non vengono rimossi in modo appropriato.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Replicazione del DNA
- Stabilità genomica
- Mutagenesi
Sfondo
- I ribonucleotidi sono nucleotidi non canonici presenti nel DNA.
- Possono causare danni al DNA se non vengono rimossi.
- Comprendere il loro incorporamento è fondamentale per l'integrità genomica.
- Sono necessari metodi per quantificare l'incorporamento dei ribonucleotidi.
Scopo dello studio
- Quantificare l'incorporazione di ribonucleotidi nel DNA.
- Valutare gli effetti mutageni dei ribonucleotidi.
- Sviluppare metodi applicabili a diversi sistemi genomici.
Metodi Utilizzati
- Elettroforesi su gel alcalino per analisi semi-quantitativa.
- Trasferimento Southern specifico per filamento per una quantificazione sensibile.
- Utilizzo del trattamento con idrossido di potassio per campioni di DNA.
- Incubazione a temperature controllate per risultati ottimali.
Risultati principali
- Dati quantitativi sull'incorporazione di ribonucleotidi nel DNA di lievito.
- Confronto dell'incorporazione tra i filamenti leading e lagging.
- Informazioni sul potenziale mutageno dei ribonucleotidi.
- Applicabilità dei metodi ai genomi di mammiferi.
Conclusioni
- I ribonucleotidi rappresentano un rischio per la stabilità genomica.
- I metodi sviluppati sono efficaci per quantificare l'incorporazione.
- I risultati hanno implicazioni per la comprensione dei meccanismi del danno al DNA.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'incorporazione di ribonucleotidi nel DNA genomico rappresenta una fonte di instabilità che può complicare la validazione degli obiettivi e l'identificazione dei bersagli nella scoperta di farmaci. La quantificazione di questa incorporazione consente una riduzione del rischio meccanicistica, chiarificando le origini della mutagenesi spontanea che potrebbero oscurare le relazioni fenotipo-genotipo nei modelli preclinici. Questa capacità sostiene la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, distinguendo i veri segnali terapeutici dagli artefatti del danno al DNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica se i fenotipi osservati derivino dalla modulazione mirata del bersaglio o da danni al DNA indotti da ribonucleotidi.
- Valore operativo: Fornisce una quantificazione specifica per filamento per ridurre i rischi associati alle ipotesi sulla funzione genica nei sistemi di screening basati su lievito.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Consente la preparazione di ceppi isogenici di lievito con livelli definiti di ribonucleotidi per ottenere sfondi sperimentali costanti.
- Valore operativo: Standardizza il controllo qualità del DNA genomico per ridurre la variabilità negli assay di fluttuazione e nella validazione dei geni reporter.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Misura i tassi di mutagenesi indotta da ribonucleotidi per valutare la stabilità genetica di sistemi rilevanti per le malattie durante colture prolungate.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale dell'integrità genomica in modelli preclinici utilizzati per l'ottimizzazione dei composti promettenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta in cui la validazione dell'obiettivo richiede contesti genetici ben definiti, in particolare quando si utilizzano modelli di lievito per l'analisi dei percorsi metabolici o per lo screening fenotipico.
- Biologia della scoperta: chiarisce se l'incorporazione di ribonucleotidi contribuisce alla mutagenesi di fondo nei saggi di fluttuazione utilizzati per la validazione degli obiettivi.
- Screening: garantisce la coerenza dei reagenti qualificando i campioni di DNA utilizzati nella validazione mediante Southern blot di costrutti genetici.
- Analisi: genera dati quantitativi specifici per il filamento che consentono il confronto tra varianti della polimerasi o contesti genetici diversi nelle campagne di identificazione dei composti promettenti.
- Ricerca traslazionale: monitora parametri di stabilità genomica che informano l'avanzamento corretto per il rischio dalle fasi di identificazione a quelle di sviluppo del capostipite.
- Riutilizzo aziendale: stabilisce un punto di controllo qualità riutilizzabile per l'integrità del DNA genomico in molteplici piattaforme di scoperta basate su lieviti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica quantificando una fonte nota di mutagenesi spontanea negli screening genetici.
- Valore operativo: Introduce standardizzazione nella preparazione dei campioni di DNA, migliorando la riproducibilità tra saggi di fluttuazione e analisi mediante Southern blot.
- Valore strategico: Aumenta la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione del progetto controllando i fattori confondenti legati ai danni del DNA nei dati di validazione dell'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio identificando modelli con livelli elevati di ribonucleotidi che potrebbero richiedere strategie di mitigazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nella manipolazione degli acidi nucleici, nelle tecniche con sonde radioattive e nell'ibridazione mediante Southern blot.
- Attrezzatura per elettroforesi su gel alcalino, incrociatore UV e fosforimager per il rilevamento del segnale.
- Protocolli standardizzati per il trattamento con idrossido di potassio, la neutralizzazione e il trasferimento su membrana, al fine di garantire coerenza tra diversi laboratori.
- Le considerazioni per l'adattamento includono l'ottimizzazione della progettazione delle sonde per diversi loci genomici e la regolazione dei tempi di idrolisi in base alla qualità variabile dei campioni di DNA.
- I limiti pratici comprendono la natura semi-quantitativa dei gel alcalini in assenza di Southern blot e i rischi associati ai materiali radioattivi, che richiedono procedure specializzate di smaltimento dei rifiuti.
