L'uso del Mouse Splenocytes per valutare Pathogen-associated Molecular Pattern influenza sull'espressione del Gene dell'orologio

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'immunologia e della cronobiologia, come ad esempio il modo in cui i componenti microbici alterano l'orologio molecolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono la facilità di esecuzione, la valutazione degli effetti di diversi componenti microbici sull'orologio molecolare e l'elevata riproducibilità. Per iniziare il protocollo, preparare il terreno di coltura aggiungendo siero fetale bovino a RPMI 1640 a una concentrazione finale del 10%Preparare 10 millilitri di terreno di provocazione per ciascuno dei PAMP da testare in provette da 50 millilitri aggiungendo il terreno di coltura PAMP elencato.

Spruzzare un tronco di topo precedentemente preparato con etanolo al 70% e pulirlo con un tovagliolo di carta. Posiziona il mouse sul retro, leggermente inclinato sul lato destro. Quindi, taglia via la pelliccia usando le forbici da dissezione lungo il lato sinistro del topo, circa a metà strada tra le zampe anteriori e posteriori.

Usando una pinza, afferra il peritoneo e fai con cura un'incisione senza danneggiare la milza. Rimuovere la milza con una pinza e metterla in una provetta sterile da 50 millilitri contenente circa 10 millilitri di terreno di coltura su ghiaccio. Quindi trasferire la milza con due millilitri di terreno di coltura in una piccola capsula di Petri sterile.

Omogeneizzare la milza macinandola tra la parte glassata di due vetrini smerigliati sterili. Una volta accuratamente omogeneizzato, pipettare i due millilitri di terreno di coltura contenente gli splenociti attraverso un colino cellulare di nylon da 40 micron in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere otto millilitri di terreno di coltura a freddo a ciascuna delle provette da 50 millilitri contenenti gli splenociti, per un volume totale di 10 millilitri per provetta.

Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro. Aggiungere circa una volta 10 al sesto di cellule per pozzetto a piastre di coltura a sei pozzetti. Dopo aver aggiunto le cellule, aggiungere tre millilitri di terreno di coltura o tre millilitri di terreno di sfida alle cellule.

Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre ore. Raschiare le cellule dal fondo del pozzetto utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 microlitri collegato a una micropipetta P1000. Con lo stesso puntale della pipetta, trasferire il terreno contenente le cellule in una provetta da 15 millilitri.

Pellettare le celle a 167 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare con cinque millilitri di PBS. Dopo aver pellettato le celle una seconda volta a 167 volte g per cinque minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere 600 microlitri di tampone di lisi al pellet cellulare.

Isolare l'RNA dagli splenociti utilizzando il kit di estrazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore ed eseguire la digestione del DNA su colonna opzionale. Sintetizzare il cDNA per ciascuno dei campioni utilizzando il kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 10 microlitri di RNA per ciascuno dei campioni in un volume totale di reazione di 20 microlitri.

Estrarre l'mRNA da alcuni campioni di controllo in una provetta da 0,5 millilitri per preparare il cDNA da utilizzare per la curva standard durante l'esecuzione della PCR quantitativa. Aggiungere 10 microlitri di master mix di trascrittasi inversa 2X. Al termine della trascrizione inversa, aggiungere 10 microlitri di acqua alla provetta di reazione, che funge da concentrazione iniziale nella serie di diluizione per la curva standard.

Eseguire una serie di diluizioni dieci volte aggiungendo 45 microlitri di acqua in quattro provette da 0,5 millilitri designate 10 per il meno uno, 10 per il meno due, 10 per il meno tre e 10 per il meno quattro. Aggiungere cinque microlitri della concentrazione iniziale uno nella seconda provetta, 10 a quello meno, utilizzando un micropipettatore P20. Miscelare pipettando su e giù più volte, quindi trasferire cinque microlitri dalla provetta da 10 a quella meno uno nella provetta designata da 10 alla provetta meno due e mescolare.

Trasferire cinque microlitri utilizzando una micropipetta P20 dal tubo da 10 a meno due nel tubo designato da 10 a meno tre e mescolare. Infine, trasferire cinque microlitri utilizzando un micropipettatore P20 dalla provetta da 10 a quella meno tre nella provetta designata da 10 a meno quattro e mescolare. Preparare la reazione in modo che contenga 0,5 microlitri del saggio della sonda primer, cinque microlitri di master mix di espressione genica, due microlitri di acqua e 2,5 microlitri di cDNA.

Pipettare i campioni di RNA in una piastra qPCR a 96 pozzetti. Incubare saggi con sonda primer per vari geni dell'orologio molecolare e includere un test per un controllo endogeno e caricarlo in una macchina qPCR per determinare la quantificazione relativa dei livelli di mRNA. All'interno della configurazione sperimentale, selezionare la quantificazione, la curva standard relativa e la chimica TaqMan.

Quindi, modificare il volume di reazione a 10 microlitri. Inserire le informazioni rilevanti nel layout della targa. La qPCR è stata eseguita su RNA isolato per valutare i livelli di espressione relativa dei geni dell'orologio molecolare, clock, Per2, Dbp e Rev-erb alfa.

Dopo la sfida PAMP, i livelli di espressione dell'orologio non erano significativamente diversi rispetto alle cellule di controllo. I livelli di espressione di Per2 erano significativamente elevati nelle cellule sottoposte a LPS e ODN1826 rispetto ai controlli non contestati. LPS è stato l'unico PAMP ad alterare l'espressione di Rev-erb alfa poiché i livelli di mRNA erano significativamente più bassi rispetto ai controlli non contestati.

Livelli di mRNA significativamente più bassi sono stati osservati per Dbp dopo la sfida con ciascuno dei PAMP rispetto ai controlli. Seguendo questa procedura, molecole diverse dai PAMP possono essere utilizzate per valutare la loro influenza sull'orologio molecolare negli splenociti.