Name: Luso del Mouse Splenocytes per valutare Pathogen-associated Molecular Pattern influenza sullespressione del Gene dellorologio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Scopri come valutare l'influenza dei PAMP sull'espressione dei geni dell'orologio molecolare utilizzando splenociti di topo. Questo metodo riproducibile collega immunologia e cronobiologia per studiare i ritmi circadiani.

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Questo lavoro è stato supportato da assegni di ricerca di facoltà dall'ufficio il College delle arti e del preside di Scienze presso l'Università di Hartford.

Durante lo studio, trattamento e cura degli animali in osservanza politica National Institutes of Health, erano in conformità con le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato di uso e cura animali istituzionale degli animali Università di Hartford.
1. trascinamento degli animali
Nota: Venti settimana-vecchio maschio B6129SF2/J topi sono usati nello studio.
<ol><li>Salire sul treno topi per una 12 ore di luce (luce standard testa bianca) / 12h scuro ciclo per 2 settimane prima dell'esperimento. Nota: Qui tempo zeitgeber (ZT) 0 corrisponde a luci su e ZT12 a luci spente, mantenendo tutti gli altri fattori ambientali (cioè, alimento, acqua e temperatura ambiente) costante 21.</li>
</ol>2. preparazione di strumenti, terreno di coltura e sfida Medium
<ol><li>Autoclave pinze e le forbici per dissezione. Avvolgere le coppie di vetrini da microscopio smerigliato in foglio di alluminio e autoclave.</li>
	<li>Preparare mezzo di coltura con l'aggiunta di siero bovino fetale (FBS) di RPMI 1640 a una concentrazione finale di 10%. Preparare 10 mL di terreno di sfida in provette da 50 mL aggiungendo il seguente PAMPs al terreno di coltura (RPMI con 10% FBS); LPS (5 µ g/mL), ODN1826 (5 µ g/mL), calore-ucciso Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), o un altro PAMP nella sua concentrazione suggeriti.</li>
	<li>Caldo terreno di coltura e sfida medio a 37 ° C in un bagno d'acqua e tenere circa 70 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS, pH 7,2) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di terreno di coltura utilizzando una pipetta da 10 mL e pipetta aiuti per un tubo da 50 mL e posto sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere circa 30 mL di etanolo al 70% a un'estremità di Becher e posto di 100ml di forbici e forcipe di dissezione nel bicchiere graduato per evitare la contaminazione microbica.</li>
	<li>Preparare il tampone di lisi per isolamento del RNA aggiungendo 10 µ l di β-mercaptoetanolo (sotto cappa aspirante) per ogni 1 mL di Buffer RLT in una provetta da 50 mL. Fare solo l'importo che sarà necessario (600 µ l per campione, che consiste di circa 1 x 106 cellule). Nota: Il Buffer RLT è un componente del kit di estrazione di RNA che supporta l'associazione di RNA per la membrana di silice.</li>
</ol>3. Splenocyte isolamento e sfida
<ol><li>Eutanasia topi in un momento di particolare zeitgeber tramite narcosi mantenendoli nella loro gabbia originale e aggiungendo CO2 alla gabbia ad una portata di 3 L/min continua fornitura di CO2 per 1 min dopo l'arresto della respirazione.</li>
	<li>Confermare la morte tramite dislocazione cervicale posizionando il pollice e il dito indice su entrambi i lati del collo alla base del cranio. In alternativa, premere una canna alla base del cranio mentre si tira rapidamente (con l'altra mano) la base della coda o le zampe per causare la separazione delle vertebre cervicali dal cranio22.</li>
	<li>Spruzzare il tronco del mouse con etanolo al 70% e asciugare con un tovagliolo di carta. Posizionare il mouse sulla sua schiena e leggermente inclinata sul fianco destro. Tagliare via la pelliccia, mediante dissezione Forbici, lato sinistro del mouse, circa a metà strada tra la parte anteriore e le zampe posteriori.</li>
	<li>Usando il forcipe, afferrare il peritoneo e incidete con attenzione per non danneggiare la milza. Rimuovere la milza con le pinzette e posto in una provetta sterile da 50 mL contenente circa 10 mL di terreno di coltura su ghiaccio. Ripetere per gli altri animali. Nota: La milza è il colore di un fagiolo, ed è più lungo e più piatta rispetto il rene.</li>
	<li>
Trasferire una milza con 2 mL di terreno di coltura per un piccolo piatto di Petri sterile.
	<ol>
<li>Omogeneizzare la milza di macinandolo fra la parte glassata di due diapositive smerigliati sterile. Se possibile, mantenere il problema e le cellule nel medium durante il processo di omogeneizzazione.</li>
		<li>Una volta accuratamente omogeneizzato, pipettare 2 mL di terreno di coltura contenente gli splenocytes attraverso un colino di cella di 40 µm in nylon in una provetta da 50 mL.</li>
		<li>Ripetere i passaggi sopra riportati per le milze rimanenti utilizzando nuove coppie di diapositive smerigliati, provette da 50 mL con terreno di coltura e filtri di cella.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 8 mL di terreno di coltura fredda a ciascuna delle provette 50ml contenente gli splenocytes per un volume totale di 10 mL/tubo. Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Aggiungere circa 1 x 106 cellule/pozzetto in piastre di coltura 6 pozzetti. Aggiungere celle per il numero di pozzetti che corrispondono al numero di diversi PAMPs viene utilizzato per l'esperimento e includere un controllo bene. Aggiungere 3 mL di terreno di coltura o 3 mL di terreno di sfida a tutti i pozzetti.</li>
	<li>Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO2 per 3 h.</li>
	<li>Raschiare le cellule dal fondo del bene usando un puntale da 1.000 µ l collegato a una micropipetta P1000. Trasferire il supporto che contiene le celle utilizzando la stessa punta di dispensare 1.000 µ l in una provetta da 15 mL.</li>
	<li>Agglomerare le cellule tramite centrifugazione a 167 x g per 5 min a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 5 mL di PBS.</li>
	<li>Agglomerare le cellule una seconda volta a 167 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e aggiungere 600 µ l di tampone di lisi per il pellet cellulare per lisare le cellule. Procedere all'isolamento del RNA.</li>
</ol>4. isolamento RNA e la sintesi del cDNA
<ol><li>Isolare il RNA da splenocytes utilizzando il kit di estrazione di RNA secondo le istruzioni del produttore ed eseguire la digestione di DNA in colonna 'optional'.</li>
	<li>Prima sintesi del cDNA, calcolare la concentrazione di RNA mediante uno spettrofotometro di microvolume per verificare che la concentrazione sia all'interno della gamma ottima di RNA (fino a 2 µ g) di kit di sintesi di cDNA.</li>
	<li>
Synthesize cDNA per ciascuno dei campioni utilizzando il kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 10 µ l di RNA per ognuno dei campioni in un volume di reazione totale di 20 µ l. Al completamento della trascrizione inversa (thermocycler esegue) aggiungere 20 μL H2O ad ogni reazione.
</li>
	<li>Costruire la curva standard utilizzando una micropipetta P10 o P20 per piscina mRNA da alcuni campioni di controllo (ad esempio, 5 µ l da 2 campioni per un totale di 10 µ l) in una provetta 0,5 mL per preparare il cDNA.<ol>
<li>Aggiungere 10 µ l 2 x mix master della trascrittasi inversa.</li>
		<li>Al completamento della trascrizione inversa, aggiungere 10 µ l di H2O al tubo di reazione, che servirà come la concentrazione iniziale ("1") della serie di diluizione per la curva standard.</li>
		<li>Eseguire una serie di diluizioni 10 volte (da 1 a 10-4) con l'aggiunta di 45 µ l di acqua utilizzando una micropipetta P100 o P200 nelle quattro provette 0,5 mL indicate 10-1, 10-2, 10-3e 10-4.<ol>
<li>Aggiungere 5 µ l di concentrazione iniziale "1" nel primo tubo (10-1) usando una micropipetta P20, mix pipettando su e giù parecchie volte, quindi trasferire 5 µ l dalla provetta 10-1 nel tubo indicato 10-2 e mix.</li>
			<li>Trasferire 5 µ l utilizzando una micropipetta P20 dal 10-2 tubo nel tubo indicato 10-3 e mescolare. Trasferire 5 µ l usando una micropipetta P20 dal 10-3 tubo nel tubo indicato 10-4 e mescolare.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. quantitativo reazione a catena della polimerasi (qPCR)
<ol><li>Determinare la quantificazione relativa dei livelli di mRNA di qPCR. All'interno l'allestimento sperimentale, selezionare "Quantificazione – relativa curva Standard" e "TaqMan" chimica. Cambiare il volume di reazione a 10 µ l. Immettere le informazioni rilevanti nel layout del piatto (ad es., gene bersaglio, curva standard, giornalista, ecc.).</li>
	<li>Preparare la reazione, in modo che esso contiene 0,5 µ l del dosaggio primer/sonda, 5 µ l di mix master di espressione genica, 2 µ l di H2O e 2,5 µ l di cDNA (10 – 100 ng).<ol>
<li>Preparare un mix master moltiplicando ciascuno dei reagenti precedenti (tranne il cDNA) per il numero di reazioni, assicurandosi di includere quelli dalla curva standard, controlli negativi, esibendosi ogni reazione in duplicato e 2 reazioni supplementare che rappresenteranno per variazione di pipettaggio.</li>
		<li>Dispensare 7,5 µ l del mix master preparati in pre-determinati pozzetti in una piastra di reazione a 96 pozzetti con una micropipetta o una pipetta multicanale. Dispensare 2,5 µ l di cDNA nel pozzo appropriato per le incognite e gli standard e 2,5 µ l di H2O nei pozzetti di controllo negativo.</li>
		<li>Sono saggi di primer/sonda per vari geni orologio molecolare e includono un'analisi per un controllo endogeno (ad es., β-actina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al fine di determinare i valori relativi di espressione, calcolare la quantità relativa media per ogni replica, quindi, per ogni campione, dividere la quantità relativa media per il gene dell'obiettivo di quantità relativa media per β-actina.</li>
</ol>6. elaborazione statistica
<ol><li>Utilizzando software di analisi statistica, inserire i dati nel programma sotto l'opzione di statistiche di colonna. Selezionare un one-way ANOVA con il test post-hoc di Dunnett per valutare le differenze tra i valori medi di espressione del gene dell'orologio dopo la sfida PAMP contro il controllo.</li>
</ol>

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L'autore non ha nulla di divulgare.

All'interno di questo protocollo, uno spettrofotometro di microvolume può essere utilizzato per quantificare e valutare la purezza del RNA utilizzato nel determinare l'espressione genica. Acidi nucleici assorbono UV luce a 260 nm, proteine in genere assorbono la luce a 280 nm, mentre altri potenziali contaminanti utilizzati durante una procedura di estrazione di RNA (ad es., fenolo) sono rilevabili a 230 nm. Pertanto, valutando l'assorbanza (A) rapporto a 260/280 nm (RNA alla proteina) e 260/230 nm (RNA a protei...

Il master clock nei mammiferi, che orchestra oscillazioni 24h per quasi tutti gli aspetti della fisiologia e del comportamento, si trova all'interno del nucleo soprachiasmatico (SCN) dell'ipotalamo1,2. Oltre alla regolazione di processi biologici a livello organico, il master clock sincronizza anche periferici Orologi Cellulari in tutto il corpo3,4,5. Mentre il macchinario di orologio molecolare è costituito da almeno tre cicli di feedback trascrizionale traslazionale ad incastro, il nucleo è composto il periodo (Per1-3), crittocromo (Cry1-2), Bmal1, e orologio geni6,7. Oltre a mantenere la tempistica accurata dell'orologio molecolare core, anche alcuni prodotti del gene orologio accessorie (ad es., Rev-erbα e Dbp) regolano l'espressione dei geni dell'orologio non, cioè, orologio geni controllati (GCC)6 , 7.
Orologi molecolari funzionali sono state descritte in vari tessuti immuni (ad es., milza e linfonodi)8 e cellule (ad es., B cellule, cellule dendritiche, macrofagi)8,9. Queste cellule rilevare e rispondere ai pattern molecolari associati (PAMPs), conservati componenti microbici, attraverso recettori di riconoscimento immune innata come recettori Toll-like (TLR)10. Ad oggi, sono stati descritti 13 funzionale TLR, che riconoscono costituenti microbici quali componenti della parete cellulare batterica, proteina fustigatrice e acidi nucleici microbici10. La PAMP, lipopolisaccaride (LPS), un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, riconosciuto da TLR4, è stato indicato per alterare i ritmi circadiani a livello sia organismica e molecolare. Ad esempio, in vivo sfida di LPS indotto da ritardi di fase fotica-come misurata dall'attività in topi11 e portato a orologio ridotta espressione genica nel SCN e nel fegato come determinato mediante ibridazione in situ e PCR quantitativa, rispettivamente, in ratti12. Dopo una sfida in vivo con LPS, analisi del sangue periferico umano leucociti13 e tessuto adiposo sottocutaneo14 ha rivelato alterata espressione di diversi geni dell'orologio come misurato tramite qPCR. Infine, ex vivo sfide LPS di macrofagi umani e macrofagi peritoneali del topo, inoltre ha condotto ad alterata espressione dell'orologio come misurato da qPCR14.
Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'influenza dei LPS PAMPs, ODN1826 (oligonucleotidi sintetici contenenti unmethylated CpG motivi) e calore-ucciso Listeria monocytogenes (HKLM), riconosciuto da TLR4, TLR9 e TLR2, rispettivamente, il espressione genica di orologio molecolare negli splenocytes del topo. Il protocollo comprende lo splenectomy mouse, isolamento splenocyte e sfida, RNA estrazione, sintesi del cDNA e qPCR per valutare l'espressione di diversi geni dell'orologio. Questo protocollo permette l'acquisizione tempestiva di un gran numero di cellule del sistema immunitario con molto piccolo animale o manipolazione cellulare, che può quindi essere contestato ex vivo con vari PAMPs. L'orologio molecolare è stato indicato per modulare i vari aspetti della risposta immunitaria8,15,16, pertanto, rottura dell'orologio molecolare molto probabilmente potrebbe compromettere la corretta variazione dipendente dal tempo della risposta immunitaria. Inoltre, poiché le interruzioni dei ritmi circadiani possono portare a gravi patologie17,18,19,20, può essere di interesse per i ricercatori di sfidare gli splenocytes con una vasta gamma di molecole e valutare la loro influenza sull'orologio.

<table><tbody><tr><td>Vetrini smerigliati</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ltrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>ODN1826</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-1826-1</td><td></td></tr><tr><td>HKLM</td><td>InvivoGen</td><td>Tlrl-hklm</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-043</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104 o 74106</td><td></td></tr><tr><td>Set DNasi senza RNasi</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td>Denville</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 50 mL</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Saggi di espressione genica b-actin</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00607939_s1</td><td></td></tr><tr><td>Saggi di espressione genica TaqMan Per2</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00478113_m1</td><td></td></tr><tr><td>Saggi di espressione genica TaqMan Rev-erba</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00520708_m1</td><td></td></tr><tr><td>Saggi di espressione genica TaqMan Bmal1</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00500226_m1</td><td></td></tr><tr><td>Saggi di espressione genica TaqMan Dbp</td><td>ThermoFisher</td><td>Mm00497539_m1</td><td></td></tr><tr><td>macchina qPCR StepOnePlus</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Piastra di reazione rapida a 96 pozzetti (0,1 mL)</td>Software di analisi statistica <td>ThermoFisher</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prism 7.0a</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l'uso del mouse splenocytes per valutare pathogen-associated molecular pattern influenza sull'espressione del gene dell'orologio

The Use of Mouse Splenocytes to Assess Pathogen-associated Molecular Pattern Influence on Clock Gene Expression

Dal comportamento di espressione genica, i ritmi circadiani regolano quasi tutti gli aspetti della fisiologia. Qui, presentiamo una metodologia per sfidare splenocytes del topo con il pattern molecolari associati (PAMPs) lipopolysaccharide (LPS), il ODN1826 e il calore-ucciso Listeria monocytogenes ed esaminare il loro effetto su molecolare circadiano orologio. In precedenza, studi si sono concentrati sull'esame l'influenza di LPS sull'orologio molecolare usando una varietà di approcci in vivo ed ex vivo da un assortimento di modelli (ad es., topo, ratto e umani). Questo protocollo descrive l'isolamento e la sfida di splenocytes, nonché la metodologia per valutare la post-sfida espressione di gene di orologio tramite PCR quantitativa. Questo approccio può essere utilizzato per valutare non solo l'influenza di componenti microbiche sull'orologio molecolare ma anche altre molecole che può alterare l'espressione dell'orologio. Questo approccio potrebbe essere utilizzato per prendere in giro a pezzi il meccanismo molecolare di come l'interazione di PAMP-Toll-like receptor influenza espressione dell'orologio.

Topi sono stati sacrificati a ZT13, splenocytes sono stati isolati e contestato ex vivo con il LPS PAMPs, ODN1826 o HKLM. Dopo 3 h, RNA è stato isolato e qPCR è stato utilizzato per valutare i livelli di espressione relativa dei geni orologio molecolare orologio, Per2, Dbp e Rev-erbα rispetto alle cellule di controllo incontrastato. Dopo la sfida PAMP, i livelli di espressione di Clock non erano significativamente differenti che l'espr...

Questo protocollo descrive una tecnica usando splenocytes del topo per scoprire pattern molecolari associati che alterano l'espressione genica di orologio molecolare.

L'uso del Mouse Splenocytes per valutare Pathogen-associated Molecular Pattern influenza sull'espressione del Gene dell'orologio

From behavior to gene expression, circadian rhythms regulate nearly all aspects of physiology. Here, we present a methodology to challenge mouse ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'immunologia e della cronobiologia, come ad esempio il modo in cui i componenti microbici alterano l'orologio molecolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono la facilità di esecuzione, la valutazione degli effetti di diversi componenti microbici sull'orologio molecolare e l'elevata riproducibilità. Per iniziare il protocollo, preparare il terreno di coltura aggiungendo siero fetale bovino a RPMI 1640 a una concentrazione finale del 10%Preparare 10 millilitri di terreno di provocazione per ciascuno dei PAMP da testare in provette da 50 millilitri aggiungendo il terreno di coltura PAMP elencato.Spruzzare un tronco di topo precedentemente preparato con etanolo al 70% e pulirlo con un tovagliolo di carta. Posiziona il mouse sul retro, leggermente inclinato sul lato destro. Quindi, taglia via la pelliccia usando le forbici da dissezione lungo il lato sinistro del topo, circa a metà strada tra le zampe anteriori e posteriori.Usando una pinza, afferra il peritoneo e fai con cura un'incisione senza danneggiare la milza. Rimuovere la milza con una pinza e metterla in una provetta sterile da 50 millilitri contenente circa 10 millilitri di terreno di coltura su ghiaccio. Quindi trasferire la milza con due millilitri di terreno di coltura in una piccola capsula di Petri sterile.Omogeneizzare la milza macinandola tra la parte glassata di due vetrini smerigliati sterili. Una volta accuratamente omogeneizzato, pipettare i due millilitri di terreno di coltura contenente gli splenociti attraverso un colino cellulare di nylon da 40 micron in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere otto millilitri di terreno di coltura a freddo a ciascuna delle provette da 50 millilitri contenenti gli splenociti, per un volume totale di 10 millilitri per provetta.Determinare il numero di cellule per millilitro utilizzando un emocitometro. Aggiungere circa una volta 10 al sesto di cellule per pozzetto a piastre di coltura a sei pozzetti. Dopo aver aggiunto le cellule, aggiungere tre millilitri di terreno di coltura o tre millilitri di terreno di sfida alle cellule.Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre ore. Raschiare le cellule dal fondo del pozzetto utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 microlitri collegato a una micropipetta P1000. Con lo stesso puntale della pipetta, trasferire il terreno contenente le cellule in una provetta da 15 millilitri.Pellettare le celle a 167 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet cellulare con cinque millilitri di PBS. Dopo aver pellettato le celle una seconda volta a 167 volte g per cinque minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere 600 microlitri di tampone di lisi al pellet cellulare.Isolare l'RNA dagli splenociti utilizzando il kit di estrazione dell'RNA secondo le istruzioni del produttore ed eseguire la digestione del DNA su colonna opzionale. Sintetizzare il cDNA per ciascuno dei campioni utilizzando il kit di trascrizione inversa secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 10 microlitri di RNA per ciascuno dei campioni in un volume totale di reazione di 20 microlitri.Estrarre l'mRNA da alcuni campioni di controllo in una provetta da 0,5 millilitri per preparare il cDNA da utilizzare per la curva standard durante l'esecuzione della PCR quantitativa. Aggiungere 10 microlitri di master mix di trascrittasi inversa 2X. Al termine della trascrizione inversa, aggiungere 10 microlitri di acqua alla provetta di reazione, che funge da concentrazione iniziale nella serie di diluizione per la curva standard.Eseguire una serie di diluizioni dieci volte aggiungendo 45 microlitri di acqua in quattro provette da 0,5 millilitri designate 10 per il meno uno, 10 per il meno due, 10 per il meno tre e 10 per il meno quattro. Aggiungere cinque microlitri della concentrazione iniziale uno nella seconda provetta, 10 a quello meno, utilizzando un micropipettatore P20. Miscelare pipettando su e giù più volte, quindi trasferire cinque microlitri dalla provetta da 10 a quella meno uno nella provetta designata da 10 alla provetta meno due e mescolare.Trasferire cinque microlitri utilizzando una micropipetta P20 dal tubo da 10 a meno due nel tubo designato da 10 a meno tre e mescolare. Infine, trasferire cinque microlitri utilizzando un micropipettatore P20 dalla provetta da 10 a quella meno tre nella provetta designata da 10 a meno quattro e mescolare. Preparare la reazione in modo che contenga 0,5 microlitri del saggio della sonda primer, cinque microlitri di master mix di espressione genica, due microlitri di acqua e 2,5 microlitri di cDNA.Pipettare i campioni di RNA in una piastra qPCR a 96 pozzetti. Incubare saggi con sonda primer per vari geni dell'orologio molecolare e includere un test per un controllo endogeno e caricarlo in una macchina qPCR per determinare la quantificazione relativa dei livelli di mRNA. All'interno della configurazione sperimentale, selezionare la quantificazione, la curva standard relativa e la chimica TaqMan.Quindi, modificare il volume di reazione a 10 microlitri. Inserire le informazioni rilevanti nel layout della targa. La qPCR è stata eseguita su RNA isolato per valutare i livelli di espressione relativa dei geni dell'orologio molecolare, clock, Per2, Dbp e Rev-erb alfa.Dopo la sfida PAMP, i livelli di espressione dell'orologio non erano significativamente diversi rispetto alle cellule di controllo. I livelli di espressione di Per2 erano significativamente elevati nelle cellule sottoposte a LPS e ODN1826 rispetto ai controlli non contestati. LPS è stato l'unico PAMP ad alterare l'espressione di Rev-erb alfa poiché i livelli di mRNA erano significativamente più bassi rispetto ai controlli non contestati.Livelli di mRNA significativamente più bassi sono stati osservati per Dbp dopo la sfida con ciascuno dei PAMP rispetto ai controlli. Seguendo questa procedura, molecole diverse dai PAMP possono essere utilizzate per valutare la loro influenza sull'orologio molecolare negli splenociti.

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Genetica

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Valutazione della carica batterica nella milza del topo per studi di infezione

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Scopri come valutare l'influenza dei PAMP sull'espressione dei geni dell'orologio molecolare utilizzando splenociti di topo. Questo metodo riproducibile collega immunologia e cronobiologia per studiare i ritmi circadiani.

L'uso del Mouse Splenocytes per valutare Pathogen-associated Molecular Pattern influenza sull'espressione del Gene dell'orologio

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