Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico. Come l'uso del pesce zebra per generare modelli genetici di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione precoce dei genotipi utilizzando un semplice metodo ad alto rendimento.

Sebbene questo metodo possa consentire una ricerca approfondita utilizzando modelli di epilessie genetiche di zebrafish, può essere applicato anche ad altri modelli di malattie genetiche e a qualsiasi tipo di studio delle mutazioni. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà in quanto la transezione della pinna larvale deve essere eseguita con precisione all'interno della fessura del pigmento della coda. Prima di iniziare il taglio delle pinne delle larve di zebrafish, preparare la superficie di dissezione.

Fissare un pezzo di nastro adesivo per autoclave sulla superficie interna di un coperchio di una capsula di Petri di nove centimetri e posizionare il coperchio sotto uno stereomicroscopio. Preparare un puntale per pipetta P1000 per accogliere una larva a tre dpf con uno stress minimo, tagliando l'estremità del puntale della pipetta a un diametro di due millimetri. Mettere da tre a cinque giorni dopo la fecondazione, o dpf, le larve di zebrafish in una capsula di Petri e anestetizzarle in tricaina da 1,5 millimolari in 1x terreno embrionale E3.

Utilizzando la micropipetta P1000 modificata, prelevare e anestetizzare la larva di pesce zebra e posizionarla sul nastro dell'autoclave posizionato sul coperchio della capsula di Petri. Rimuovere la soluzione di tricaina in eccesso che circonda la larva. L'area dovrebbe essere il più asciutta possibile per sezionare e raccogliere con successo la pinna, ma ancora bagnata per garantire la sopravvivenza.

Per evitare il sanguinamento e garantire la sopravvivenza della larva durante il taglio delle pinne, la transezione deve avvenire all'interno della fessura del pigmento. Distale al limite della circolazione sanguigna, come indicato in questa immagine. Lavorando al microscopio stereoscopico, utilizzare un micro bisturi per sezionare la pinna caudale.

Durante l'incisione, applicare una pressione costante ma delicata verso il basso per evitare di danneggiare la notocorda. Visualizza la pinna sezionata al microscopio e posiziona il pezzo sopra la punta della lama del micro bisturi. Posizionare il micro bisturi contenente l'aletta sulla superficie di un piccolo pezzo di carta da filtro.

A causa della presenza di melanociti nel tessuto sezionato, la pinna appare come una piccola macchia nera. Per garantire il successo dell'estrazione del DNA, è importante osservare un punto nero che segna il posizionamento della pinna sulla carta da filtro prima di continuare con il protocollo. Utilizzando forbici e pinzette, trasferire la carta da filtro contenente l'aletta in un pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti contenente 25 microlitri di una soluzione di idrossido di sodio da 50 millimolari.

Quindi, preparare una piastra per coltura tissutale a fondo piatto a 96 pozzetti, numerando i pozzetti in base all'etichetta della piastra PCR. Utilizzando la pipetta P1000 modificata, riempita con 200 microlitri di terreno embrionale e3 fresco, raccogliere con cura la larva di pesce zebra esercitando una leggera pressione. Erogare la larva nella piastra a 96 pozzetti nello stesso numero di pozzetti della piastra PCR.

Assicurarsi che la carta da filtro contenente l'aletta sia ben immersa nella soluzione. Per evitare la contaminazione incrociata tra ogni taglio, pulire la lama del microbisturi e le pinzette immergendole in una soluzione di etanolo al 70%. Pulisci la lama con un fazzoletto di carta pulito o un panno.

Quando tutte le larve sono state tagliate, conservare le larve nella piastra a 96 pozzetti a 28 gradi Celsius fino a quando i loro genotipi non sono stati identificati. Iniziare questa procedura sigillando la piastra PCR a 96 pozzetti contenente i pezzi delle alette e centrifugando i campioni a 1000 volte G per un minuto. Assicurarsi che tutte le carte da filtro siano immerse nella soluzione di idrossido di sodio.

Per la lisi dei tessuti, riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Seguito dal raffreddamento a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, aggiungere sei microlitri di tris-HCL pH8.0 da 500 millimolari a ciascun campione.

Vortice i campioni. Centrifugare brevemente la piastra a 1500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Per estrarre il DNA genomico utilizzando questo metodo, agganciare l'aletta come dimostrato in precedenza, ma aggiungere la carta da filtro con l'aletta tagliata a un pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti contenente 30 microlitri di resina chelante al 5%.

Dopo che tutti i pezzi delle alette sono stati tagliati, sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare brevemente i campioni per assicurarsi che tutte le carte da filtro siano immerse con la resina chelante. Riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 gradi Celsius per 15 minuti, quindi raffreddarli a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare brevemente i campioni per pellettare le perle di resina e ottenere il DNA nella sospensione.

Un test PCR multiplex consentirà la discriminazione tra mutanti omozigoti, eterozigoti e larve di tipo selvatico. Impostare la reazione PCR come descritto nel protocollo di testo. Eseguire le reazioni PCR in termociclatore a 96 pozzetti.

Preparare un gel di agarosio all'1% in tampone di borato di sodio, colorato con 1x gel rosso. Per facilitare il processo, se possibile, utilizzare un sistema di gel compatibile con le pipette multicanale per consentire una maggiore produttività riducendo il tempo di caricamento dei campioni. Far funzionare il gel in 1 tampone di borato di sodio a 250 volt per 15 minuti.

Visualizzare il gel sotto la luce ultravioletta per consentire la discriminazione dei diversi genotipi. Iniziare questo test preparando due gel di poliacrilammide al 12% utilizzando la piastra distanziatrice da 1,5 millimetri e i 15 pettini del campione come descritto nel protocollo di testo. Utilizza un sistema di elettroforesi verticale e 1x tampone TBE come buffer di corsa.

Dopo aver eseguito la PCR come descritto nel protocollo di testo, riscaldare i prodotti PCR a 94 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddarli a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Caricare 10 microlitri per campione di PCR e otto microlitri di marcatore di peso molecolare. Far funzionare il gel a 150 volt per un'ora, o fino a quando il marcatore del peso molecolare raggiunge quasi la linea del piede della lastra di vetro.

Visualizzare il gel sotto la luce ultravioletta per consentire la discriminazione dei diversi genotipi. Questo protocollo è stato utilizzato per genotipizzare la progenie di un incrocio eterozigote, in cui l'ileale mutante ha un'inserzione di 5 coppie di basi nel primo esone di rivestimento del gene aldh7a1. Il risultato atteso dall'amplificazione PCR sia di ileali wild type che mutanti è un amplicone di 434 BP.

Una banda di 293 BP deriva dall'amplificazione dell'ileale mutante e una banda di 195 BP si ottiene per l'ileale wild type. L'analisi delle reazioni PCR su un gel di borato di sodio all'agarosio all'1% ha identificato genotipi wild type nelle corsie due e sei, genotipi eterozigoti nelle corsie tre, quattro e cinque e un genotipo mutante omozigote nella corsia uno. Varie mutazioni sono state genotipizzate mediante un saggio di fusione eteroduplex.

Gli ileali mutanti plpbpot101 e plpbpot102 del gene plpbp consentono ciascuno uno spostamento di frame e un codone di arresto precoce. Dopo la denaturazione e la ricottura, i frammenti PCR per animali eterozigoti conterrebbero DNA eteroduplex e omoduplex che possono essere facilmente separati e visualizzati utilizzando elettroforesi su gel di poliacrilammide. I genotipi mutanti eterozigoti composti sono stati identificati nelle corsie due, quattro e otto, i genotipi eterozigoti nelle corsie tre, sei, sette, nove e dieci e un genotipo wild type nella corsia cinque.

Una volta padroneggiata, la tosatura di 96 larve con questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora, se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il raggruppamento di larve di zebrafish dello stesso genotipo per l'estrazione dei tessuti, possono essere eseguiti e ordinati per rispondere a ulteriori domande, come l'indagine sui biomarcatori e i modelli di malattia. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo dei modelli di epilessia metabolica per esplorare la fisiologia del percorso della malattia nel pesce zebra.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come genotipizzare correttamente le larve di pesce zebra di tre giorni mediante microdissezione di una pinna caudale.