Name: Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri un metodo di genotipazione ad alto rendimento per larve di Danio rerio a 72 ore post-fertilizzazione tramite pinna clipping. Questa tecnica consente l'identificazione precoce dei genotipi per modelli di malattie genetiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori vorrei ringraziare i rari modelli di malattia e meccanismo (RDMM) rete (finanziato da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR) e Genome Canada). CK è supportato da un premio di studio UROP (Università di Ottawa). DLJ è supportato da una borsa di studio di laurea Canada Vanier. IAP è supportato da un premio di postdoctoral fellowship istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Gli autori ringraziano la genetica Society of America per la concessione dell'autorizzazione per pubblicare questo protocollo e utilizzare un adattamento della figura 5 supplementare da Pena, et al.

Le procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati e sono conformi alle linee guida di cura degli animali fornite dal Consiglio canadese su Animal Care e Università di Ottawa comitati di cura degli animali.
1. preparazione
<ol><li>Preparare la superficie di dissezione registrando un coperchio di scatola di Petri di 9 cm con nastro autoclave in tutta la sua superficie interna. Posizionarlo sotto un microscopio stereo.</li>
	<li>Posizionare la post-fecondazione 3-5 giorni (dpf) larve di zebrafish in un Petri dish e anestetizzare in ˜1.5 mM tricaina nei media di 1 x E3 dell'embrione (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, pH 7,2).</li>
	<li>Tagliare l'estremità della punta di una pipetta di P1000 con un paio di forbici o una lama di rasoio per un diametro di 2 mm per accogliere una larva di dpf 3 con minimo sforzo.</li>
</ol>2. pinna ritaglio delle larve di Zebrafish
<ol><li>Pick up una larva anestetizzata utilizzando la micropipetta P1000 modificata e appoggiare la larva di pesce zebra sul nastro autoclave posizionato sul coperchio scatola di Petri.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di tricaina in eccesso che circondano la larva utilizzando una micropipetta. La zona dovrebbe essere asciutta come possibile con successo sezione e ritirare la pinna ma ancora bagnato per assicurare la sopravvivenza.</li>
	<li>Usando un bisturi micro sezione caudale sotto un microscopio stereo come indicato in Figura 1, come descritto in Wilkinson et al.16. Durante l'incisione, applicare una pressione costante all'interno del sito di gap del pigmento della pinna caudale, distale al limite della circolazione sanguigna (Figura 1A). Applicare una leggera pressione per evitare di danneggiare la notocorda.</li>
	<li>Visualizzare la pinna sezionata al microscopio e posizionare il pezzo sopra la punta della lama microscalpel (Figura 2A). Posizionare il microscalpel contenente la pinna sulla superficie di un piccolo pezzo di carta da filtro. Nota: A causa della presenza dei melanociti nel tessuto transected, questo passaggio permette la visualizzazione della pinna come un piccolo punto nero (Figura 2B).</li>
	<li>Utilizzando le forbici e pinzette (Figura 2), trasferire la carta da filtro contenente la pinna per una piastra PCR a 96 pozzetti, contenente 25 μL di soluzione di NaOH 50 mM per pozzetto (Figura 2D).</li>
	<li>Preparare una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto, numerazione il bene secondo l'etichetta della piastra PCR. Con la pipetta di P1000 modificata riempita con 200 µ l di fresco 1 x E3 media di embrione, raccogliere con cura la larva di pesce zebra con una leggera pressione. Dispensare la larva nella piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti, nello stesso numero bene come la piastra PCR (Figura 2E).</li>
	<li>Assicurarsi che la carta da filtro sia ben immersa nella soluzione (Figura 2F). Pulire la lama del microscapel e pinzette tra ciascuno tagliato per evitare la contaminazione incrociata di immersione in soluzione di 70% EtOH. Pulire la lama con tessuto/salvietta di carta pulita.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.1-2.7 tutti gli embrioni sono stati ritagliati.</li>
	<li>Memorizzare le larve nella piastra a 96 pozzetti a 28 ° C, finché non sono stati identificati i genotipi. Nota: I media di embrione non ha bisogno di essere cambiato, poiché il protocollo può essere facilmente completato in meno di 2 giorni. Se è necessario più tempo, è consigliato un cambiamento di media.</li>
</ol>3. genomic DNA estrazione
<ol><li>Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare i campioni a 1.000 x g per 1 min per assicurarsi che tutti i giornali di filtro sono sommerse all'interno della soluzione di NaOH.</li>
	<li>Per la lisi del tessuto, riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 ° C per 5 min seguita da un raffreddamento a 4 ° C per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 6 μL di 500 mM Tris-HCl, pH 8.0 a ciascun campione. Vortice.</li>
	<li>Centrifugare brevemente la piastra a 1.500 x g, per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzare 1,5 μL del surnatante del DNA per reazione di PCR.</li>
	<li>Preparare una PCR al genotipo le larve, come illustrato nella tabella 1-2. Nota: Il presente protocollo è stato testato per due applicazioni: multiplex reazioni di PCR, rivelando il genotipo utilizzando gel di agarosio9e dell'eteroduplex fusione assay (HMA) rivelando i genotipi utilizzando gel di poliacrilammide elettroforesi (pagina)17.</li>
</ol>4. alternativa estrazione genomico usando una resina chelante
<ol><li>Completare il passaggio 2.5 con l'aggiunta di carta da filtro con la pinna ritagliata a una piastra PCR a 96 pozzetti, contenente 30 μL del 5% chelanti resina (copolimero di stirene-divinilbenzene contenenti ioni iminodiacetate accoppiati). Nota: Questo tipo di resina viene comunemente utilizzato per la preparazione di DNA PCR-pronto in un modo veloce ed efficiente18e lisi del tessuto.</li>
	<li>Seguire i passaggi 2.6-2.8 come indicato.</li>
	<li>Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare brevemente i campioni per assicurarsi che tutti i carta da filtro è sommerso all'interno la resina chelante.</li>
	<li>Per la lisi del tessuto, riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 ° C per 15 min, seguito da un raffreddamento a 4 ° C per 10 min. Nota: Questo passaggio permette di lisi e successivo legame di perline resina polar a componenti cellulari mentre DNA e RNA rimangono in soluzione.</li>
	<li>Centrifugare brevemente i campioni per pellet le perle di resina e ottenere il DNA nella sospensione.</li>
	<li>Seguire i passaggi 3.5-3.6 per completare la procedura di genotipizzazione.</li>
</ol>5. applicazione 1: Multiplex PCR seguita da analisi del Gel dell'agarosi
<ol><li>Seguendo la tabella 1, impostare una reazione di PCR multiplex per consentire la discriminazione tra mutanti omozigoti, eterozigoti e larve WT. Utilizzare un termociclatore 96 pozzetti per eseguire le reazioni di PCR utilizzando il ciclismo condizioni descritte nella tabella 3. Nota: Le reazioni di PCR possono essere eseguite anche in qualsiasi altro cycler termico PCR convenzionale. Questo esempio descrive la strategia PCR utilizzata da Pena, et al. 9 per identificare aldh7a1 WT e gli alleli del mutante 5-bp inserimento nella stessa reazione multiplex.</li>
	<li>Preparare un gel di agarosio 1% in tampone borato di sodio, macchiato con 1 x GelRed. Nota: 20x stock tampone borato di sodio è fatto di 40 mL di NaOH 10 M, 1800 mL di ddH2O, pH regolato a 8.5 con 76 g di acido borico e poi completato a volume finale di 2 L utilizzando ddH2O.</li>
	<li>Esegua il gel in tampone borato di sodio 1 x 15 min a 250 V. Per facilitare il processo, se possibile, utilizzare un sistema gel compatibile con pipette multicanale per attivare le funzionalità di throughput superiore riducendo il tempo di caricare i campioni.</li>
	<li>Il gel sotto la luce ultravioletta (UV) per permettere la distinzione dei diversi genotipi dell'immagine.</li>
</ol>6. applicazione 2: Eteroduplex saggio di fusione
<ol><li>Preparare la pagina 12% gel utilizzando la piastra distanziatrice di 1,5 mm e i pettini 15-campioni. Preparare due gel di pagina utilizzando 12,21 mL di ddH2O, 2,52 mL di 10x Tris/Borato/EDTA (TBE), 10 mL di 30% di acrilammide, 250 μL di 10% ammonio persolfato (APS) e 20 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED). Utilizzare 1 x TBE buffer (0,089 M Tris-HCl, acido borico 0,089 M e 0,002 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)) come tampone di corsa.</li>
	<li>Riscaldare i prodotti di PCR a 94 ° C per 5 min.</li>
	<li>Lasciare raffreddare le provette su ghiaccio o nel termociclatore per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Caricare 10 µ l per campione PCR e 8 μL di marker di peso molecolare.</li>
	<li>Eseguire la pagina a 150 V in 1 x TBE utilizzando un sistema di elettroforesi verticale per 1 h o fino a quando il marcatore di peso molecolare quasi raggiunge la linea del piede della lastra di vetro.</li>
	<li>Il gel sotto luce UV per permettere la distinzione dei diversi genotipi dell'immagine.</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Stewart, A. M., Kalueff, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+better+and+more+valid+animal+models+of+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developing better and more valid animal models of brain disorders.</a> Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).</li>
<li>Grone, B. P., Baraban, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+epilepsy+research%3A+legacies+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Animal models in epilepsy research: legacies and new directions.</a> Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J Vis Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+targeted+gene+disruption+in+zebrafish+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases.</a> Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).</li>
<li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3491146/">In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li>
<li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Pena, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-Dependent+Epilepsy+in+Zebrafish+Caused+by+Aldh7a1+Deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency.</a> Genetics. 207, 1501-1518 (2017).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, 2410(2013).</li>
<li>Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+ablation+of+dopaminergic+neurons+leads+to+transient+locomotor+impairments+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae.</a> J Neurochem. 135, 249-260 (2015).</li>
<li>Scheldeman, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28888969">Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis.</a> Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).</li>
<li>Zabinyakov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+knock-out+aldh7a1+zebrafish+model+for+pyridoxine-dependent+epilepsy+using+CRISPR-Cas9+technology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology.</a> PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).</li>
<li>Grone, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy%2C+behavioral+abnormalities%2C+and+physiological+comorbidities+in+syntaxin-binding+protein+1+%28STXBP1%29+mutant+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish.</a> PLoS One. 11 (3), (2016).</li>
<li>Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of transgenic zebrafish.</a> Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).</li>
<li>Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+PCR-based+genotyping+of+larval+zebrafish+tail+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies.</a> Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+genotyping+method+for+genome-modified+animals+and+human+cells+generated+with+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system.</a> Sci Rep. 4, 6420(2014).</li>
<li>Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelex+100+as+a+medium+for+simple+extraction+of+DNA+for+PCR-based+typing+from+forensic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.</a> Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).</li>
<li>Ewing, B., Green, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basecalling+of+automated+sequencer+traces+using+phred.+II.+Error+probabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities.</a> Genome Res. 8, 175-185 (1998).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Gene strumenti di editing sono state impiegate per introdurre precisamente mutazioni e transgeni in zebrafish negli ultimi anni5,6,7,8. Durante la malattia di modellazione in zebrafish, primi fenotipi larvali o giovanili sono spesso osservati9,12,13,14. Il protocollo ...

Il danio zebrato (Danio rerio) è un organismo vertebrato ampiamente utilizzato come modello per le indagini di malattia anche per quanto riguarda il test preclinici di ipotesi terapeutiche1,2,3. Questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA in embrioni4. Attraverso il crescente sviluppo del romanzo transgenico e gene editing tecnologie quali Zinc-Finger nucleasi (ZFN)5, TAL-come effettore nucleasi (TALENs)6,7e il cluster regolarmente intervallate breve Palindromo si ripete (CRISPR) / CRISPR-collegata 9 (Cas9) sistema8, zebrafish è pronta a migliorare sostanzialmente la comprensione delle diverse condizioni patologiche. Queste tecnologie sono state utilizzate per creare forature mirate in entrambi somatiche e cellule germinali in zebrafish, efficientemente nascimenti geneticamente modificati animali8. Esempi recenti nella letteratura includono lo sviluppo positivo di modelli genetici di epilessia e disturbi metabolici in zebrafish3,9,10,11,12 .
Con i progressi compiuti in zebrafish editing genomico, rapida e affidabile la genotipizzazione è diventato un innegabile punto dilimitazione. Identificazione delle specifiche mutazioni del DNA adiacente al luogo di destinazione prevista modifica del genoma è una fase essenziale del protocollo. Tradizionalmente, tecniche di genotipizzazione di ritaglio pinna sono di solito solo eseguita in zebrafish giovanile o adulta. Tuttavia, il tempo speso zebrafish sensibilizzazione all'età adulta (> 2 mesi) ritarda considerevolmente gli avanzamenti nella ricerca. In molti casi, l'età adulta non può essere realizzato a causa il Ko di geni essenziali (ad es., nella modellazione di malattia) o mutazioni con guadagno di funzione che conduce agli effetti nocivi fenotipici. Inoltre, diversi saggi richiedono la messa in comune delle larve, come estrazione RNA o metabolita e coinvolgono così l'identificazione preventiva dei genotipi, che può essere difficile quando sono disponibili solo post hoc, tecniche di genotipizzazione. Questi esempi di cui sopra evidenziano l'importanza delle tecniche di genotipizzazione larvale allo stesso tempo preciso e consentono il recupero completo e normale sviluppo delle larve. Genotipizzazione di zebrafish fase precoce non sembra attualmente essere ampiamente usato; Questo si riflette da recenti pubblicazioni dei modelli di malattia in cui larvali genotipi sono identificati tramite post mortem genotipizzazione anziché genotipizzazione prima dell'esecuzione dell'esperimento12,13,14. In questa carta, una strategia di clip pinna larvale è presentata con l'obiettivo di migliorare le procedure di genotipizzazione precedentemente stabilito.
In passato, strategie che impiegano la digestione della proteinasi K a genotipo live zebrafish larve hanno portato alla variabile della polimerasi reazione a catena (PCR) efficienza15. Anche se più recentemente pubblicato tecnica di biopsia della coda al microscopio fornito più promettenti risultati16, noi e altri gruppi non erano in grado di riprodurre l'alta efficienza e recupero di DNA segnalati dagli autori. Una grave battuta d'arresto del protocollo descritto da Wilkinson et al. 16 potrebbe essere il trasferimento del tessuto coda nella provetta PCR. Grazie alle sue dimensioni microscopiche, è difficile garantire che la pinna è stato correttamente raccolti e dispensata da pipettaggio. Per affrontare questa barriera, abbiamo sviluppato un protocollo migliore per grandi numeri di genotipizzazione di larve di zebrafish live con quasi il 100% di efficienza9. Utilizzando un microscalpel, la punta della coda pinna è rimosso e collocata su un pezzo di carta da filtro. Il pezzo di carta da filtro contenente il tessuto può essere visualizzato prontamente e correttamente inserito in un tubo PCR. Estrazione del DNA genomico viene quindi eseguita, seguita dall'amplificazione di PCR della regione di interesse al genotipo del campione. I vantaggi di questo metodo includono un alta efficienza PCR, un basso tasso di falsi positivi e un tasso di mortalità basso. Inoltre, la genotipizzazione di un gran numero di embrioni è possibile utilizzando questo protocollo. Il protocollo descritto nel presente documento consente pinna-ritaglio di centinaia di larve all'interno di 2-3 h utilizzando questo approccio e la corretta identificazione di pesce genotipizzati e rigenerazione di coda entro due giorni.

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Microscalpel</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina/Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>PCR a 96 pozzetti piatto</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>S25548A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris base&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>5% Chelex 100 sodico forma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 1x</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Sub-Cell Model 192</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>30 % soluzione di acrilammide/bis, 37,5: 1</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix, 2</td> salviette di carta <td>Promega</td><td>M7123</td><td></td></tr><tr><td>(panni usa e getta Kimwipes)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>marcatore di peso molecolare da oltre 1 kb&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1343</td><td></td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi&nbsp;</td><td>Sistema Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 (sistema su gel di agarosio ad alto rendimento)</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1704508</tr><tr><td>sistema verticale di elettroforesi su gel Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td></td><td></td>1658004</tr></tbody></table>

estrazione del dna high-throughput e genotipizzazione delle larve di zebrafish 3dpf di pinna clipping

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possiedono ortologhi per l'84% dei geni conosciuti per essere associati con malattie umane. Inoltre, questi animali hanno un tempo di generazione breve, sono facili da gestire, visualizzare un alto tasso riproduttivo, basso costo e sono facilmente suscettibili di manipolazioni genetiche di microiniezione di DNA negli embrioni. Gli avanzamenti recenti nel gene strumenti di editing consentono precisa introduzione di mutazioni e transgeni in zebrafish. Malattia di modellazione in zebrafish spesso porta a fenotipi larvali e morte precoce, che può essere difficile da interpretare se genotipi sono sconosciuti. Questa identificazione precoce dei genotipi è anche necessario negli esperimenti che richiedono la messa in comune di campione, come studi di gene expression o massa spettrometria. Tuttavia, vasta selezione genotipica è limitata dai metodi tradizionali, che nella maggior parte dei laboratori vengono eseguite solo su zebrafish adulto o nelle larve post mortem. Abbiamo affrontato questo problema adattando un metodo per l'isolamento di DNA genomic di PCR-pronto da larve di zebrafish live che può essere raggiunta anche prima, come la post-fecondazione 72h (hpf). Questo tempo e tecnica economica, migliorato da un protocollo di genotipizzazione precedentemente pubblicati, permette l'identificazione di genotipi da biopsie di pinna al microscopio. Le pinne rigenerano rapidamente come si sviluppano le larve. I ricercatori sono quindi in grado di selezionare e raccogliere i genotipi desiderati all'età adulta utilizzando questa procedura basata sulla PCR genotyping di alto-rendimento.

L'efficienza del protocollo è stato dimostrato dalla genotipizzazione la prole di una croce eterozigoti (aldh7a1+ ot100, qui indicato come aldh7a1+ /-) (Figura 3A- C)9. L'allele del mutante aldh7a1ot100ha un inserimento 5-base pair (bp) nel primo esone codifica del gene aldh7a1 di zebrafish che conduce a frameshift e perdita di funzio...

Zebrafish sono stati usati come organismi modello genetico affidabile nella ricerca biomedica, soprattutto con l'avvento delle tecnologie di modifica del gene. Quando sono previsti fenotipi larvali, identificazione di estrazione ed il genotipo di DNA può essere impegnativo. Qui, descriviamo una procedura efficiente genotipizzazione per larve di zebrafish, coda di ritaglio, più presto 72 h post-fertilizzazione.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico. Come l'uso del pesce zebra per generare modelli genetici di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione precoce dei genotipi utilizzando un semplice metodo ad alto rendimento.Sebbene questo metodo possa consentire una ricerca approfondita utilizzando modelli di epilessie genetiche di zebrafish, può essere applicato anche ad altri modelli di malattie genetiche e a qualsiasi tipo di studio delle mutazioni. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà in quanto la transezione della pinna larvale deve essere eseguita con precisione all'interno della fessura del pigmento della coda. Prima di iniziare il taglio delle pinne delle larve di zebrafish, preparare la superficie di dissezione.Fissare un pezzo di nastro adesivo per autoclave sulla superficie interna di un coperchio di una capsula di Petri di nove centimetri e posizionare il coperchio sotto uno stereomicroscopio. Preparare un puntale per pipetta P1000 per accogliere una larva a tre dpf con uno stress minimo, tagliando l'estremità del puntale della pipetta a un diametro di due

high-throughput-dna-extraction-genotyping-3dpf-zebrafish-larvae-fin

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo articolo descrive l'estrazione del DNA dalla clip della coda del pesce zebra. Il protocollo dimostra un metodo rapido ed efficiente per analizzare i genotipi del pesce zebra.

Estrazione del DNA dalla clip della coda: un metodo utilizzato nella genotipizzazione del pesce zebra

PCR combinata con alta risoluzione melt analisi (HRMA) è dimostrato come un metodo rapido ed efficace al genotipo zebrafish.

Rapido ed efficiente Zebrafish genotipizzazione Uso PCR con ad alta risoluzione Melt Analysis

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Le tecnologie di editing genico hanno permesso ai ricercatori di generare mutanti di pesci zebra per studiare la funzione genica con relativa facilità. Qui, forniamo una guida per eseguire la genotipizzazione embrionale parallela e la quantificazione dei segnali di ibridazione in situ nel pesce zebra. Questo approccio imparziale fornisce una maggiore precisione nelle analisi fenotipiche basate sull'ibridazione in situ.

Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Questo lavoro descrive un protocollo per quantificare la forma della cartilagine craniofacciale utilizzando software liberi (tpsDigs2, MorphoJ e PAST) per misurare i cambiamenti nella struttura facciale nelle larve di pesce zebra.

Analisi morfometriche della forma: il software di analisi per la quantificazione della forma craniofacciale nel pesce zebra

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Scopri un metodo di genotipazione ad alto rendimento per larve di Danio rerio a 72 ore post-fertilizzazione tramite pinna clipping. Questa tecnica consente l'identificazione precoce dei genotipi per modelli di malattie genetiche.

Estrazione del DNA high-throughput e genotipizzazione delle larve di Zebrafish 3dpf di pinna Clipping

Esplora altri video