Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)
October 5th, 2018
L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.
Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della regolazione trascrizionale, come il ruolo delle interazioni con la cromatina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una cattura relativamente imparziale delle interazioni per un luogo di interesse. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni di potenziatore promotore, può anche essere applicato per identificare altri tipi di interazioni con la cromatina.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché ci vogliono diversi giorni per il protocollo e il design del primer richiede tentativi ed errori e orientamento del primer atipico. Per preservare le interazioni con la cromatina nelle cellule scelte, incrociarle aggiungendo 9,5 millilitri di formaldeide di grado microscopia elettronica all'1% in PBS per 10 milioni di cellule. Incubare le cellule mentre si dondola per 10 minuti a temperatura ambiente.
Trasferire i tubi di reazione sul ghiaccio per spegnere la reazione di collegamento incrociato e aggiungere ghiacciata una glicina molare ad una concentrazione finale di 0,125 molare e mescolare per inversione delicata. Dopo aver centrifugato e lavato le cellule secondo il protocollo di testo, sospendere di nuovo il pellet in 125 microlitri di edta millimolare con 0,5%SDS e un X inibitori della proteasi. Incubare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti.
Per assicurarsi che la llyse cellulare sia completa, mescolare sei microlitri delle cellule con sei microlitri di tripano blu su uno scivolo al microscopio e coprire con uno slittamento di copertura. Guarda al microscopio per vedere l'interno delle celle llysed blu e le celle non lese bianche. Per la prima restrizione la digestione aggiunge 30 microlitri di tampone enzimatico di restrizione 10 X e 27 microlitri del 20%Triton X-100 alla sospensione cellulare e regola il volume totale a 300 microlitri con acqua.
Rimuovere un'aliquota di 15 microliter e conservare a quattro gradi Celsius come controllo non digerito. Alla miscela di reazione rimanente aggiungere 200 unite di enzima di restrizione uno. Incubare durante la notte alla temperatura appropriata per l'enzima in un blocco riscaldante tremante con agitazione a 900 giri/min.
Il giorno seguente, aggiungere altre 200 unità dell'enzima e continuare questa incubazione durante la notte. Rimuovere un'aliquota di 15 microliter e conservare a quattro gradi Celsius come controllo digerito. Per determinare l'efficienza della digestione aggiungere 82,5 microlitri di Tris-HCl da 10 millimolare, pH 7,5, a ciascun controllo non digerito e digerito.
Aggiungere 2,5 microlitri di proteinasi K e incubare per un'ora a 65 gradi Celsius per invertire il collegamento incrociato della formaldeide. Per isolare il DNA digerito, aggiungere 100 microlitri di cloroformio fenolo al tubo. Mescolare con diverse inversioni rapide per rimuovere la contaminazione residua delle proteine.
Centrifuga a 16.100 G a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo. Aggiungere acetato di sodio, glicogeno ed etanolo al 100% al tubo e mescolare delicatamente per inversione.
Incubare a meno 80 gradi Celsius per un'ora per far precipitare il DNA. Centrifuga il tubo a 16.100 G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Rimuovere il supernatante, quindi aggiungere 500 microlitri di 70%etanolo per lavare il pellet di DNA.
Centrifuga a 16.100 G a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver rimosso l'aria supernatante asciugare il pellet a temperatura ambiente per due minuti per rimuovere l'etanolo residuo. Sospendere il pellet essiccato in 50 microlitri nucleasi acqua libera e procedere a determinare l'efficienza della digestione da parte di QPCR come descritto nel protocollo di testo.
Per prepararsi alla legatura, riscaldare e attivare l'enzima di restrizione incubando il tubo per 20 minuti a 65 gradi Celsius. Quindi trasferire il contenuto del tubo in un tubo conico da 50 millilitri e aggiungere acqua priva di nucleasi, tampone di ligasi 10 X e ligasi del DNA T4. Mescolare delicatamente ruotando e incubare durante la notte a 16 gradi Celsius e procedere come descritto nel protocollo di testo.
Per invertire il collegamento incrociato aggiungere 15 microlitri di proteinasi K e incubare durante la notte a 65 gradi Celsius. Il giorno seguente aggiungere 30 microlitri di RNasi A e incubare a 45 minuti a 37 gradi Celsius. Per continuare con l'isolamento della cromatina, aggiungere sette millilitri di cloroformio fenolo e mescolare con diverse inversioni rapide.
Centrifugare il tubo a 3.300 G a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase acquosa in un nuovo tubo da 50 millilitri e aggiungere acqua priva di nucleasi, tre acetati di sodio molare, glicogeno e 100% etanolo. Mescolare il contenuto e incubare a -80 gradi Celsius per un'ora.
Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo a 3.900 G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Rimuovere il supernatante, quindi lavare il pellet con 10 millilitri di ghiaccio freddo al 70% di etanolo. Centrifuga a 3.300 G a quattro gradi Celsius per 15 minuti.
Rimuovere il supernatante e asciugare brevemente il pellet a temperatura ambiente. Sciogliere il pellet in 150 microlitri di 10 millimolare Tris-HCl pH 7,5 a 37 gradi Celsius. Conservare a -20 gradi Celsius o continuare con la digestione della seconda restrizione, la legatura e la purificazione del DNA come descritto nel protocollo di testo.
Dopo la purificazione del DNA, eseguire QPCR usando primer PCR inversi e coloranti cyber e ROX per determinare il numero di cicli di amplificazione per l'amplificazione PCR inversa di sequenze interagenti sconosciute come descritto nel testo. Per preparare il DNA al sequenziamento, tagliare le sequenze di esche con la digestione della terza restrizione digerendo un microgrammo di prodotto purificato di PCR inversa e monitor enzimatico di restrizione. Eseguire l'enzima di restrizione digerito, o monitor RE, su un gel di agarosio di una concentrazione appropriata per i frammenti previsti.
Una volta che l'efficienza della digestione è stata determinata dall'elettroforesi gel, continuare con la purificazione inversa del prodotto PCR e la preparazione della libreria di sequenziamento, come descritto nel protocollo di testo. La digestione della terza restrizione è importante in questo protocollo per il sequenziamento di nuova generazione della cattura di conferma cromosoma circolare. Questa digestione taglia le sequenze di esche che possono facilitare l'identificazione delle attrazioni della cromatina.
L'elettroforesi a gel di agarosio del monitor RE digerito ha indicato una digestione sufficiente del prodotto PCR inverso digerito in parallelo. Al termine quattro letture di sequenziamento C sono state tagliate e mappate al genoma di riferimento umano hg38, utilizzando il pacchetto software BWA. La maggior parte delle letture si allinea ai siti di restrizione Siti HindiIII o CviQ1I adiacenti ai siti HindiIII come previsto.
Durante il tentativo di questa procedura è importante assicurarsi che le cellule siano lisce e che la cromatina sia sufficientemente digerita. Seguendo questa procedura, altri metodi come la precipitazione immunocromatina o chip, possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive come identificare i fattori di trascrizione coinvolti nelle interazioni con la cromatina. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della cromatina per esplorare le reti di regolamentazione fisica.
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Panoramica
Questo articolo discute un protocollo 4C-seq modificato che migliora l'identificazione delle interazioni della cromatina minimizzando il bias della PCR e migliorando la mappabilità dei read. Il metodo è particolarmente utile per studiare la regolazione trascrizionale e le interazioni della cromatina.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Biologia della cromatina
Contesto
- I metodi di cattura della conformazione cromosomica sono essenziali per studiare le interazioni tra elementi regolatori dei geni.
- I metodi tradizionali spesso soffrono di bias della PCR e sovra-amplificazione.
- Comprendere le interazioni della cromatina è cruciale per chiarire la regolazione trascrizionale.
- Questo metodo consente una cattura più imparziale delle interazioni in loci specifici.
Obiettivo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per catturare le interazioni della cromatina.
- Facilitare lo studio delle interazioni tra promotore ed enhancer.
- Migliorare l'accessibilità di questa tecnica per i ricercatori.
Metodi utilizzati
- Modifica del protocollo 4C-seq per ridurre il bias della PCR.
- Incorporazione di una fase di digestione con enzimi di restrizione.
- Cross-linking della cromatina utilizzando formaldeide.
- Progettazione attenta dei primer per ottimizzare la cattura delle interazioni.
Risultati principali
- Il protocollo modificato minimizza con successo la sovra-amplificazione.
- Una migliore mappabilità dei read migliora la qualità dei dati.
- Sono state acquisite conoscenze sulle interazioni della cromatina, aiutando gli studi sulla regolazione trascrizionale.
- Il metodo è applicabile a vari tipi di interazioni della cromatina.
Conclusioni
- Il protocollo 4C-seq modificato è uno strumento prezioso per i ricercatori.
- Offre un approccio più imparziale allo studio delle interazioni della cromatina.
- Gli studi futuri possono sfruttare questo metodo per esplorare reti regolatorie complesse.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding chromatin interactions is critical for de-risking target validation in early discovery by clarifying regulatory mechanisms that influence gene expression. The modified 4C-seq method provides an unbiased, locus-specific view of physical chromatin contacts, enabling mechanistic insights that support predictive confidence in target selection. This capability aids in prioritizing therapeutic hypotheses and reducing late-stage attrition due to incomplete biological understanding.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping physical chromatin interactions for a gene of interest.
- Operational Value: Clarifies enhancer-promoter and other regulatory contacts to functionally validate targets.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by reducing mechanistic ambiguity in transcriptional regulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative interaction maps that can be standardized for reproducible screening campaigns.
- Scalability: Enables preparation of sequencing libraries compatible with next-generation sequencing for high-throughput applications.
- Platform Reuse: Facilitates cross-project use in studying diverse loci across therapeutic areas.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase chromatin mapping to preclinical validation of gene regulatory mechanisms.
- Biomarker Alignment: Supports identification of regulatory variants with potential as translational biomarkers.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying disease-relevant chromatin topology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic depth before compound screening.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of chromatin-based regulatory mechanisms and pathway clarification.
- Screening: Produces standardized, quantitative chromatin interaction data suitable for assay development.
- Analytics: Delivers mappable sequencing reads and interaction frequencies that allow comparative condition analysis.
- Translational Research: Links locus-specific chromatin architecture to preclinical models of gene regulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for chromatin interaction profiling across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation through unbiased chromatin interaction mapping and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization via reduced PCR bias and controlled restriction digestion.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection, leading to better resource allocation and reduced failure risk.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of targets based on regulatory network confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, chromatin techniques, and next-generation sequencing library preparation.
- Dependent on access to restriction enzymes, ligation reagents, qPCR systems, and sequencing infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of primer design, cross-linking efficiency, and digestion controls.
- Adaptation across model systems may require optimization of cross-linking and digestion conditions.
- Practical limitations include multi-day protocol duration and trial-and-error primer design for optimal interaction capture.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Formaldehyde Cross-linking and Cell Lysis
1:59
First Restriction Digestion and First Ligation
5:07
Cross-linking Reversion, Chromatin Isolation, and Further Analyses
7:42
Results: Representative Genomic Track of 4C-seq Read Coverage
8:29
Conclusion
