Name: Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri come modellare circuiti sinaptici con coculture 3D di neuroni e astrociti da cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo riproducibile e scalabile facilita lo studio delle interazioni neurali e lo sviluppo di terapie per la neurodegenerazione.

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Vorremmo ringraziare Dr. Erik Ulliano (UCSF) per l'input intellettuale la progettazione di queste procedure, Dr. Michael Ward (NIH) consulenza tecnica sulla differenziazione Tatal e Saba Barlas per analisi preliminare delle immagini.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo protocollo, descriviamo un metodo sistematico per la produzione di sfere 3D di cocultures neurale. Le sfere sono composti da astrociti e neuroni, che sono derivati in modo indipendente da hPSCs. Anche se non il fuoco di questo protocollo, la generazione delle popolazioni puri dei astrocytes da hPSCs28 è un passo fondamentale e può essere tecnicamente impegnativa se eseguita senza precedente esperienza. Questo primo passo per la generazione di questi microcircuiti sinaptici deve essere es...

Gli astrociti sono un tipo molto abbondante delle cellule glial all'interno del sistema nervoso centrale (SNC) con una varietà di responsabilità funzionali di là di sostegno strutturale. Attraverso la secrezione di fattori solubili synaptogenic e componenti della matrice extracellulare (ECM), astrociti aiutano di clustering delle sinapsi mature durante sviluppo1e l'istituzione. Anche giocano un ruolo critico nel mantenimento della salute e la plasticità delle sinapsi attraverso segnalazione extracellulare2,3,4,5e contribuire alla stabilità a lungo termine di omeostatico ambienti regolando la concentrazione extracellulare del potassio e del glutammato, come pure la secrezione di substrati energetici e ATP6,7,8. Infine, essi possono contribuire alla neurotrasmissione influenzando le correnti extrasynaptic9e indirettamente possono influenzare l'attività attraverso altri tipi di cellule come la promozione della mielinizzazione10. Cosa importante, perché l'anomalia o disfunzione dei astrocytes può portare a molte sindromi dello sviluppo neurologico e neuropatologia adulto, c'è un'evidente necessità di includere astrociti a fianco di neuroni all'interno di reti neurali ingegnerizzati in ordine per una migliore modello dell'ambiente endogeno del cervello. Una caratteristica integrante degli astrociti è la loro capacità di interazioni dinamiche di forma con le sinapsi neuronali1,11,12. In assenza della glia, i neuroni formano un numero limitato di sinapsi, che in generale anche la mancanza di maturità funzionale13.
Gli astrociti umani visualizzano caratteristiche morfologiche, trascrizionale e funzionale — come aumento delle dimensioni e della complessità di ramificazione, così come specie-specifici geni — che non sono si ricapitola in roditori12,14, 15. Di conseguenza, gli studi che utilizzano cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule neurali derivate hanno diventare ampiamente accettate come mezzo di esaminare malattie CNS-relative in vitro durante lo sviluppo di nuove terapie, lesioni modelli e paradigmi della cultura16 ,17. Inoltre, hPSCs consente lo studio della formazione della sinapsi umana e funzione senza l'esigenza primaria del tessuto18,19.
Una barriera alla nostra comprensione di come i vari tipi di cellule e segnali contribuiscono alla funzione sinaptica circuito è la mancanza di modelli pertinenti del cervello umano. C'è bisogno di una piattaforma adeguata di ricapitolare le sue reti sinaptiche con alta fedeltà e riproducibilità. Recentemente, l'interesse è emerso nella produzione di sistemi di coltura 3D (largamente conosciuto come 'organoids', 'sferoidi', o 'mini cervelli')20 per modellare complessi tridimensionali (3D) strutture a livello cellulare e macro. Sistemi di coltura 3D mantengono interazioni ECM e cellula-cellula che sono normalmente assente o limitata durante coculture 2D tipici paradigmi21,22. Esiste una grande varietà di tecniche per la coltura di sferoidi neurale 3D23,24,25; Tuttavia, molti richiedono cultura lunghi periodi (mesi-anni) per sviluppo spontaneo e la conservazione di strato, con l'utente che esibiscono molto poco controllo sull'output.
Qui, vi illustriamo un metodo sistematico per rapidamente e costantemente bioingegnere neurale interazioni tra più tipi di cellule (neuroni pre-differenziati e astrociti) derivato da hPSCs assemblando cellule in cocultures sfera (asteroidi)26 che ricapitolano umane specifiche complessità morfologica in 3D. Questo sistema ad alta densità neuronale genera sottotipi neurali uniformemente dispersi che assumere proprietà matura nel tempo e possono essere schermati o analizzati in un modo ad alta velocità. Dimostriamo per la prima volta che gli astrociti umani inducono attività di burst di rete sinaptica in questi cocultures 3D. Inoltre, questo protocollo è facilmente adattabile per generare sfere di diverse dimensioni, di utilizzare celle specificate per diverse identità regionali del SNC e per studiare le interazioni di più altri tipi di cellulari come desiderato.

<table><tbody><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td>Soluzione di distacco</td></tr><tr><td>Piastra AggreWell</td><td>Stemcell Technologies</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo antiaderente</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7010</td><td>Prevenire la cellula adesione alle piastre per micropozzetti</td></tr><tr><td>Anti/anti</td><td>Thermofisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>BrainPhys medium neuronale</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5790</td><td>Alternativa al mezzo basale neurofisiologico</td></tr><tr><td>Vetrini circolari in vetro</td><td>Neuvitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stemcell Tecnologie</td><td>7930</td><td>Terreno di crioconservazione con il 10% di DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>10565-042</td><td>Con supplemento GlutaMAX</td></tr><tr><td>DMH-1</td><td>Tecnologie Stemcell</td><td>73634</td><td>PERICOLO: Tossico se ingerito. Concentrazione di lavoro: 2 &mu; M</td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332100</td><td>Concentrazione di lavoro: 5% nel tampone bloccante primario, 1% nel tampone bloccante secondario</td></tr><tr><td>Doxiciclina cloridrato (Dox)</td><td>Sigma</td><td>D3072-1ml</td><td>PERICOLO: Tossico per le donne in gravidanza. Concentrazione di lavoro: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Soluzione di montaggio Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini Fisherbrand</td><td></td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Siero</td> <td>di capraLampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Concentrazione di lavoro: 5% in tampone bloccante primario, 1% in tampone bloccante secondario</td></tr><tr><td>Ematocitometro o contatore cellulare automatico</td><td>Life Technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma</td><td>H3149-50KU</td><td>Concentrazione di lavoro: 2 mg/mL</td></tr><tr><td>Piastra magnetica</td><td>DLAB</td><td>8030170200</td><td></td></tr><tr><td>Matrice</td> <td>a membrana MatrigelCorning</td><td>354230</td><td>Soluzione di rivestimento ECM. Concentrazione di lavoro: 80 &mu; g/ml. Preparare con ghiaccio e assicurarsi che pipette, provette e terreni siano pre-raffreddati.</td></tr><tr><td>Sistema MEA 2100</td><td>Sistemi multicanale</td><td>MEA2100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td><td></td>di montaggio</tr><tr><td>N2</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Soluzione di inclusione tissutale per criosezione</td></tr><tr><td>Pap Pen (Aqua Hold)</td><td>Laboratorio di dispositivi scientifici</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide ( PFA)</td><td>Acros Organics</td><td>169650025</td><td>PERICOLO: Tossico se inalato. Concentrazione di lavoro: 4% in</td></tr><tr><td>PBS Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>CA008-300</td><td></td></tr><tr><td>Poli-l-ornitina (PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td>Concentrazione di lavoro: 0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Vetrini rettangolari in vetro</td><td>Fisherfinest Premium Superslip</td><td>12-545-88</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5872</td><td>Distacco e passaggio reagente</td></tr><tr><td>Inibitore della Rho-chinasi Y27632- (Y)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Concentrazione di lavoro: 10 uM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72234</td><td>Concentrazione di lavoro: 2 &mu; M</td></tr><tr><td>Fiaschetta Fisher</td><td>Scientific</td><td>4500-125</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-3</td><td>Concentrazione di lavoro: 20% o 30% in p.a. PBS</td></tr><tr><td>T25 Pallone di coltura</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td>Tappi ventilati</td></tr><tr><td>T75 Pallone di coltura</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-209</td><td>Tappi ventilati</td></tr><tr><td>Terg-A-zyme</td><td>Sigma</td><td>Z273287-1EA</td><td>Detergente. Concentrazione di lavoro: 1%</td></tr> <tr><td>TeSR-E8 terreno basale</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5940</td><td>Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) medium</td></tr><tr><td>TeSR-E8 integratori Stemcell</td><td>Technologies</td><td>5940</td><td>Integratori per terreno di cellule staminali pluripotenti umane</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Detergente per permeabilizzazione cellulare. Concentrazione di lavoro: 0,25% in tampone bloccante</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488</td><td>Thermofisher</td><td>A-11029</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Thermofisher</td><td>A-11037</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Ezrin</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-13862</td><td>Anticorpo primario; astrociti GFAP perisinaptico</td></tr><tr><td></td><td>Chemicon</td><td>MAB360</td><td>Anticorpo primario; astrociti</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td>Anticorpo primario; astrociti</td></tr><tr><td>Glt1</td><td>Dono del Dr. Jeffrey Rothstein</td><td>n/a</td><td>Anticorpo primario; astrociti</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Synaptic Systems</td><td>160 011</td><td>Anticorpo primario; neuroni post-sinaptici</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Sistemi Sinaptici</td><td>188 004</td><td>Anticorpo primario; neuroni</td></tr><tr><td>PSD95</td><td>Abcam</td><td>ab2723</td><td>Anticorpo primario; neuroni, post-sinaptico</td></tr><tr><td>S100</td><td>Abcam</td><td>ab868</td><td>Anticorpo primario; astrociti</td></tr><tr><td>Sinapsina 1</td><td>Sistemi Sinaptici</td><td>106 103</td><td>Anticorpo primario; neuroni, pre-sinaptico</td></tr><tr><td>TuJ1/&beta; 3-tubulina (TUBB3)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Anticorpo primario; neuroni</td></tr></tbody></table>

microcircuito sinaptica modellazione con 3d cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Una barriera alla nostra comprensione di come i vari tipi di cellule e segnali contribuiscono alla funzione sinaptica circuito è la mancanza di modelli pertinenti per lo studio del cervello umano. Una tecnologia emergente per affrontare questo problema è l'uso di tre dimensionale culture di cellule neurali (3D), definito 'organoids' o 'sferoidi', per la conservazione a lungo termine delle interazioni intercellulari tra molecole di adesione extracellulare. Tuttavia, questi sistemi di coltura sono che richiede tempo e non sistematicamente generato. Qui, abbiamo dettaglio un metodo per rapidamente e costantemente produrre 3D cocultures di neuroni e astrociti da pluripotenti umane cellule staminali. In primo luogo, pre-differenziati astrociti e progenitori neurali sono dissociati e conteggiati. Successivamente, le cellule sono combinate nella formazione di sfera piatti con un inibitore della Rho-chinasi e a rapporti specifici per produrre sfere di dimensioni riproducibili. Dopo diverse settimane di cultura come sfere galleggianti, cocultures ('asteroidi') sono infine cimentarsi per immunostaining o placcato su matrici multielettrodo per misurare la forza e la densità sinaptica. In generale, si prevede che questo protocollo produrrà sfere 3D neurale che visualizzare i marcatori di cellula-tipo maturo limitato, formano delle sinapsi funzionali e presentano attività di rete sinaptica spontanea di scoppio. Insieme, questo sistema permette lo screening di stupefacenti e le indagini sui meccanismi della malattia in un modello più adatto rispetto a colture dello strato monomolecolare.

Quando eseguita correttamente, questo protocollo produrrà popolazioni definite di cocultures funzionale di astrociti28,33,34 e neuroni35 generato da hPSCs (Figura 1A-1C), come dettagliate in precedenza26 e qui descritto ai punti 2.1-2.2. Questa procedura graduale, con l'uso di piastre microtiter, è prev...

In questo protocollo, ci proponiamo di descrivere un metodo riproducibile per combinare dissociato pluripotenti umane su cellule staminali neuroni e astrociti insieme in 3D sfera cocultures, mantenendo queste sfere in condizioni galleggiante libera e successivamente misurazione dell'attività sinaptica circuito delle sfere con immunoanalysis e registrazioni di matrice multielettrodo.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze su come la comunicazione intercellulare tra più tipi di cellule neurali umane contribuisca alla formazione e alla funzione del circuito sinaptico. Questa tecnica genera rapidamente e sistematicamente sfere di cocoltura tridimensionale di astrociti e neuroni funzionalmente maturi da cellule staminali pluripotenti umane. Questi possono essere utilizzati per una rigorosa indagine sperimentale.La riproducibilità e la scalabilità di questo protocollo è un'alternativa definita alle tecnologie emergenti degli organoidi. Questi mostrano risultati promettenti per lo sviluppo di nuovi farmaci e la terapia di attecchimento cellulare per promuovere la neurorigenerazione dopo un infortunio o una malattia. Iniziare posizionando gruppi di HPSC in due millilitri di terreno HPSC contenente l'inibitore della rho-chinasi Y-27632 in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita di ECM.Mantenere le cellule staminali fino a quando non sono circa il 50% confluenti, quindi cambiare il mezzo in mezzo neurale contenente SB431542 e DMH1 per promuovere l'induzione neurale. Quando le cellule sono confluenti per circa il 95%,

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo video dimostra lo sviluppo di una coltura neuronale 3D accoppiata a un array di microelettrodi planari con neuroni ippocampali. I neuroni isolati formano una rete 2D sull'area attiva dell'array di microelettrodi e aderiscono alle microsfere di vetro in una piastra multipozzetto con un inserto a membrana. Dopo aver trasferito queste microsfere rivestite di neuroni all'elettrodo, si organizzano in una rete neurale 3D interconnessa.

Costruzione di reti neuronali tridimensionali accoppiate a array di microelettrodi

Il video dimostra un metodo per generare astrosfere da progenitori da cellule staminali pluripotenti umane. Coinvolge la crescita e la proliferazione di cellule staminali con mezzi nutritivi contenenti fattori di crescita e inibitori delle chinasi. Queste cellule poi si aggregano e si differenziano in astrociti, formando astrosfere.

Generazione e mantenimento di astrosfere utilizzando cellule staminali pluripotenti umane

Questo video mostra una procedura per co-coltivare gli astrociti e i neuroni per formare sfere 3D. Queste sfere 3D forniscono una piattaforma distinta per esaminare la formazione delle sinapsi e l'integrazione delle reti neurali, fungendo così da potenziale modello per la ricerca nelle neuroscienze dello sviluppo, nelle malattie neurodegenerative e negli interventi neurofarmacologici.

Generazione di sfere di co-coltura 3D di astrociti e neuroni per indurre la formazione di sinapsi

Questo video mostra la procedura di utilizzo dell'array multielettrodo (MEA) per misurare la fisiologia sinaptica in sfere di cocoltura 3D. Questo metodo consente di comprendere le dinamiche della rete neurale e l'attività del burst della rete sinaptica all'interno delle sfere 3D.

Utilizzo di array multielettrodo per misurare la fisiologia sinaptica in sfere di cocoltura 3D

Questo video dimostra la creazione di una co-coltura neurone-astrocita per la registrazione dell'attività della rete neuronale. Dopo aver stabilito la co-coltura di motoneuroni e astrociti su una piastra multi-electrode array (MEA), l'attività elettrica ritmica sincrona della rete neuronale è stata registrata extracellulare utilizzando il MEA.

Registrazione dell'attività elettrofisiologica della rete neuronale in una co-coltura neurone-astrocitaria

Viene descritto un protocollo per generare un sistema di co-coltura costituito da neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), neuroni corticali primari e astrociti. Questo sistema di co-coltura consente di rilevare la formazione di contatti sinaptici e circuiti tra nuovi neuroni derivati da iPSC e neuroni corticali preesistenti che esprimono la canalrodopsina-2.

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

In questo lavoro, un nuovo modello sperimentale in cui le colture neuronali 3D sono accoppiate a array di microelettrodi planari (MEA) è presented. 3D le reti sono costruite seminando i neuroni in un'impalcatura composta da microsfere di vetro su cui i neuroni crescono e formano strutture 3D interconnesse.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Modifichiamo e implementare un protocollo precedentemente pubblicato che descrive la differenziazione rapida, riproducibile ed efficiente di indotto umani cellule staminali pluripotenti (hiPSCs) in eccitatorio neuroni corticali 12. In particolare, la nostra modifica permette il controllo della densità delle cellule neuronali e uso su array micro-elettrodi per misurare le proprietà elettrofisiologiche a livello di rete.

Rapid neuronale differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte per misurare l&#39;attività di rete su array Micro-elettrodo

Descriviamo un metodo per differenziare astrociti e neuroni di derivazione pluripotente indotta dal midollo spinale e la loro co-coltura per la registrazione elettrofisiologica.

Creazione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cocolture biostampate in 3D di neuroni e astrociti derivati da iPSC. Questo modello di cocoltura, generato all'interno di un'impalcatura di idrogel in formati a 96 o 384 pozzetti, dimostra un'elevata vitalità post-stampa e la crescita dei neuriti entro 7 giorni e mostra l'espressione di marcatori di maturità per entrambi i tipi di cellule.

Bioprinting tridimensionale di cocolture neurone-astrociti derivate da iPSC umane per applicazioni di screening

Scopri come modellare circuiti sinaptici con coculture 3D di neuroni e astrociti da cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo riproducibile e scalabile facilita lo studio delle interazioni neurali e lo sviluppo di terapie per la neurodegenerazione.

Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

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