Microcircuito sinaptica modellazione con 3D Cocultures di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze su come la comunicazione intercellulare tra più tipi di cellule neurali umane contribuisca alla formazione e alla funzione del circuito sinaptico. Questa tecnica genera rapidamente e sistematicamente sfere di cocoltura tridimensionale di astrociti e neuroni funzionalmente maturi da cellule staminali pluripotenti umane. Questi possono essere utilizzati per una rigorosa indagine sperimentale.

La riproducibilità e la scalabilità di questo protocollo è un'alternativa definita alle tecnologie emergenti degli organoidi. Questi mostrano risultati promettenti per lo sviluppo di nuovi farmaci e la terapia di attecchimento cellulare per promuovere la neurorigenerazione dopo un infortunio o una malattia. Iniziare posizionando gruppi di HPSC in due millilitri di terreno HPSC contenente l'inibitore della rho-chinasi Y-27632 in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita di ECM.

Mantenere le cellule staminali fino a quando non sono circa il 50% confluenti, quindi cambiare il mezzo in mezzo neurale contenente SB431542 e DMH1 per promuovere l'induzione neurale. Quando le cellule sono confluenti per circa il 95%, dividere ogni pozzetto da uno a sei in nuovi pozzetti rivestiti di ECM. Il giorno 14 dissociare le cellule con la soluzione di distacco e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in un pallone T25 non rivestito con terreno contenente Y-27632 per favorire la formazione di aggregati.

Per generare progenitori astrocitari e astrociti in aggregati 3D formati spontaneamente, passare al mezzo neurale contenente EGF e FGF2 e somministrare ogni tre o quattro giorni fino a quando l'identità degli astrociti non viene confermata a quattro-sei mesi. Per impostazione predefinita, questo protocollo produce astrociti corticali dorsali. Tuttavia, i sottotipi di astrociti possono essere specificati a livello regionale con l'aggiunta di morfogeni di patterning, se lo si desidera.

Una volta alla settimana, quando compaiono i centri oscuri, raccogliere le sfere mediante centrifugazione, quindi dissociare delicatamente gli aggregati H-astro con la soluzione di distacco. Riplaccare solo quelle sfere che non si attaccano spontaneamente per evitare il passaggio di cellule non SNC e non neurali. Dopo quattro-sei mesi di espansione, confermare l'identità della cellula nel mezzo di congelamento e crioconservazione secondo le istruzioni del produttore, oppure utilizzarla immediatamente per la sperimentazione.

Per la generazione di progenitori neuronali non transgenici nei neuroni, o neuroni H, seminare progenitori neurali derivati da HPSC giorno 14 in piastre a sei pozzetti rivestite di ECM con due millilitri di mezzo neurale e Y-27632 per pozzetto. Se si lavora con iNeurons inducibili dalla doxiciclina, aggiungere un mezzo neurale contenente doxiciclina quando le cellule sono confluenti per circa il 35% per indurre la differenziazione e attivare l'espressione genica. Dopo due giorni, alimentare le linee transgeniche e non transgeniche con due millilitri di mezzi neurali per pozzetto al giorno.

Continuare fino a quando le celle sono pronte a sollevarsi al 70% di confluenza. Per le cocolture, dissociare delicatamente H-astros dagli aggregati 3D con soluzione di distacco. Quindi procedi alla dissociazione dei neuroni H, o iNeuroni, da un monostrato 2D.

Innanzitutto, rimuovere il terreno dalla piastra a sei pozzetti e aggiungere 500 microlitri di soluzione di distacco a ciascun pozzetto contenente colture monostrato. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente da due a tre millilitri di terreno DMEM-F12 per rimuovere le cellule attaccate.

Quindi, raccogliere le cellule in terreno in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte G per un minuto. Aspirare il surnatante, aggiungere un millilitro di terreno fresco e pipettare delicatamente su e giù con una micropipetta da 1.000 microlitri per ottenere una sospensione a cellula singola. Conta ogni tipo di cellula utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.

Aggiungere il rapporto desiderato di H-astro dissociati e H-neuroni, o iNeuroni, in un volume totale di due millilitri a ciascun pozzetto di una micropiastra. Centrifugare la piastra a 100 volte G per tre minuti e rimetterla nell'incubatrice per due giorni. Dopo un giorno, nella piastra dovrebbero essersi formate microsfere densamente impacchettate.

Utilizzare una micropipetta da 1.000 microlitri per rimuovere delicatamente le sfere dai micro pozzetti. Applicare leggermente la forza sul fondo dei micropozzetti con il mezzo per rimuovere eventuali sfere aderenti aggiuntive. Dopo aver raccolto tutte le sfere in un tubo conico da 15 millilitri, lasciare riposare.

Quindi lavare le sfere aspirando prima il vecchio terreno e poi aggiungendo almeno due millilitri di terreno fresco. Aggiungere le sfere in un pallone da centrifuga contenente da 50 a 60 millilitri di terreno. Posizionare il pallone nell'incubatrice su una piastra di agitazione magnetica impostata a 60 giri/min.

Per la formazione delle sinapsi sono necessarie almeno tre settimane di coltura. Inizia rivestendo la superficie di ogni array multielettrodo, o MEA, con un millilitro di poliornitina per rendere la superficie idrofila e incuba a 37 gradi Celsius per un minimo di quattro ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la poliornitina e lavare la superficie di ogni MEA con acqua deionizzata.

Quindi aggiungere un millilitro di matrice extracellulare e rimettere nell'incubatrice per un minimo di quattro ore. Quando è pronta, rimuovere la matrice extracellulare, quindi applicare le sfere in 1,5 millilitri di terreno sulla superficie MEA, assicurandosi che le sfere siano posizionate sopra l'array di elettrodi. Lasciare aderire per due giorni.

Per misurare l'attività elettrica delle sfere neurali, posizionare il MEA su uno stadio di testa a temperatura controllata. Utilizzare un filtro passa-alto a cinque Hertz e un filtro passa-basso a 200 Hertz e una soglia di picco di cinque volte la deviazione standard per registrare l'attività elettrica spontanea. Salva i dati grezzi, tra cui la frequenza e l'ampiezza dei picchi, per l'analisi statistica.

I marcatori proteici ristretti di tipo neurale, come MAP2 per i neuroni e GFAP per gli astrociti, dimostrano visivamente la disposizione e la maturità uniformemente disperse degli astrociti nei neuroni all'interno di sfere 3D. Una proiezione massima della morfologia e della ramificazione degli astrociti è mostrata in una sfera 3D rappresentativa con H-astros scarsamente marcati con GFP legata alla membrana. I marcatori espressi H-astros maturi includono GFAP.

Anche se gli iNeuron esprimono proteine pre e postsinaptiche, come mostrato nell'immagine a sinistra, la densità sinaptica è significativamente aumentata dalla presenza di H-astros e dalla cocoltura. Durante le registrazioni, sfere sane di iNeurons posizionate su MEA provocheranno spontaneamente picchi di tensione superiori a 40 microvolt con frequenze di attivazione costanti. Le sfere di cocoltura mostrano una maggiore connettività di rete con la presenza di H-astros, con conseguente aumento delle esplosioni di picchi di rete sincrone.

Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'imaging del calcio per misurare la risposta fisiologica degli astrociti all'attività sinaptica. Inoltre, il trapianto in modelli animali può essere condotto per studiare la connettività con circuiti sinaptici preesistenti. Seguendo questo approccio di bioingegneria, è possibile incorporare biomateriali extracellulari e tipi di cellule aggiuntive come oligodendrociti, microgliane e cellule eteliali in rapporti specifici al fine di modellare la complessa segnalazione che si verifica nel cervello.