Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

Abbiamo sviluppato questo metodo per estrarre dati quantitativi da studi di imaging basati sulla fluorescenza per estrarre processi biologici cellulari complessi e dinamici in modelli di neurodegenerazione di Drosophila. Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo flusso di lavoro di analisi delle immagini adattabile e semi-automatizzato per ridurre al minimo le distorsioni di selezione, massimizzare la potenza di campionamento e ottenere la riproducibilità sul campo. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altri punti proteici e compartimenti legati alla membrana implicati nella neurodegenerazione che in ultima analisi miglioreranno la nostra comprensione meccanicistica delle malattie neurodegenerative.

Per mantenere intatta la lamina durante la dissezione, al microscopio stereoscopico, far scorrere due pinze sotto la retina e strappare delicatamente il centro dell'occhio per rimuovere la retina. Mantenendo la pinza parallela alla superficie della lamina, si allontana il tessuto retinico rimanente attaccato alla lamina. Sezionare da tre a cinque cervelli per ogni gruppo e trasferire i cervelli in una provetta da microcentrifuga contenente un fissativo appropriato per 15 minuti a temperatura ambiente con un leggero dondolio.

Dopo tre lavaggi di 15 minuti con PBS più Triton X-100, o PBTx, sostituire l'ultimo lavaggio con l'anticorpo primario di interesse diluito in PBTx con il 5% di siero di capra normale per un'incubazione notturna in un miscelatore aliquote a quattro gradi Celsius. La mattina successiva rimuovere l'anticorpo in eccesso con tre lavaggi di 15 minuti in PBTx e incubare il cervello in un anticorpo secondario appropriato diluito in PBTx con il 5% di siero di capra normale per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare il cervello tre volte come dimostrato e posizionare una goccia di terreno di montaggio tra due pezzi di nastro adesivo trasparente al centro di un vetrino per microscopia per campione di tessuto.

Posizionare i cervelli nel supporto di montaggio per uno o due minuti. Quando i fazzoletti diventano trasparenti, utilizzare una pipetta per rimuovere con cura il mezzo di montaggio da ciascun lato. Per visualizzare i tessuti colorati, applicare una goccia di terreno di montaggio fresco sul cervello e sovrapporre accuratamente i campioni con il vetro di copertura.

Sigillare i bordi del vetro di copertura con cemento di gomma e asciugare i vetrini all'aria per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, visualizzare il campione sul microscopio e regolare i controlli del rivelatore di immagini sul microscopio a fluorescenza per acquisire il più alto rapporto segnale/rumore nella gamma dinamica più alta del campione. Una volta che le impostazioni sono state ottimizzate, visualizza un campione di un altro gruppo per confermare che le impostazioni saranno appropriate in tutto l'esperimento.

Il primo campione può quindi essere ripreso avendo cura di salvare l'immagine come tipo di file in grado di conservare i metadati come i parametri di acquisizione e la calibrazione spaziale. Per analizzare le immagini, aprire un'immagine nelle Figi, selezionare Visualizza stack con Hyperstack dalla finestra di dialogo Opzioni di importazione dei bioformati e impostare la modalità colore su Scala di grigi. Identifica un'area in base ai canali del marcatore che può essere utilizzata come regione di interesse standardizzata tra i campioni utilizzando la barra di scorrimento C per visualizzare i canali e la barra di scorrimento Z per spostarti tra i piani focali.

Per semplificare l'analisi dell'immagine, generare una nuova immagine contenente i canali e i piani focali e selezionare Immagine e Duplica. Impostate i canali e le sezioni desiderati e modificate il nome del file in modo che rifletta la selezione. Selezionate manualmente un'area di interesse standardizzata utilizzando uno strumento di selezione in base ai criteri di selezione precedentemente determinati.

Fare clic su Analizza, Strumenti, Gestione regione di interesse e Aggiungi per aggiungere la regione di interesse al Manager regione di interesse. Quindi fare clic su Altro e Salva e assegnare un nome al file in modo che rifletta la regione di interesse. Per la pre-elaborazione delle immagini, fare clic su Elabora in Filtri e selezionare un filtro appropriato.

Qui selezionare le impostazioni del filtro che riducono il rumore preservando i bordi per facilitare il rilevamento delle strutture di interesse durante la segmentazione. Con l'immagine pre-elaborata attiva nelle Figi, fare clic su SCF, Etichettatura e H_Watershed interattiva. Dal pannello di controllo regola la dinamica del seme, la soglia di intensità e il picco di inondazione per ottimizzare la segmentazione.

Quando i risultati della segmentazione sono stati ottimizzati, selezionare Esporta regioni, maschera ed esporta per generare un'immagine binaria dei risultati del bacino idrografico. Aprire l'area standardizzata salvata di interesse. Da Gestione regione di interesse, selezionare l'identificatore della regione di interesse per limitare l'estrazione delle feature alla regione di interesse standardizzata nell'immagine.

Con la regione di interesse attiva sulla maschera spartiacque binaria, selezionare Analizza, Analizza particelle e Aggiungi a Manager per estrarre le feature e aggiungere un identificatore di particelle per ogni struttura delineata durante la segmentazione a Gestione regione di interesse. Quindi salva le particelle aggiunte facendo attenzione che gli identificatori siano deselezionati e che tutte le particelle vengano salvate in un file zip. Ora apri l'immagine raw pre-elaborata e scorri fino al canale utilizzato per catturare le strutture di interesse.

Aprire le particelle ottenute dall'estrazione delle funzioni e selezionare Mostra tutto in Gestione regione di interesse per sovrapporre un contorno di ciascuna particella all'immagine. Fare clic su Analizza e imposta misurazioni e impostare le misure sperimentali appropriate. Quindi, dal Gestore regione di interesse, selezionare Misura e copiare e incollare i risultati in un programma di fogli di calcolo appropriato per la compilazione e ulteriori calcoli.

La quantificazione del numero di aggregati di huntingtina RFP segmentati semi-automaticamente da piani focali standardizzati attraverso il lobo ottico di Drosophila rivela un'espressione diffusa dell'espansione non patogena di Huntington Q15 nell'accumulo di aggregati proteici da parte dell'espansione di Huntington Q138 che causa la malattia. I profili di dimensione e intensità di tutti gli aggregati provenienti da un piano focale standardizzato di cinque diversi lobi ottici che esprimono Huntington Q138 illustrano la robustezza e la riproducibilità di questo flusso di lavoro. Quando gli aggregati sono sovraesposti durante l'acquisizione dell'immagine, la quantificazione delle dimensioni e del numero di aggregati è paragonabile agli aggregati acquisiti con l'esposizione ideale.

Tuttavia, l'intensità degli aggregati sovraesposti diventa una funzione delle dimensioni, poiché i pixel saturi mostrano il valore massimo di intensità. La visualizzazione dell'intensità di mCherry e GFP in diverse strutture correlate all'autofagia o positive ad Atg8 rivela differenze nel reporter in cui l'elevata intensità di entrambi i fluorofori indica autofagosomi. Un alto mCherry e un basso GFP indicano la fusione con il lisosoma poiché il GFP viene spento in questo compartimento acido.

E infine, un basso mCherry riflette la degradazione all'interno del lisosoma. Un grafico a dispersione generato dall'intensità media del fluoroforo di ciascuna particella positiva mCherry Atg8 segmentata semi-automaticamente illustra il flusso attraverso la via lisosomiale dell'autofagia che può essere separata in passaggi discreti mediante analisi a quadranti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i parametri definiti dall'utente nelle fasi di analisi delle immagini dipendono fortemente dall'applicazione.

Quindi fai attenzione a documentare il flusso di lavoro per garantire coerenza e comparabilità tra i campioni.