Name: Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Scopri un workflow semi-automatizzato per l'analisi imparziale delle proteine fluorescenti in Drosophila. Questo metodo quantifica aggregati proteici e flusso autofagico per studiare i meccanismi della neurodegenerazione.

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Questo lavoro è supportato da Sheila e David Fuente neuropatico dolore ricerca programma Istituto europeo di Oncologia (a J.M.B.), il Lois Pope LIFE Fellows Program (di C.L., Y.Z. e J.M.B.), la Snyder-Robinson Foundation Fellowship Predoctoral (a C.L.), il Dr. John T . Fondazione di Macdonald (a C.L.), contratti, borse di studio dal National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 e R56NS095893 (per R.G.Z.) e dal progetto di studioso di Taishan (Provincia di Shandong, Repubblica popolare cinese) (per R.G.Z.).

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<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per robustamente e riproducibile quantitate processi biologici delle cellule visualizzati da formazione immagine di fluorescenza-basata. Contesto biologico e limiti tecnici devono essere attentamente considerati per guidare il disegno sperimentale. Marcatori fluorescenti di strutture subcellulari di interesse, se immunohistochemical, dye-based o geneticamente espresse, devono essere distinguibili sopra priorità bassa di morfologia e intensità. Il sistema GAL4/UAS...

Malattie neurodegenerative colpiscono milioni di persone ogni anno e l'incidenza sta aumentando con l'invecchiamento della popolazione1. Mentre ogni malattia neurodegenerative ha un'eziologia unica, aggregazione delle proteine misfolded e ripartizione della rete proteostasis sono patologici comuni caratteristiche di molte di queste malattie. Delucidamento come rottura di questi processi fondamentali e interdipendenti va storto per contribuire alla morte delle cellule e la disfunzione neuronale è fondamentale per la comprensione delle malattie neurodegenerative così come guidare gli interventi terapeutici. Acquisizione di immagini basata sulla fluorescenza permette per indagine su questi processi complessi e dinamici nei neuroni e ha notevolmente contribuito alla nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali. Analisi di proteine fluorescente è impegnativo, specialmente quando gli esperimenti sono effettuati in vivo, a causa di tessuti altamente compatti, tipi cellulari diversi ed eterogeneità morfologica. Manuale assistita quantificazione è conveniente e semplice, ma è spesso richiede tempo e soggetto a pregiudizi umani. Di conseguenza, c'è una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging.
Abbiamo delineato un flusso di lavoro semplice e adattabile con Fiji/ImageJ, un'immagine potente e liberamente accessibile, elaborazione software2,3, per estrarre dati quantitativi da studi di formazione immagine di fluorescenza in modelli sperimentali di neurodegenerazione utilizzando Drosophila. Seguendo questo protocollo per quantificare l'aggregazione proteica e flusso autofagico — due cellulari caratteristiche biologiche che sono altamente pertinenti alla patologia di malattia neurodegenerative — abbiamo dimostrato la sensibilità e la riproducibilità di questo approccio. Analisi delle proteine fluorescente contrassegnati huntingtina (Htt) nel lobo ottico di Drosophila ha rivelato il numero, la dimensione e l'intensità degli aggregati della proteina. Abbiamo visualizzato un reporter fluorescente tandem di autophagic flusso all'interno del sistema visivo di Drosophila , che mostra segnali di emissione diversi a seconda l' ambiente compartimentali4. Analisi basata su raziometrici del reporter tandem ammessi per una visione quantitativa e globale di cambiamento continuo di autofagia-lisosoma da formazione dell'autofagosoma, maturazione e trasporto alla degradazione nel lisosoma e inoltre evidenziato vulnerabili compartimenti in circostanze neurodegenerative interrotta. Importante, in entrambe le analisi abbiamo implementato passaggi di soglia e segmentazione semi-automatizzati nel nostro protocollo per ridurre al minimo la polarizzazione unconscious, aumentare la potenza di campionamento e fornire uno standard per facilitare i confronti tra studi simili. Il semplice flusso di lavoro è inteso a rendere potente plugin di Fiji/ImageJ (sviluppato da scienziati informatici basati su algoritmi matematici) più accessibile ai neurobiologi e la comunità di Scienze della vita in generale.

<table><tbody><tr><td>Kit di elastomeri siliconici SYLGARD(R) 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Piatto di dissezione</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Non trattato con TC Piastra di Petri batteriologica Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Piatto di dissezione</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Strumento di dissezione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Soluzione</td></tr> <tr><td>PBSFosfato di sodio bibasico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS soluzione</td></tr><tr><td>Potassio Fosfato Monobasico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS soluzione</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Soluzione di lavaggio e incubazione di anticorpi.</td></tr>Provette per microcentrifuga monouso <tr>con <td>fissazione</td><td>VWR</td><td>10790-710</td> al <td>37% di formaldeide</td></tr><tr><td>(0,5 ml, blu)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fissaggio, lavaggio e incubazione di anticorpi.</td></tr><tr><td>Micro vetrini lisci e smerigliati (25&volte; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Vetrini per imaging confocale</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, rettangolari (22&times; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Vetrini per imaging confocale</td></tr><tr><td>Gomma Cemento</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Montaggio</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaggio Medio</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Nastro</td></tr><tr><td>invisibile Scotch Magic 810 (19mm&volte; 25,4 m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Montaggio</td></tr><tr>Siero di<td>capra normale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Incubazione di anticorpi</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Colorazione con acido nucleico. Sciogliere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione madre da 5 mg/mL e conservare a -80 °C. Diluire a una concentrazione di lavoro di 10-20 °C; g/mL in PBTx.</td></tr><tr><td>3.5X-90X Stereo Zoom Ispezione Microscopio industriale</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>Ambito di dissezione. Dotato di illuminatore a doppio collo d'oca a LED da 6 W</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Con plug-in SCF_MPI_CBG (versione 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costrutto ricombinante</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Con la crescente diffusione di malattie neurodegenerative, è sempre più importante capire la patofisiologia di fondo che conduce alla perdita e disfunzione neuronale. Tecnologie e strumenti di imaging basata sulla fluorescenza abilitare analisi senza precedenti dei processi neurobiologici subcellulari, eppure c'è ancora una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging . Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi dagli studi di formazione immagine di fluorescenza-basata della drosofila in modelli di neurodegenerazione. In particolare, descriviamo un metodo facile da seguire, semi-automatizzato utilizzando Fiji/ImageJ per analizzare i due processi cellulari: in primo luogo, quantifichiamo aggregazione proteica e profilo nel lobo ottico Drosophila utilizzando fluorescenti-etichetta mutante proteine di huntingtin; e in secondo luogo, valutiamo il flusso di autofagia-lisosoma nel sistema visivo della drosofila con quantificazione basata su raziometrici di un reporter fluorescente tandem dell'autofagia. D'importanza, il protocollo descritto qui include un passaggio di segmentazione semi-automatizzata per garantire che tutte le strutture fluorescenti sono analizzate per minimizzare il bias di selezione e per aumentare la risoluzione di sottili confronti. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altre strutture biologiche cellulari e processi implicati nei processi neurodegenerativi, quali proteinico puncta (granuli di stress e complessi sinaptici), anche come membrana-limitano scomparti (mitocondri e vescicole della membrana del traffico). Questo metodo fornisce un standardizzato, ma adattabile riferimento punto per analisi dell'immagine e la quantificazione e potrebbe facilitare affidabilità e riproducibilità attraverso il campo e infine migliorare comprensione meccanicistica della neurodegenerazione.

Quantificazione del numero, zona e intensità degli aggregati Htt mutanti fluorescente contrassegnati nel lobo ottico di Drosophila
Per indagare l'aggregazione di proteine misfolded nel sistema nervoso centrale di un modello di Drosophila della malattia di Huntington, RFP-etichetta mutante umano Htt con un non-patologico (UAS-RFP-hHttQ15) o espansione patologica ( UAS-RFP-hHttQ138) e membrana GFP ...

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi da studi biologici basati su formazione immagine di fluorescenza delle cellule di aggregazione proteica e flusso autofagico nel sistema nervoso centrale di Drosophila modelli di neurodegenerazione.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Abbiamo sviluppato questo metodo per estrarre dati quantitativi da studi di imaging basati sulla fluorescenza per estrarre processi biologici cellulari complessi e dinamici in modelli di neurodegenerazione di Drosophila. Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo flusso di lavoro di analisi delle immagini adattabile e semi-automatizzato per ridurre al minimo le distorsioni di selezione, massimizzare la potenza di campionamento e ottenere la riproducibilità sul campo. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altri punti proteici e compartimenti legati alla membrana implicati nella neurodegenerazione che in ultima analisi miglioreranno la nostra comprensione meccanicistica delle malattie neurodegenerative.Per mantenere intatta la lamina durante la dissezione, al microscopio stereoscopico, far scorrere due pinze sotto la retina e strappare delicatamente il centro dell'occhio per rimuovere la retina. Mantenendo la pinza parallela alla superficie della lamina, si allontana il tessuto retinico rimanente attaccato alla lamina. Sezionare da tre a cinque cervelli per ogni gruppo e trasferire i cervelli in una provetta da microcentrifuga contenente un fissativo appropriato per 15 minuti a temperatura ambiente con un leggero dondolio.Dopo tre lavaggi di 15 minuti con PBS più Triton X-100, o PBTx, sostituire l'ultimo lavaggio con l'anticorpo primario di interesse diluito in PBTx con il 5% di siero di capra normale per un'incubazione notturna in un miscelatore aliquote a quattro gradi Celsius. La mattina successiva rimuovere l'anticorpo in eccesso con tre lavaggi di 15 minuti in PBTx e incubare il cervello in un anticorpo secondario appropriato diluito in PBTx con il 5% di siero di capra normale per un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare il cervello tre volte come dimostrato e posizionare una goccia di terreno di montaggio tra due pezzi di nastro adesivo trasparente al centro di un vetrino per microscopia per campione di tessuto.Posizionare i cervelli nel supporto di montaggio per uno o due minuti. Quando i fazzoletti diventano trasparenti, utilizzare una pipetta per rimuovere con cura il mezzo di montaggio da ciascun lato. Per visualizzare i tessuti colorati, applicare una goccia di terreno di montaggio fresco sul cervello e sovrapporre accuratamente i campioni con il vetro di copertura.Sigillare i bordi del vetro di copertura con cemento di gomma e asciugare i vetrini all'aria per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, visualizzare il campione sul microscopio e regolare i controlli del rivelatore di immagini sul microscopio a fluorescenza per acquisire il più alto rapporto segnale/rumore nella gamma dinamica più alta del campione. Una volta che le impostazioni sono state ottimizzate, visualizza un campione di un altro gruppo per confermare che le impostazioni saranno appropriate in tutto l'esperimento.Il primo campione può quindi essere ripreso avendo cura di salvare l'immagine come tipo di file in grado di conservare i metadati come i parametri di acquisizione e la calibrazione spaziale. Per analizzare le immagini, aprire un'immagine nelle Figi, selezionare Visualizza stack con Hyperstack dalla finestra di dialogo Opzioni di importazione dei bioformati e impostare la modalità colore su Scala di grigi. Identifica un'area in base ai canali del marcatore che può essere utilizzata come regione di interesse standardizzata tra i campioni utilizzando la barra di scorrimento C per visualizzare i canali e la barra di scorrimento Z per spostarti tra i piani focali.Per semplificare l'analisi dell'immagine, generare una nuova immagine contenente i canali e i piani focali e selezionare Immagine e Duplica. Impostate i canali e le sezioni desiderati e modificate il nome del file in modo che rifletta la selezione. Selezionate manualmente un'area di interesse standardizzata utilizzando uno strumento di selezione in base ai criteri di selezione precedentemente determinati.Fare clic su Analizza, Strumenti, Gestione regione di interesse e Aggiungi per aggiungere la regione di interesse al Manager regione di interesse. Quindi fare clic su Altro e Salva e assegnare un nome al file in modo che rifletta la regione di interesse. Per la pre-elaborazione delle immagini, fare clic su Elabora in Filtri e selezionare un filtro appropriato.Qui selezionare le impostazioni del filtro che riducono il rumore preservando i bordi per facilitare il rilevamento delle strutture di interesse durante la segmentazione. Con l'immagine pre-elaborata attiva nelle Figi, fare clic su SCF, Etichettatura e H_Watershed interattiva. Dal pannello di controllo regola la dinamica del seme, la soglia di intensità e il picco di inondazione per ottimizzare la segmentazione.Quando i risultati della segmentazione sono stati ottimizzati, selezionare Esporta regioni, maschera ed esporta per generare un'immagine binaria dei risultati del bacino idrografico. Aprire l'area standardizzata salvata di interesse. Da Gestione regione di interesse, selezionare l'identificatore della regione di interesse per limitare l'estrazione delle feature alla regione di interesse standardizzata nell'immagine.Con la regione di interesse attiva sulla maschera spartiacque binaria, selezionare Analizza, Analizza particelle e Aggiungi a Manager per estrarre le feature e aggiungere un identificatore di particelle per ogni struttura delineata durante la segmentazione a Gestione regione di interesse. Quindi salva le particelle aggiunte facendo attenzione che gli identificatori siano deselezionati e che tutte le particelle vengano salvate in un file zip. Ora apri l'immagine raw pre-elaborata e scorri fino al canale utilizzato per catturare le strutture di interesse.Aprire le particelle ottenute dall'estrazione delle funzioni e selezionare Mostra tutto in Gestione regione di interesse per sovrapporre un contorno di ciascuna particella all'immagine. Fare clic su Analizza e imposta misurazioni e impostare le misure sperimentali appropriate. Quindi, dal Gestore regione di interesse, selezionare Misura e copiare e incollare i risultati in un programma di fogli di calcolo appropriato per la compilazione e ulteriori calcoli.La quantificazione del numero di aggregati di huntingtina RFP segmentati semi-automaticamente da piani focali standardizzati attraverso il lobo ottico di Drosophila rivela un'espressione diffusa dell'espansione non patogena di Huntington Q15 nell'accumulo di aggregati proteici da parte dell'espansione di Huntington Q138 che causa la malattia. I profili di dimensione e intensità di tutti gli aggregati provenienti da un piano focale standardizzato di cinque diversi lobi ottici che esprimono Huntington Q138 illustrano la robustezza e la riproducibilità di questo flusso di lavoro. Quando gli aggregati sono sovraesposti durante l'acquisizione dell'immagine, la quantificazione delle dimensioni e del numero di aggregati è paragonabile agli aggregati acquisiti con l'esposizione ideale.Tuttavia, l'intensità degli aggregati sovraesposti diventa una funzione delle dimensioni, poiché i pixel saturi mostrano il valore massimo di intensità. La visualizzazione dell'intensità di mCherry e GFP in diverse strutture correlate all'autofagia o positive ad Atg8 rivela differenze nel reporter in cui l'elevata intensità di entrambi i fluorofori indica autofagosomi. Un alto mCherry e un basso GFP indicano la fusione con il lisosoma poiché il GFP viene spento in questo compartimento acido.E infine, un basso mCherry riflette la degradazione all'interno del lisosoma. Un grafico a dispersione generato dall'intensità media del fluoroforo di ciascuna particella positiva mCherry Atg8 segmentata semi-automaticamente illustra il flusso attraverso la via lisosomiale dell'autofagia che può essere separata in passaggi discreti mediante analisi a quadranti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i parametri definiti dall'utente nelle fasi di analisi delle immagini dipendono fortemente dall'applicazione.Quindi fai attenzione a documentare il flusso di lavoro per garantire coerenza e comparabilità tra i campioni.

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Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati. I cervelli vengono fissati, lavati e trattati con un agente antisbiadimento prima del montaggio. Le immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale e quantificate per osservare la trasmissione di aggregati proteici mutanti.

Imaging e quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati

Drosophila è ampiamente usato come sistema modello per studiare neurodegenerazione. Questo protocollo descrive un metodo con cui la degenerazione, come determinato dalla formazione vacuolo nel cervello, può essere quantificato. Si riduce anche effetti dovuti alla procedura sperimentale di elaborazione e controllo sezionamento e mosche sperimentali come un campione.

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em&gt; Drosophila</em

Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Raccogliendo la prova sostiene l'idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula--cellula diffusione del prione-come i complessi nell'organismo modello, Drosophila melanogaster.

Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster

Questo protocollo è centrato sull'analisi quantitativa della complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila, che può essere utilizzato per gli studi della morfogenesi dendritica.

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

L'obiettivo di questa procedura è quello di sezionare il tessuto del muscolo longitudinale dorsale (DLM) per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari DLM (NMJ) nei modelli di malattia neurodegenerativa utilizzando Drosophila melanogaster.

Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

Qui, vengono descritti metodi non invasivi per la localizzazione delle proteine di membrana dei fotorecettori e la valutazione della degenerazione retinica nell'occhio composto Drosophila utilizzando la fluorescenza eGFP.

Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP

Questo studio presenta un protocollo semplificato per l'elaborazione dei tessuti che coinvolge la decapitazione, la fissazione, la criosezione, la colorazione a fluorescenza, l'immunocolorazione e l'imaging, che può essere esteso all'imaging confocale e multifotonico. Il metodo mantiene un'efficacia paragonabile alle dissezioni complesse, bypassando la necessità di capacità motorie avanzate. L'analisi quantitativa delle immagini offre un ampio potenziale di indagine.

Criosezione diretta delle teste di Drosophila per una migliore colorazione a fluorescenza cerebrale e immunocolorazione

Scopri un workflow semi-automatizzato per l'analisi imparziale delle proteine fluorescenti in Drosophila. Questo metodo quantifica aggregati proteici e flusso autofagico per studiare i meccanismi della neurodegenerazione.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ (Video) | JoVE Journal

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

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