Name: Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Scopri un workflow semi-automatizzato per l'analisi imparziale delle proteine fluorescenti in Drosophila. Questo metodo quantifica aggregati proteici e flusso autofagico per studiare i meccanismi della neurodegenerazione.

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Questo lavoro è supportato da Sheila e David Fuente neuropatico dolore ricerca programma Istituto europeo di Oncologia (a J.M.B.), il Lois Pope LIFE Fellows Program (di C.L., Y.Z. e J.M.B.), la Snyder-Robinson Foundation Fellowship Predoctoral (a C.L.), il Dr. John T . Fondazione di Macdonald (a C.L.), contratti, borse di studio dal National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 e R56NS095893 (per R.G.Z.) e dal progetto di studioso di Taishan (Provincia di Shandong, Repubblica popolare cinese) (per R.G.Z.).

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<li>Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+lysosomal+dysfunction+causes+cargo-specific+deficits+of+axonal+transport+leading+to+Alzheimer-like+neuritic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy.</a> Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).</li>
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<li>Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+and+characterization+of+intracellular+protein+aggregates+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast.</a> Prion. 8 (3), 276-284 (2014).</li>
<li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(10)00063-2">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per robustamente e riproducibile quantitate processi biologici delle cellule visualizzati da formazione immagine di fluorescenza-basata. Contesto biologico e limiti tecnici devono essere attentamente considerati per guidare il disegno sperimentale. Marcatori fluorescenti di strutture subcellulari di interesse, se immunohistochemical, dye-based o geneticamente espresse, devono essere distinguibili sopra priorità bassa di morfologia e intensità. Il sistema GAL4/UAS...

Malattie neurodegenerative colpiscono milioni di persone ogni anno e l'incidenza sta aumentando con l'invecchiamento della popolazione1. Mentre ogni malattia neurodegenerative ha un'eziologia unica, aggregazione delle proteine misfolded e ripartizione della rete proteostasis sono patologici comuni caratteristiche di molte di queste malattie. Delucidamento come rottura di questi processi fondamentali e interdipendenti va storto per contribuire alla morte delle cellule e la disfunzione neuronale è fondamentale per la comprensione delle malattie neurodegenerative così come guidare gli interventi terapeutici. Acquisizione di immagini basata sulla fluorescenza permette per indagine su questi processi complessi e dinamici nei neuroni e ha notevolmente contribuito alla nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali. Analisi di proteine fluorescente è impegnativo, specialmente quando gli esperimenti sono effettuati in vivo, a causa di tessuti altamente compatti, tipi cellulari diversi ed eterogeneità morfologica. Manuale assistita quantificazione è conveniente e semplice, ma è spesso richiede tempo e soggetto a pregiudizi umani. Di conseguenza, c'è una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging.
Abbiamo delineato un flusso di lavoro semplice e adattabile con Fiji/ImageJ, un'immagine potente e liberamente accessibile, elaborazione software2,3, per estrarre dati quantitativi da studi di formazione immagine di fluorescenza in modelli sperimentali di neurodegenerazione utilizzando Drosophila. Seguendo questo protocollo per quantificare l'aggregazione proteica e flusso autofagico — due cellulari caratteristiche biologiche che sono altamente pertinenti alla patologia di malattia neurodegenerative — abbiamo dimostrato la sensibilità e la riproducibilità di questo approccio. Analisi delle proteine fluorescente contrassegnati huntingtina (Htt) nel lobo ottico di Drosophila ha rivelato il numero, la dimensione e l'intensità degli aggregati della proteina. Abbiamo visualizzato un reporter fluorescente tandem di autophagic flusso all'interno del sistema visivo di Drosophila , che mostra segnali di emissione diversi a seconda l' ambiente compartimentali4. Analisi basata su raziometrici del reporter tandem ammessi per una visione quantitativa e globale di cambiamento continuo di autofagia-lisosoma da formazione dell'autofagosoma, maturazione e trasporto alla degradazione nel lisosoma e inoltre evidenziato vulnerabili compartimenti in circostanze neurodegenerative interrotta. Importante, in entrambe le analisi abbiamo implementato passaggi di soglia e segmentazione semi-automatizzati nel nostro protocollo per ridurre al minimo la polarizzazione unconscious, aumentare la potenza di campionamento e fornire uno standard per facilitare i confronti tra studi simili. Il semplice flusso di lavoro è inteso a rendere potente plugin di Fiji/ImageJ (sviluppato da scienziati informatici basati su algoritmi matematici) più accessibile ai neurobiologi e la comunità di Scienze della vita in generale.

<table><tbody><tr><td>Kit di elastomeri siliconici SYLGARD(R) 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>PF184250</td><td>Piatto di dissezione</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Non trattato con TC Piastra di Petri batteriologica Easy-Grip</td><td>Corning</td><td>351008</td><td>Piatto di dissezione</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Strumento di dissezione</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Soluzione</td></tr> <tr><td>PBSFosfato di sodio bibasico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>PBS soluzione</td></tr><tr><td>Potassio Fosfato Monobasico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>PBS soluzione</td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Soluzione di lavaggio e incubazione di anticorpi.</td></tr>Provette per microcentrifuga monouso <tr>con <td>fissazione</td><td>VWR</td><td>10790-710</td> al <td>37% di formaldeide</td></tr><tr><td>(0,5 ml, blu)</td><td>VWR</td><td>89000-022</td><td>Fissaggio, lavaggio e incubazione di anticorpi.</td></tr><tr><td>Micro vetrini lisci e smerigliati (25&volte; 75mm)</td><td>VWR</td><td>48312-004</td><td>Vetrini per imaging confocale</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, rettangolari (22&times; 40mm)</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td>Vetrini per imaging confocale</td></tr><tr><td>Gomma Cemento</td><td>Slime</td><td>1051-A</td><td>Montaggio</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaggio Medio</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Nastro</td></tr><tr><td>invisibile Scotch Magic 810 (19mm&volte; 25,4 m)</td><td>3M Company</td><td>810</td><td>Montaggio</td></tr><tr>Siero di<td>capra normale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Incubazione di anticorpi</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Colorazione con acido nucleico. Sciogliere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione madre da 5 mg/mL e conservare a -80 °C. Diluire a una concentrazione di lavoro di 10-20 °C; g/mL in PBTx.</td></tr><tr><td>3.5X-90X Stereo Zoom Ispezione Microscopio industriale</td><td>AmScope</td><td>SM-1BNZ</td><td>Ambito di dissezione. Dotato di illuminatore a doppio collo d'oca a LED da 6 W</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v1.51u</td><td>Con plug-in SCF_MPI_CBG (versione 1.1.2)</td></tr><tr><td>FV1000-IX81 Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Costrutto ricombinante</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BL37749</td><td></td></tr></tbody></table>

biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando imagej

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Con la crescente diffusione di malattie neurodegenerative, è sempre più importante capire la patofisiologia di fondo che conduce alla perdita e disfunzione neuronale. Tecnologie e strumenti di imaging basata sulla fluorescenza abilitare analisi senza precedenti dei processi neurobiologici subcellulari, eppure c'è ancora una necessità di approcci imparziale, riproducibile e accessibile per l'estrazione di dati quantificabili da studi di imaging . Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi dagli studi di formazione immagine di fluorescenza-basata della drosofila in modelli di neurodegenerazione. In particolare, descriviamo un metodo facile da seguire, semi-automatizzato utilizzando Fiji/ImageJ per analizzare i due processi cellulari: in primo luogo, quantifichiamo aggregazione proteica e profilo nel lobo ottico Drosophila utilizzando fluorescenti-etichetta mutante proteine di huntingtin; e in secondo luogo, valutiamo il flusso di autofagia-lisosoma nel sistema visivo della drosofila con quantificazione basata su raziometrici di un reporter fluorescente tandem dell'autofagia. D'importanza, il protocollo descritto qui include un passaggio di segmentazione semi-automatizzata per garantire che tutte le strutture fluorescenti sono analizzate per minimizzare il bias di selezione e per aumentare la risoluzione di sottili confronti. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altre strutture biologiche cellulari e processi implicati nei processi neurodegenerativi, quali proteinico puncta (granuli di stress e complessi sinaptici), anche come membrana-limitano scomparti (mitocondri e vescicole della membrana del traffico). Questo metodo fornisce un standardizzato, ma adattabile riferimento punto per analisi dell'immagine e la quantificazione e potrebbe facilitare affidabilità e riproducibilità attraverso il campo e infine migliorare comprensione meccanicistica della neurodegenerazione.

Quantificazione del numero, zona e intensità degli aggregati Htt mutanti fluorescente contrassegnati nel lobo ottico di Drosophila
Per indagare l'aggregazione di proteine misfolded nel sistema nervoso centrale di un modello di Drosophila della malattia di Huntington, RFP-etichetta mutante umano Htt con un non-patologico (UAS-RFP-hHttQ15) o espansione patologica ( UAS-RFP-hHttQ138) e membrana GFP ...

Abbiamo sviluppato un flusso di lavoro semplice e adattabile per estrarre dati quantitativi da studi biologici basati su formazione immagine di fluorescenza delle cellule di aggregazione proteica e flusso autofagico nel sistema nervoso centrale di Drosophila modelli di neurodegenerazione.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Abbiamo sviluppato questo metodo per estrarre dati quantitativi da studi di imaging basati sulla fluorescenza per estrarre processi biologici cellulari complessi e dinamici in modelli di neurodegenerazione di Drosophila. Il vantaggio principale di questa tecnica è il suo flusso di lavoro di analisi delle immagini adattabile e semi-automatizzato per ridurre al minimo le distorsioni di selezione, massimizzare la potenza di campionamento e ottenere la riproducibilità sul campo. Questo approccio può essere esteso per l'analisi di altri punti proteici e compartimenti legati alla membrana implicati nella neurodegenerazione che in ultima analisi miglioreranno la nostra comprensione meccanicistica delle malattie neurodegenerative.Per mantenere intatta la lamina durante la dissezione, al microscopio stereoscopico, far scorrere due pinze sotto la retina e strappare delicatamente il centro dell'occhio per rimuovere la retina. Mantenendo la pinza parallela alla superficie della lamina, si allontana il tessuto retinico rimanente attaccato alla lamina. Sezionare da tre a cinque cervelli per ogni gruppo e trasferire i cervelli in una provetta da microcentrifuga contenente un fissativo appropriato

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Singolo Drosophila Ommatidium Dissection e Imaging

Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati. I cervelli vengono fissati, lavati e trattati con un agente antisbiadimento prima del montaggio. Le immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale e quantificate per osservare la trasmissione di aggregati proteici mutanti.

Imaging e quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati

Drosophila è ampiamente usato come sistema modello per studiare neurodegenerazione. Questo protocollo descrive un metodo con cui la degenerazione, come determinato dalla formazione vacuolo nel cervello, può essere quantificato. Si riduce anche effetti dovuti alla procedura sperimentale di elaborazione e controllo sezionamento e mosche sperimentali come un campione.

Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em&gt; Drosophila</em

Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

Questo protocollo descrive la dissezione e immunostaining del adulto Drosophila melanogaster tessuti del cervello. In particolare, questo protocollo evidenzia l'uso di Drosophila fungo del fotoricettore e corpo neuroni come sottoinsiemi di un neurone di esempio che possono essere utilizzati con precisione per scoprire i principi generali alla base di molti aspetti dello sviluppo neuronale.

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Raccogliendo la prova sostiene l'idea che aggregati proteici patogeni associati con malattie neurodegenerative diffuse tra cellule con proprietà simil-da prioni. Qui, descriviamo un metodo che permette la visualizzazione della cellula--cellula diffusione del prione-come i complessi nell'organismo modello, Drosophila melanogaster.

Monitoraggio-cellula-trasmissione degli aggregati della proteina del Prion-come in Drosophila Melanogaster

L'obiettivo di questa procedura è quello di sezionare il tessuto del muscolo longitudinale dorsale (DLM) per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari DLM (NMJ) nei modelli di malattia neurodegenerativa utilizzando Drosophila melanogaster.

Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione

Qui, vengono descritti metodi non invasivi per la localizzazione delle proteine di membrana dei fotorecettori e la valutazione della degenerazione retinica nell'occhio composto Drosophila utilizzando la fluorescenza eGFP.

Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP

Questo studio presenta un protocollo semplificato per l'elaborazione dei tessuti che coinvolge la decapitazione, la fissazione, la criosezione, la colorazione a fluorescenza, l'immunocolorazione e l'imaging, che può essere esteso all'imaging confocale e multifotonico. Il metodo mantiene un'efficacia paragonabile alle dissezioni complesse, bypassando la necessità di capacità motorie avanzate. L'analisi quantitativa delle immagini offre un ampio potenziale di indagine.

Criosezione diretta delle teste di Drosophila per una migliore colorazione a fluorescenza cerebrale e immunocolorazione

Abbiamo sviluppato un programma per computer per analizzare la morfologia neuronale. In combinazione con due strumenti source aperta esistente analisi, il nostro programma esegue l'analisi Sholl e determina il numero di neuriti, punti di ramificazione, e suggerimenti dei neuriti. Le analisi vengono eseguite in modo che i cambiamenti nella morfologia locale neurite può essere osservato.

Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Scopri un workflow semi-automatizzato per l'analisi imparziale delle proteine fluorescenti in Drosophila. Questo metodo quantifica aggregati proteici e flusso autofagico per studiare i meccanismi della neurodegenerazione.

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Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

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