Mantenimento di colture biologiche e misurazione dell'espressione genica in Aphis nerii: un sistema Non-modello per le interazioni pianta-insetto

Questo metodo descrive le fasi generali per la coltura degli afidi e le fasi per l'analisi genetica degli afidi. Questi metodi possono essere applicati per rispondere a domande chiave sull'evoluzione e l'ecologia degli afidi e sui meccanismi molecolari alla base della biologia degli afidi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere generalmente applicata alla maggior parte delle specie di afidi ed eseguita a un costo relativamente basso.

Inizia riempiendo un vassoio per piantine standard con terriccio per la germinazione, facendo attenzione che il terreno raggiunga la parte superiore dei pozzetti. Quando tutti i pozzetti sono stati riempiti, fai un buco profondo tre centimetri nel terreno di ogni pozzetto e metti un seme in ogni buco. Innaffia le celle fino a quando il terreno che copre i semi è saturo e posiziona il vassoio in una serra con annaffiature giornaliere o a giorni alterni, per mantenere un livello moderato di umidità del suolo.

Quando le piantine hanno sviluppato la loro prima serie di foglie piene, riempi vasi rotondi da quattro pollici con terriccio, fino a circa cinque centimetri sotto i loro bordi. Crea un intero terreno abbastanza profondo da raggiungere il fondo del vaso e raccogli delicatamente le piantine mature a mano per posizionarle in profondità all'interno dei fori dei nuovi vasi. Quindi, copri le piantine con terra e innaffia le piantine ogni giorno a giorni alterni per mantenere un livello di umidità del suolo moderato.

Quando le piante hanno sviluppato almeno tre o quattro serie di foglie intere e sono alte almeno dieci centimetri, ispezionare manualmente le piante alla ricerca di eventuali parassiti indesiderati e utilizzare una pipetta orale per trasferire con cura un singolo afide adulto raccolto sul campo riproduttivo sulla foglia della prima pianta per creare una linea isoclonale. Quando tutti gli afidi sono stati trasferiti, copri in modo sicuro le piante con una gabbia a tazza su misura e posiziona le piante infestate da afidi in una camera in ambiente controllato. Per mantenere le popolazioni di allevamento, utilizzare una pipetta orale per trasferire in sicurezza da una a tre ninfe di secondo o terzo stadio e un afide adulto di età in una nuova pianta su base settimanale.

E copri ogni pianta con una nuova gabbia a tazza per la cultura, come dimostrato. Per l'estrazione del DNA da un singolo afide adulto, posizionare l'afide vicino al fondo di una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente azoto liquido e macinare l'afide con un pestello. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi alla provetta per microcentrifuga e continuare a macinare l'afide frantumato fino a quando il campione non è visibilmente disintegrato.

Lavare il pestello con altri 100 microlitri di tampone di lisi e incubare l'afide macinato a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione aggiungere 14 microlitri di acetato di potassio aemulor alla provetta e capovolgere per mescolare. Dopo 30 minuti sul ghiaccio, raccogliere i detriti cellulari mediante centrifugazione e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri senza disturbare il pellet.

Aggiungere 200 microlitri di etanolo freddo al 100% di grado molecolare al surnatante e capovolgere il tubo per mescolare. Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, raccogliere il DNA precipitato mediante centrifugazione e rimuovere l'etanolo mediante pipetta. Risospendere il pellet in 200 microlitri di etanolo freddo al 70% di grado molecolare con flicking per un secondo lavaggio a centrifuga.

E risospendere il pellet in 200 microlitri di etanolo fresco e freddo al 100% di grado molecolare. Dopo la terza centrifugazione, posizionare la provetta orizzontalmente su un pezzo di carta velina per l'asciugatura all'aria per cinque-dieci minuti. E risospendere il pellet di DNA in 80 microlitri di tris edta basso.

Quindi, quantificare il DNA risospeso in uno spettrofotometro e conservare il campione rimanente a quattro gradi Celsius. Dopo aver frantumato fino a cinque afidi adulti in azoto liquido come dimostrato, trasferire il campione in una cappa aspirante e aggiungere 800 microlitri di reagente per l'estrazione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio nella provetta del campione. Omogeneizzare il campione con un pestello e incubare l'omogeneizzato per cinque minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, aggiungere 160 microlitri di cloroformio al campione, seguiti da 15 secondi di vigorosa agitazione manuale. Quindi, incubare il campione per due o tre minuti a temperatura ambiente e centrifugare per raccogliere l'RNA estratto. Per precipitare l'RNA, trasferire la fase acquosa in una nuova provetta da microcentrifuga senza RNS senza disturbare la fase intermedia e aggiungere 400 microlitri di isopropanolo all'RNA.

Dopo un'incubazione di dieci minuti a 20 gradi Celsius, raccogliere l'RNA precipitato mediante centrifugazione. Quindi, lavare il campione due volte con un millilitro di etanolo al 75% in acqua trattata con dietilpirocarbonato, fino al campione con vortice lento e centrifugazione per rimuovere eventuali contaminanti fenolici. Dopo il secondo lavaggio, asciugare il pellet per cinque-dieci minuti all'aria su un banco sterile e sciogliere il pellet di RNA in 30 microlitri di acqua ultra pura con pipettaggio delicato prima di un'incubazione di dieci-15 minuti a 55-60 gradi Celsius.

I semi impiegheranno dalle due alle quattro settimane, a seconda della stagione, per crescere abbastanza grandi da essere rinvasati. Le piantine rinvasate impiegheranno altre due o quattro settimane per raggiungere una dimensione ottimale per la coltura degli afidi. Gli adulti si distinguono per una cauda scura e possono essere senza ali o alati.

I cuscinetti alari in via di sviluppo diventano visibili quando le ninfe raggiungono il terzo stadio. Un singolo adulto aye-near-ee-eye produrrà circa 100-200 nanogrammi per microlitro di DNA e da 150 a 300 nanogrammi per microlitro di RNA. È quindi possibile calcolare l'espressione relativa di un gene candidato in diverse condizioni di trattamento.

Quando si tenta questa procedura è importante non contaminare i propri ceppi isoclonali. Inoltre, ricorda che la qualità dei tuoi afidi dipende fortemente dalla qualità delle tue piante. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre estrazioni e tecniche di sequenziamento per rispondere a domande sui meccanismi molecolari alla base della biologia degli afidi.