Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot
25 settembre 2018
Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.
Questo metodo può essere utilizzato come strumento diagnostico per il cancro per analizzare il DNA tumorale circolante. Questa tecnica interroga l'alterazione genetica multipla nelle regioni di mutazioni a grappolo in una singola reazione. Questo aiuta a salvare preziosi campioni di pazienti.
Questo metodo può fornire informazioni sul carico tumorale sul suo profilo mutazionale. Ora può anche essere applicato ad un'analisi molecolare come alternativa al qPCR per ottenere una quantificazione assoluta delle sequenze bersaglio dell'acido nucleico. Raccogliere campioni di sangue in tubi EDTA da sette millilitri.
Si consiglia a due tubi di raccogliere circa quattro millilitri di plasma. Centrifugare i campioni di sangue per 10 minuti a 820 volte la gravità entro tre ore dall'estrazione del sangue per separare globuli rossi, globuli bianchi e plasma. Il tempo tra il campionamento e la centrifugazione è fondamentale per ottenere DNA di alto grado e privo di cellule T non contaminato dal DNA rilasciato dai globuli bianchi.
Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il supernatante senza toccare lo strato di globuli bianchi. Circa due millilitri di plasma vengono solitamente recuperati per tubo EDTA. Dopo aver trasferito i plasmi in due tubi millilitro, centrifugare le aliquote a 16.000 volte la gravità per 10 minuti a 15 gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari.
Raccogliere con cura il plasma senza disturbare il pellet e trasferirlo in due tubi criogenici millilitri. Conservare a -80 gradi Celsius fino a quando necessario. Inizia aggiungendo 400 microlitri di proteinasi K a un tubo da 50 millilitri.
Quindi, aggiungere quattro millilitri di plasma e 3,2 millilitri di tampone di lisi ACL contenente un microgrammo di RNA portante dal kit di estrazione. Chiudere il tubo e mescolare vortici per 30 secondi per ottenere una soluzione omogenea. Quindi, incubare a 60 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere 7,2 millilitri di tampone ACB al lisato per ottimizzare il legame degli acidi nucleici circolanti alla membrana silicea. Mescolare con vortice per 15-30 secondi. Quindi, incubare il tubo sul ghiaccio per cinque minuti.
Attaccare la colonna e l'estensore da 20 millilitri alla pompa per vuoto. Chiudere le porzioni inutilizzate per consentire l'aspirazione del vuoto. Dopo aver centrifugato brevemente il tubo, introdurre con cura la miscela nell'estensore del tubo.
Quindi accendere la pompa per vuoto e lasciare che il lisato venga disegnato completamente attraverso le colonne. Rimuovere e scartare l'estensore del tubo. Applicare quindi 600 microlitri di buffer ACW1 alla colonna.
Quando il buffer ACW1 ha disegnato attraverso la colonna, aggiungere 750 microlitri di tampone ACW2 e, infine, 750 microlitri dal 96 al 100% di etanolo. Quindi, posizionare la colonna in un tubo di raccolta pulito da due millilitri e centrifugare a tutta velocità per tre minuti per eliminare l'etanolo. Dopo aver posizionato la colonna in un nuovo tubo di raccolta a due millilitri, aprire il coperchio e quindi incubare a 56 gradi Celsius per 10 minuti per asciugare completamente la membrana.
Dopo l'incubazione, posizionare la colonna in un tubo pulito a bassa legatura da 1,5 millilitri. Applicare con cura 36 microlitri di acqua priva di RNasi con azide di sodio dello 0,04%. Quindi, chiudere il coperchio e incubare a temperatura ambiente per tre minuti.
Centrifugare di nuovo a tutta velocità per un minuto per elutare gli acidi nucleici. Quindi, conservare a -20 gradi Celsius fino a quando necessario. Iniziare scongelando ed equilibrando i componenti di reazione a temperatura ambiente in una cappa PCR pulita.
Quindi preparare un mix 20 volte di primer e sonde in acqua distillata priva di RNasi e Dnase con ogni primer a concentrazione micromolare 18 e ogni sonda a cinque concentrazione micromolare. Per tutte le singole reazioni PCR, preparare un mix di campioni combinando 10 microlitri di supermix ddPCR due volte, un microlitro di 20 volte primer e sonde mixare e fino a 10 nanogrammi del campione di DNA in 20 microlitri di acqua distillata. Vortice la miscela di reazione accuratamente per garantire omogeneità.
E centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto nella parte inferiore del tubo prima di erogare. Inserire la cartuccia ddPCR nel supporto e caricare 20 microlitri di miscela di reazione del campione nei pozzi centrali della cartuccia per la generazione di goccioline. Aggiungere 70 microlitri di olio generatore di goccioline nei pozzi inferiori.
Inserire la cartuccia con una guarnizione nel generatore di goccioline. Le goccioline saranno prodotte nei pozzi superiore della cartuccia. Aspirare lentamente e delicatamente 40 microlitri delle goccioline dalle cartucce e erogare in una piastra PCR da 96 po'.
Sigillare la piastra PCR finale con un foglio di alluminio utilizzando un sigillante a piastre immediatamente dopo il trasferimento delle goccioline per evitare l'evaporazione. Centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto nella parte inferiore dei pozzi. Eseguire un'amplificazione PCR convenzionale su un ciclore termico.
Al termine della corsa, centrifugare brevemente la piastra per raccogliere il contenuto nella parte inferiore dei pozzi. Dopo l'amplificazione PCR, utilizzare il lettore di goccioline per contare le goccioline positive PCR e PCR negative seguendo le istruzioni del produttore. Di seguito sono riportato i risultati rappresentativi ottenuti durante le fasi di ottimizzazione del saggio ddPCR drop-off.
Questa immagine mostra il rilevamento del DNA mutante e del DNA di tipo selvatico in una reazione contenente il 100% di DNA mutante, il 5% di DNA mutante e il DNA al 100% di tipo selvaggio. Questa immagine mostra esempi di campioni di plasma analizzati con i test ddPCR drop-off KRAS ed EGFR che mostrano il rilevamento di singoli nucleotidi e sostituzioni multiple nell'esone due di KRAS e una cancellazione nell'esone 19 EGFR. Durante il tentativo di questa procedura, è importante procedere con attenzione in ogni passaggio con un'attenzione speciale alla generazione di goccioline, che è un passaggio critico di questo metodo.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada a ricercatori e clinici nel campo della ricerca sul cancro per ottimizzare l'analisi delle mutazioni tumorali utilizzando la biopsia liquida.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto il metodo della PCR digitale a goccioline per rilevamento di perdita (ddPCR), una tecnica altamente sensibile per il rilevamento e la quantificazione del DNA tumorale circolante (ctDNA) nella diagnostica del cancro. L'approccio ddPCR per rilevamento di perdita consente l'analisi simultanea di molteplici alterazioni genetiche all'interno di regioni di mutazione raggruppate, preservando campioni preziosi di pazienti e aumentando la produttività rispetto alla ddPCR standard.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Diagnostica molecolare
- Genomica del cancro
- Biotessuto liquido
Sfondo
- La ddPCR standard è un metodo sensibile di PCR quantitativa che suddivide i campioni in migliaia di goccioline nanostrutturate di acqua in olio.
- È ampiamente utilizzata per il rilevamento di ctDNA, ma è limitata dal numero di mutazioni che possono essere analizzate per reazione a causa della necessità di sonde specifiche.
- Il metodo drop-off ddPCR utilizza una singola coppia di sonde per rilevare un'ampia gamma di alterazioni genetiche in una regione bersaglio.
- Questo approccio è economico, preserva il materiale campione ed è utilizzabile nella scoperta di mutazioni quando queste non sono note a priori.
Scopo dello studio
- Presentare un protocollo per la tecnica ddPCR con rilascio della goccia per l'analisi del ctDNA.
- Dimostrarne l'applicazione nel rilevamento di multiple mutazioni in una singola reazione.
- Evidenziarne i vantaggi rispetto ai metodi ddPCR convenzionali e alla qPCR.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni di sangue in provette con EDTA e separazione del plasma mediante centrifugazione.
- Estrazione di acidi nucleici circolanti mediante proteinasi K, buffer di lisi e colonne con membrana di silice.
- Preparazione delle reazioni di ddPCR con primer e sonde specifici.
- Generazione di goccioline, amplificazione PCR e lettura delle goccioline per la quantificazione del DNA mutante e di tipo selvaggio.
Risultati principali
- Il saggio ddPCR con rilevamento di drop-off rileva con successo sia sostituzioni singole di nucleotidi che multiple, nonché delezioni in geni bersaglio (ad esempio, KRAS e EGFR).
- Risultati rappresentativi mostrano una chiara discriminazione tra DNA mutante e di tipo selvaggio in campioni di plasma.
- Il metodo consente la quantificazione assoluta di bersagli di acidi nucleici e fornisce informazioni sul carico tumorale e sui profili mutazionali.
- Passaggi critici includono una generazione e manipolazione accurata delle goccioline per garantire sensibilità e accuratezza del saggio.
Conclusioni
- La ddPCR drop-off è un metodo robusto, sensibile ed economico per l'analisi del ctDNA nella diagnostica del cancro.
- Consente il rilevamento multiplex di mutazioni in una singola reazione, preservando il materiale del campione.
- Questa tecnica supporta applicazioni cliniche e di ricerca nel profilo delle mutazioni tumorali mediante biopsia liquida.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La PCR digitale a goccioline (ddPCR) consente un rilevamento completo e simultaneo di molteplici mutazioni nelle regioni hotspot a partire da campioni limitati di biopsia liquida, affrontando direttamente le sfide relative alla sensibilità e alla capacità di analisi nel rilevamento precoce dei biomarcatori oncologici. Questo approccio permette la quantificazione assoluta del DNA tumorale circolante (ctDNA), facilitando un profilo robusto delle mutazioni tumorali e migliorando la fiducia predittiva in punti critici di scoperta e transizione traslazionale. L'efficienza del campione e la capacità di multiplex lo rendono un asset strategico per la selezione del portafoglio e l'avanzamento basato sulla gestione del rischio nella ricerca e sviluppo oncologica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi di regioni con mutazioni raggruppate per chiarire i percorsi oncogenici e validare bersagli terapeutici agibili.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo profili quantitativi di mutazione a partire da campioni minimi di pazienti.
- Facilita la previsione e l'affidabilità nella selezione dei bersagli e nelle decisioni iniziali di prosecuzione o interruzione dei programmi in oncologia.
Screening e sviluppo di saggi
- Prepara sistemi validati di rilevamento del ctDNA per flussi di lavoro di screening e biomarcatori successivi.
- Fornisce output standardizzati, riproducibili e quantitativi per il rilevamento di mutazioni in più alleli.
- Consente uno screening scalabile e multiplex con input minimo di campione, supportando uno sviluppo efficiente dei saggi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alle strategie di biomarcatori pertinenti alle malattie consentendo il monitoraggio delle mutazioni basato sulla biopsia liquida.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica supportando la quantificazione assoluta del ctDNA.
- Riduce il rischio traslazionale consentendo la rilevazione precoce dell'eterogeneità mutazionale in campioni derivati dai pazienti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La ddPCR con rilevamento in drop-off si integra dalla fase iniziale di scoperta fino all'identificazione dei candidati e alla ricerca traslazionale, supportando la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi molecolari e i processi decisionali guidati da biomarcatori nei percorsi oncologici.
- Biologia della scoperta: Supporta test robusti dell'ipotesi nulla e riduzione del rischio meccanicistico consentendo il rilevamento multiplex di mutazioni nel ctDNA.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio per l'analisi ad alto rendimento di mutazioni in campioni di biopsia liquida.
- Analisi: Fornisce una quantificazione assoluta e una chiara discriminazione tra alleli mutanti e di tipo selvaggio per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori e la continuità preclinica monitorando il carico tumorale e i profili mutazionali.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile e scalabile per la scoperta e il monitoraggio di mutazioni in diversi programmi di oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca oncologica basata sulle mutazioni.
- Valore operativo: Standardizza l'analisi del ctDNA con elevata sensibilità, riproducibilità e requisiti minimi di campione.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di tipo go/no-go e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale, fornendo precocemente dati su mutazioni multiplex.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento mirati degli asset oncologici sulla base di evidenze solide relative a biomarcatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in diagnostica molecolare e nell'uso di strumentazione per PCR digitale a goccioline.
- Richiede una generazione e manipolazione precisa delle goccioline per mantenere la sensibilità e l'accuratezza del saggio.
- Necessita di protocolli standardizzati per la raccolta, l'elaborazione e la conservazione dei campioni per garantire la riproducibilità.
- È adattabile a diversi bersagli di mutazione, ma dipende dalla progettazione delle sonde per le regioni target.
- I limiti relativi all'input del campione e alla generazione delle goccioline sono fattori critici per ottenere risultati affidabili.
