Name: Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri il metodo drop-off ddPCR per la rilevazione simultanea di mutazioni multiple nel DNA tumorale circolante. Questa tecnica consente il profilo mutazionale con biopsia liquida in oncologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato supportato da Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Gli autori desiderano ringraziare Caroline Hego per il suo contributo al video.

<ol><li>Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li>
<li>Amado, R. G., Wolf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-Type+KRAS+Is+Required+for+Panitumumab+Efficacy+in+Patients+With+Metastatic+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).</li>
<li>Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-ras+mutations+and+benefit+from+cetuximab+in+advanced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer.</a> New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).</li>
<li>Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+monitoring+circulating+tumor+DNA%3A+a+cancer+diagnostic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).</li>
<li>Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+for+triple-negative+breast+cancer+diagnosis+and+treatment+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).</li>
<li>Decraene, C., Silveira, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Hotspot+Mutations+Scanning+by+Single+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR.</a> Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).</li>
<li>Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+Comprises+an+In+Vivo+Nucleosome+Footprint+that+Informs+Its+Tissues-Of-Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.</a> Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).</li>
<li>Bidshahri, R., Attali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Detection+and+Resolution+of+BRAF+V600+Status+in+Colorectal+Cancer+Using+Droplet+Digital+PCR+and+a+Novel+Wild-Type+Negative+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).</li>
<li>Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddpcr%3A+an+R+package+and+web+application+for+analysis+of+droplet+digital+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Forbes, S. A., Beare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+somatic+cancer+genetics+at+high-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).</li>
</ol>

Diversi autori sono denominati inventori due delle domande di brevetto (EP17305920.5, EP18305277.8) relazionati al rilevamento di ctDNA.

Per progettare un'analisi ddPCR di consegna efficiente, ottimizzazione è fondamentale, e il protocollo deve essere seguito attentamente. Ogni combinazione di primer e sonde ha un unico efficienza di reazione di PCR. Pertanto, un'analisi individuale deve essere convalidato con attenzione su campioni di controllo prima di essere utilizzati su campioni di prova importante. Ottimizzazione e validazione sono importanti per certificare il rilevamento del segnale di picco e valutare la sensibilità e specificità. Come descritto ...

Migliaia di mutazioni somatiche legate allo sviluppo del cancro è stati segnalati1. Tra questi, alcuni sono marcatori predittivi dell'efficacia della terapia mirata 2,3 e la selezione di queste mutazioni genetica è pratica clinica di routine in questo momento. Tecnologia digitale di PCR (ddPCR) della gocciolina può essere utilizzata per monitorare la presenza o l'assenza di mutazioni con elevata accuratezza ed è altamente compatibile con biopsie liquido invasivo4,5. Tuttavia, la corrente ddPCR saggi sono progettati principalmente per rilevare mutazioni conosciute a priori. Questo limita fortemente l'uso di ddPCR come uno strumento di scoperta quando la mutazione è sconosciuta. Infatti, nella progettazione convenzionale ddPCR, una sonda di idrolisi riconoscendo l'allele wild-type (WT sonda) compete con una sonda specifica per riconoscere l'allele del mutante (MUT sonda) (Figura 1A). La sonda con maggiore affinità ibridizza con il modello e rilascia il fluoroforo, che indica la natura dell'allele corrispondente. I dati di fluorescenza ottenuti per ciascuna gocciolina possono essere visualizzati in un grafico a dispersione che rappresenta la fluorescenza emessa dalle sonde WT e MUT in diverse dimensioni. Una rappresentazione schematica di un risultato tipico per un dosaggio di ddPCR convenzionale è presentata in Figura 1A. In questo esempio, la nuvola blu corrisponde alle goccioline contenenti alleli WT identificati dalla sonda WT, mentre la nuvola rossa corrisponde a goccioline in cui l'allele MUT è stato amplificato e identificato dalla sonda MUT. A seconda della quantità di DNA caricato nella reazione, doppie positive goccioline contenenti sia WT e MUT ampliconi possono apparire (nuvola verde). La nuvola grigia luce corrisponde a goccioline vuote.
Poiché la maggior parte delle piattaforme consentono la rilevazione di un numero limitato di fluorofori (solitamente 2, ma fino a 5), velocità effettiva di ddPCR convenzionale è limitata. Targeting per regioni con mutazioni multiple adiacenti richiede pertanto, progettazione di tecnicamente impegnativi saggi multiplex ddPCR o l'utilizzo di reazioni multiple targeting ogni mutazione in parallelo. La strategia di ddPCR di drop-off, supera questa limitazione come potenzialmente può rilevare qualsiasi alterazione genetica all'interno di un'area di destinazione utilizzando un unico paio di WT idrolisi sonde. Le prime coperture di sonda (sonda 1) una sequenza non variabile, adiacente alla regione di destinazione e la seconda sonda (sonda 2) è complementare alla sequenza WT della regione di destinazione, dove le mutazioni sono attesi (Figura 1B). Mentre la prima sonda quantifica la quantità totale di molecole amplificabile nella reazione, la seconda sonda discrimina gli alleli WT e MUT tramite l'ibridazione sub-ottima alle sequenze mutanti. Sonda 2 può identificare diversi tipi di mutazioni in destinazione regione (sostituzioni nucleotidiche singole o multiple, cancellazione, ecc.)6. Come ddPCR convenzionale, la nuvola grigia luce corrisponde a goccioline non contenenti nessun molecole di DNA. È importante ricordare che in questo tipo di analisi, una ottimale separazione delle nuvole WT e MUT è dipenda dalla quantità di DNA caricato nella reazione, dal momento che le goccioline contenenti sia WT e MUT alleli di destinazione non possono essere distinto da goccioline contenenti solo il WT modulo. Pertanto, questo test richiede che la maggior parte delle goccioline contengono non più di una copia del gene mirato.

<table><tbody><tr><td>Provetta K2EDTA (codice colore: lavanda)</td><td>Le</td> provette BD <td>367863</td><td>EDTA vengono utilizzate per ottenere un campione di sangue intero o di plasma EDTA</td></tr><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (protocollo manuale)</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>Per l'isolamento di DNA circolante libero dal plasma umano</td></tr><tr><td>Kit di DNA circolante QIAsymphony DSP (protocollo automatizzato)Qiagen</td><td></td> <td>937556</td><td>Per l'isolamento di DNA circolante libero dal plasma umano</td></tr><tr><td>Sistema QIAsymphony SP</td><td>Qiagen</td><td>9001297</td><td>sistema completamente integrato e automatizzato per la purificazione di cfDNA, DNA o RNA</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>Per la purificazione simultanea di un massimo di 24 cfDNA Fluorimetro</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33226</td><td>Il fluorimetro Qubit è un fluorimetro da banco per la quantificazione del DNA</td></tr><tr><td>Lettore QX100 o QX200</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003 o 186-4003, rispettivamente</td><td>Il lettore misura l'intensità della fluorescenza di ciascuna gocciolina e rileva la dimensione e la forma quando le goccioline passano il rivelatore</td></tr><tr><td>QX100 o QX200 generatore di goccioline</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3002 o 186-4002, rispettivamente</td><td>Strumento utilizzato per la generazione di goccioline</td></tr><tr><td>C1000 termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Piattaforma modulare per termociclatori, include il telaio del termociclatore C1000 Touch, modulo di reazione rapida a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Sigillante per piastre</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4000</td><td>PX1&trade; Sigillante per piastre PCR</td></tr><tr><td>DG8 portacartuccia</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3051</td><td>Posiziona e trattiene la cartuccia DG8 nello strumento per la generazione di goccioline</td></tr><tr><td>Cartucce e guarnizioni per generatore di goccioline</td><td>Bio-Rad</td><td>186-4007</td><td>Cartuccia microfluidica DG8 utilizzata per miscelare campione e olio per generare goccioline; Le guarnizioni DG8 sigillano la cartuccia per prevenire l'evaporazione e applicare la pressione necessaria per la formazione di goccioline</td></tr><tr><td>PCR supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3010</td><td>ddPCR supermix per sonde (no dUTP)</td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>96 pozzetti semi-bordata</td></tr><tr><td>Guarnizione</td><td>Bio-Rad</td><td>181-4040</td><td>Lamina perforabile termosaldabile</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Bio-Rad</td><td>Olio 186-3004</td><td>utilizzato nella lettura</td></tr><tr><td>Olio per la generazione di goccioline per sonde</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3005</td><td>olio per la generazione di goccioline</td></tr><tr><td>Provetta DNA loBind 1,5 mL Eppendorf</td><td></td><td>0030 108.051</td><td>Le provette Eppendorf LoBind massimizzano il recupero del campione riducendo significativamente il legame campione-superficie</td></tr><tr><td>Set di standard di riferimento Multiplex I cfDNA</td><td>HORIZON</td><td>HD780</td><td>Gli standard di riferimento cfDNA Multiplex I sono materiali di riferimento altamente caratterizzati e biologicamente rilevanti utilizzati per valutare le prestazioni dei saggi cfDNA che rilevano le mutazioni somatiche</td></tr><tr><td>KIT DI SAGGI QUBIT DSDNA HS, 500</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Il test HS è altamente selettivo per il DNA a doppio filamento (dsDNA) rispetto all'RNA ed è progettato per essere accurato per concentrazioni iniziali del campione da 10 pg/&micro; L a 100 ng/&micro; Le</td></tr><tr><td>provette per saggi L Qubit Life</td><td>Technologies</td><td>Q32856</td> Le <td>provette per saggi Qubit sono 500 & micro; L Provette in polipropilene a parete sottile per l'uso con il fluorimetro Qubit</td></tr></tbody></table>

singola goccia digitale polymerase chain reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di hotspot

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reazione a catena della polimerasi digitale gocciolina (ddPCR) è un metodo di reazione a catena (PCR) altamente sensibile della polimerasi quantitativa basato sul frazionamento del campione in migliaia di dimensioni nano reazioni individuali di acqua in olio. Recentemente, ddPCR è diventato uno degli strumenti più precisi e sensibili per la rilevazione di DNA (ctDNA) del tumore di circolazione. Uno dei principali limiti della tecnica standard ddPCR è il limitato numero di mutazioni che possono essere sottoposti a screening per reazione, come sonde specifiche idrolisi riconoscendo ogni possibile versione alleliche sono necessari. Una metodologia alternativa, il ddPCR di drop-off, aumenta il throughput, poiché richiede solo una singola coppia di sonde per rilevare e quantificare potenzialmente tutte le alterazioni genetiche dalla regione di destinazione. Drop-off ddPCR Visualizza sensibilità paragonabile ai saggi di ddPCR convenzionale con il vantaggio di rilevare un maggior numero di mutazioni in una singola reazione. È conveniente, conserva materiale prezioso campione e può essere utilizzato anche come strumento di scoperta, quando le mutazioni non sono noti a priori.

In uno studio di proof-of-concept, mutazioni di KRAS esone 2 (codoni 12 e 13) ed EGFR esone 19 delezioni sono stati studiati nei tessuti FFPE e campioni di plasma dai malati di cancro utilizzando il drop-off ddPCR strategia6.
La sonda di drop-off KRAS interrogato una regione di bp 16 comprendente più mutazioni nell'esone 2 del gene KRAS , che oltre il 95% delle mutazion...

Qui, presentiamo un protocollo per quantificare con precisione le alterazioni genetiche multiple di una regione di destinazione in una singola reazione usando drop-off ddPCR e un paio di idrolisi sonde uniche.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Questo metodo può essere utilizzato come strumento diagnostico per il cancro per analizzare il DNA tumorale circolante. Questa tecnica interroga l'alterazione genetica multipla nelle regioni di mutazioni a grappolo in una singola reazione. Questo aiuta a salvare preziosi campioni di pazienti.Questo metodo può fornire informazioni sul carico tumorale sul suo profilo mutazionale. Ora può anche essere applicato ad un'analisi molecolare come alternativa al qPCR per ottenere una quantificazione assoluta delle sequenze bersaglio dell'acido nucleico. Raccogliere campioni di sangue in tubi EDTA da sette millilitri.Si consiglia a due tubi di raccogliere circa quattro millilitri di plasma. Centrifugare i campioni di sangue per 10 minuti a 820 volte la gravità entro tre ore dall'estrazione del sangue per separare globuli rossi, globuli bianchi e plasma. Il tempo tra il campionamento e la centrifugazione è fondamentale per ottenere DNA di alto grado e privo di cellule T non contaminato dal DNA rilasciato dai globuli bianchi.Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il supernatante senza toccare lo strato di globuli bianchi. Circa due millilitri di plasma vengo

single-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-for-comprehensive

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In questo video, presentiamo una procedura passo-passo per generare nano-goccioline emulsionate per rilevare gli acidi nucleici bersaglio mediante reazione a catena della polimerasi digitale o dPCR.

Reazione a catena della polimerasi digitale a goccioline: un metodo per generare reazioni di PCR con nanogocce per rilevare rare mutazioni tumorali

Questo video dimostra il ruolo della reazione a catena della polimerasi digitale nell'identificazione della mutazione indel in un campione di DNA. L'elevata precisione e sensibilità della ddPCR consentono di rilevare in modo accurato e coerente le mutazioni rare presenti in un campione, anche a bassi livelli. È in grado di identificare e quantificare le mutazioni indel in diverse regioni del genoma, fornendo preziose informazioni sui meccanismi di mutazione e sulle conseguenze funzionali di...

Reazione a catena della polimerasi digitale a goccioline per il rilevamento della mutazione Indel nei geni bersaglio

In questo video, dimostriamo la tecnica della PCR digitale duplex (ddPCR), una modifica della tradizionale tecnica PCR utile per rilevare contemporaneamente due diversi marcatori genetici. Una singola reazione PCR viene suddivisa in goccioline emulsionate di dimensioni nanolitrometriche che vengono amplificate in modo indipendente e il rilevamento di segnali di amplificazione della fluorescenza di colore diverso dalla frazione di goccioline viene utilizzato per calcolare la concentrazione...

PCR digitale duplex per la quantificazione simultanea di doppi marcatori genetici

In questo video, descriviamo una tecnica di PCR di fusione ad alta risoluzione per determinare il polimorfismo di lunghezza di frammenti di DNA di varie lunghezze di sequenza, in base all'analisi della temperatura di fusione.

PCR di fusione ad alta risoluzione per determinare le variazioni di sequenza nelle sequenze di DNA mutanti

Questo video dimostra l'utilità della PCR digitale in un formato chip-in-a-tube per il rilevamento di variazioni di singoli nucleotidi nei campioni di DNA. Una singola reazione di PCR è suddivisa in camere che agiscono come reazioni PCR indipendenti e il rilevamento dei segnali di fluorescenza dai bersagli amplificati nelle camere viene utilizzato per calcolare la frequenza dell'allele variante nel campione.

PCR digitale basata su chip-in-a-tube per la quantificazione di varianti a singolo nucleotide

La PCR bloccante di tipo selvatico seguita dal sequenziamento diretto offre un metodo di rilevamento altamente sensibile per le mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni.

Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.

Rilevamento e monitoraggio del DNA circolante associato al tumore nei biofluidi dei pazienti

Questo protocollo fornisce le fasi dall'estrazione del DNA al set-up sperimentale per la PCR a goccia digitale (ddPCR), compresa l'analisi per l'identificazione e la quantificazione di eventi di giunzione finale non omologa (NHEJ) nei siti bersaglio a seguito di scissione Cas9 indotta da gRNA e riparazione del DNA. Altri usi di questo metodo includono applicazioni come il rilevamento del polimorfismo e la verifica delle varianti di modifica genetica.

Digital-Droplet PCR per rilevare mutazioni di Indels in popolazioni di zanzare anofeline geneticamente modificate

Questo articolo introduce l'applicazione di un metodo di rilevamento a bassa frequenza basato sul sequenziamento Sanger nel linfoma angioimmunoblastico. Fornire una base per l'applicazione di questo metodo ad altre malattie.

PCR bloccante wild-type combinata con sequenziamento Sanger per il rilevamento di mutazioni somatiche a bassa frequenza

Qui presentiamo un protocollo per illustrare l'isolamento di cellule tumorali rare da un campione artificiale contenente sangue intero e con cellule di cancro ai polmoni. Il protocollo utilizza una piattaforma di isolamento cellulare semi-automatizzata, priva di etichette. Le cellule arricchite vengono successivamente analizzate per mutazioni dei recettori dei fattori di crescita epidermici tramite PCR digitale a gocciole.

Profilazione delle mutazioni del DNA del recettore del fattore di crescita epidermico nelle cellule rare circolanti utilizzando un sistema di isolamento cellulare e PCR digitale a gocce

Scopri il metodo drop-off ddPCR per la rilevazione simultanea di mutazioni multiple nel DNA tumorale circolante. Questa tecnica consente il profilo mutazionale con biopsia liquida in oncologia.

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot (Video) | JoVE Journal

Singola goccia digitale Polymerase Chain Reaction per rilevazione completa e simultanea delle mutazioni nelle regioni di Hotspot

Esplora altri video