Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG
7 gennaio 2019
Qui usiamo bioluminescenti, raggi x ed emissione di positroni tomografia/computato tomografia imaging per studiare l'attività come inibitore di mTOR urta i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in un modello dello xenotrapianto. Questo permette analisi fisiologicamente pertinenti, non invasivo e multimodale dell'effetto anti-mieloma di terapie designando i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in vivo.
Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave sul ruolo del micro-ambiente del midollo osseo e sulla sopravvivenza dei tumori del mieloma innestati. Il vantaggio principale di questa procedura è che può essere applicato a studi longitudinali anti-farmaci e utilizzato per saggiare più vie biochimiche in modo non invasivo. Il giorno dell'esperimento lavare per la prima volta le 8226 cellule trasfatte luciferasi tre volte in PBS ghiacciato a 200 RCF per cinque minuti per centrifigazione e rimescolare il pellet in PBS freddo ghiaccio fresco a cinque volte dieci al sesto cellule per 200 microlitri di PBS ghiacciato per topo.
Successivamente confermare una mancanza di risposta al dito del dito in un topo NOG anestetizzato di quattro o sei settimane e applicare un unguento oftalmico agli occhi dell'animale. Caricare le cellule in una siringa per insulina da un millilitro dotata di un ago calibro 26. Iniettare l'intero volume di cellule nella vena di coda dell'animale, prima di riportare il mouse nella sua gabbia, monitorando fino al pieno recupero.
Da dieci a venti giorni dopo la sfida, iniettare ogni animale innestato con 200 microlitri di substrato D-luciferina di grado in vivo in intraperitonealy salina sterile. Posizionare gli animali anestetizzati in posizione supina in un piccolo sistema di imaging animale entro 5-10 minuti dall'iniezione. Misurare la luminosità media in aree di interesse selezionate all'interno del software di imaging corrispondente.
Per una terapia mirata dei tumori della Luciferasi 8226, dopo aver misurato la bioluminescenza di base in ogni animale come appena dimostrato, randomizzare gli animali in gruppi di trattamento e trattare ogni topo con una serie di iniezione IP di 200 microlitri di Temsirolimus o un controllo salino. Misurare l'attività della Luciferasi due volte a settimana e tracciare i cambiamenti nella bioluminescenza nel tempo. Per misurare i cambiamenti nel metabolismo tumorale, rimuovere prima il cibo dalla gabbia domestica dei topi per 24 ore per evitare l'assorbimento di fludeossiglucosio non specifico in eccesso.
Il giorno successivo diluire da 500 a 100 microcuries di 18 sonda fludeossiglucosio radioetichettata fluoro in salina sterile ad un volume finale di 100 microlitri per topo e registrare il tempo e l'attività delle sonde con un calibratore di dose. Quando le sonde sono pronte, posizionare il primo animale anestetizzato su una pastiglia riscaldante con la testa rivolta verso l'interno e utilizzare una siringa per insulina da millilitro schermata dotata di un ago calibro 26 per iniettare 100 microlitri della sonda nella vena della coda. Misurare la radioattività residua nell'ago e nella siringa con il calibratore di dose e annotare l'attività e il tempo.
Quindi misurare l'attività del fludeossiglucosio radioetichettato in regioni selezionate di interesse che corrispondono ai tumori innestati in un piccolo sistema di imaging PET CT animale. Un'innesto tumorale del midollo osseo di successo può essere confermata dall'imaging a bioluminescenza come dimostrato. L'imaging seriale di più animali può essere utilizzato per visualizzare la distribuzione del midollo osseo innestato tumori multipli del mieloma.
Inoltre, l'analisi ottica dei raggi X mostra una determinazione rapida e non invasiva della posizione esatta e della distribuzione dei tumori multipli del mieloma all'interno dello scheletro del topo. La bioluminescenza prodotta da queste cellule tumorali innestati può essere misurata in modo seriale e non invasivo per valutare i cambiamenti nella crescita tumorale. Inoltre, la sopravvivenza dei topi trattati con l'inibitore mTOR Temsirolimus può essere monitorata e l'emissione di positroni e l'analisi tomografica computerizzata per l'assorbimento di fludeossiglucosio radioetichettato tumorale possono essere utilizzate per dimostrare i cambiamenti mediati del Temsirolimus nel metabolismo del glucosio.
Durante l'esecuzione di questa procedura è importante iniettare le celle IEV. Abbiamo scoperto che la mancata iniezione delle cellule nella vena provoca la formazione di cellule tumorali non innestati dal midollo vicino al sito di iniezione. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoistochimica e la micro-TC possono essere utilizzati per affrontare domande sull'impatto dei tumori sull'architettura ossea e sui componenti cellulari e molecolari non tumorali dell'ambiente del midollo.
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Panoramica
Questo studio utilizza l'imaging bioluminescente, a raggi X e mediante tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata per analizzare gli effetti dell'inibizione di mTOR su tumori del mieloma innestati nel midollo osseo in un modello di xenotrapianto. Questo approccio consente analisi non invasive e multimodali degli effetti terapeutici sui tumori del mieloma in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Oncoologia
- Immunologia
- Immagini biomediche
Sfondo
- L'ambiente microscopico del midollo osseo svolge un ruolo cruciale nella sopravvivenza del tumore.
- I tumori del mieloma possono essere trapiantati in modelli animali per lo studio.
- Le tecniche di imaging non invasive sono essenziali per studi longitudinali.
- Comprendere il ruolo di mTOR potrebbe portare a strategie terapeutiche migliori.
Scopo dello studio
- Valutare l'impatto dell'inibizione di mTOR sui tumori del mieloma.
- Esplorare l'influenza del midollo osseo sul comportamento tumorale.
- Sviluppare un metodo per studi longitudinali sugli anti-farmaci.
Metodi Utilizzati
- Imaging bioluminescente delle cellule di mieloma innestate.
- Imaging a raggi X per la visualizzazione anatomica.
- Tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata per la valutazione metabolica.
- Iniezione di cellule trasfettate con luciferasi in topi NOG.
Risultati principali
- L'inibizione dell'attività di mTOR ha mostrato effetti significativi sulla crescita del tumore.
- L'imaging non invasivo ha fornito informazioni sulle dinamiche tumorali.
- Studi longitudinali hanno rivelato il ruolo del microambiente del midollo osseo.
- La metodologia permette la valutazione di multipli vie biochimiche.
Conclusioni
- L'inibizione di mTOR può modificare efficacemente il comportamento del tumore del mieloma.
- L'imaging non invasivo è uno strumento potente per la ricerca sul cancro.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare le implicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo approccio di imaging multimodale consente una valutazione longitudinale e non invasiva della crescita tumorale e del metabolismo in un microambiente del midollo osseo fisiologicamente rilevante, affrontando una lacuna critica nei modelli preclinici di mieloma. Combinando letture bioluminescenti e PET/TC, il metodo supporta l'analisi meccanicistica e la riduzione del rischio dei candidati terapeutici mirati alle interazioni tumore-stroma. Fornisce una previsione affidabile nella validazione del bersaglio, collegando l'inibizione di mTOR a modifiche misurabili della bioluminescenza tumorale e del metabolismo del glucosio nel tempo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche misurando le variazioni della bioluminescenza tumorale come indicatore diretto della vitalità delle cellule di mieloma esprimenti luciferasi in vivo.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante imaging seriale non invasivo, riducendo la dipendenza dall’istologia terminale.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio correlando l’inibizione di mTOR con riduzioni sostenute del segnale tumorale, indicando il legame al bersaglio e la modulazione della via.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara modelli di xenotrapianto validati per lo screening di composti successivi, stabilendo il livello di base della bioluminescenza e del flusso metabolico nei tumori innestati.
- Risultati quantitativi: Genera metriche longitudinali di bioluminescenza e valori standardizzati di captazione (SUV) da PET/TC, consentendo analisi di risposta alla dose e nel tempo.
- Riutilizzo della piattaforma: Permette una valutazione scalabile di molteplici vie biochimiche durante cicli terapeutici senza dover sacrificare ripetutamente gli animali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella la nicchia del midollo osseo nel mieloma multiplo umano, in cui la sopravvivenza tumorale dipende da interazioni stromali non riprodotte in vitro.
- Continuità traslazionale: Collega la modulazione precoce del bersaglio (mediante BLI) a effetti metabolici successivi (mediante FDG-PET), supportando decisioni di avanzamento o interruzione basate su biomarcatori.
- Avanzamento proporzionato al rischio: Permette un monitoraggio longitudinale dell’impatto terapeutico, riducendo i fallimenti in fasi avanzate grazie alla conferma del meccanismo d’azione in un microambiente clinicamente rilevante.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto attivo, fornendo una validazione ortogonale dell'attività farmacologica in un sistema rilevante per la malattia.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando il carico tumorale e l'attività metabolica in risposta agli inibitori delle vie di segnalazione, chiarificando la dipendenza dal bersaglio nella nicchia del midollo osseo.
- Screening: Fornisce modelli pronti per i saggi con innesto riproducibile e segnale rilevabile, consentendo una valutazione affidabile dei composti in diversi punti temporali.
- Analisi: Offre letture a doppia modalità—bioluminescenza per il volume tumorale e FDG-PET per il flusso metabolico—permettendo ai team di distinguere tra effetti citostatici e citotossici.
- Ricerca traslazionale: Collega i precoci cambiamenti farmacodinamici a endpoint di efficacia preclinica, sostenendo la continuità dal meccanismo all'esito.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per la valutazione di bersagli dipendenti dallo stroma in diversi portafogli oncologici, massimizzando il ritorno sull'investimento nello sviluppo dei modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica correlando l'inibizione del bersaglio a modifiche contemporanee nella crescita tumorale e nel metabolismo del glucosio.
- Valore operativo: Standardizza la raccolta di dati longitudinali mediante protocolli di imaging riproducibili, riducendo la variabilità tra animali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo fornendo evidenze precoci e quantitative della modulazione tumorale mediata dal bersaglio, riducendo gli investimenti in candidati inefficaci.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei composti adeguata al rischio, basata sulla dimostrazione di un persistente legame al bersaglio in un modello con microambiente accurato.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella modellizzazione di xenotrapianti, nell'imaging bioluminescente e nell'uso e analisi di PET/TC su piccoli animali.
- È subordinato all'accesso a sistemi di imaging in grado di rilevare bioluminescenza e PET/TC, nonché a infrastrutture per la manipolazione di FDG radiomarcato e D-luciferina.
- Necessita di una standardizzazione congiunta tra i gruppi di farmacologia in vivo, imaging e analisi dei dati per garantire una selezione e quantificazione coerenti delle regioni di interesse.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende ad altri modelli tumorali, poiché l'efficienza di innesto e la stabilità del segnale possono variare a seconda della linea cellulare e del microambiente.
- I limiti pratici includono l'attenuazione del segnale da parte dei tessuti sovrapposti e la necessità di digiuno prima dell'iniezione di FDG per ridurre al minimo l'assorbimento non specifico, come indicato nel protocollo.
