L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e caratterizzare la struttura, la potenza olfattiva e la risposta comportamentale dei composti di feromone presunto di lamprede di mare.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia chimica, come l'identificazione dei feromoni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che collega nuovi composti alla funzione dei feromoni. Per iniziare questa procedura, metti 15-30 lamprede di mare maschi sessualmente maturi in una vasca alimentata con 250 litri di acqua aerata del Lago Huron, mantenuta a 16-18 gradi Celsius.

Per estrarre l'acqua condizionata mediante estrazione in fase solida, passarla dal serbatoio attraverso il sistema di pompaggio fino alla sommità della colonna. L'acqua passa attraverso un letto di due chilogrammi di resina polimerica a scambio ionico moderatamente polare contenuta in una serie di quattro colonne di vetro da un litro di capacità. Successivamente, rimuovere il solvente organico e raccogliere l'estratto mediante evaporazione rotativa per cinque ore a pressione ridotta a 40 gradi Celsius.

Per isolare i pool di frazione, immergere il gel di silice nella fase mobile iniziale per 30 minuti. Trasferire il gel con il solvente in una colonna di vetro e aprire la valvola per consentire il passaggio della fase mobile. Quindi, mescolare accuratamente gli estratti con gel di silice e caricarli nella colonna per cromatografia liquida sopra il letto di gel di silice.

Eluirli con un gradiente dal 95% di cloroformio a metanolo al 100% di metanolo, per un totale di 2,5 litri, quindi raccogliere l'eluente in singole fiale da 10 millilitri. Successivamente, eseguire l'esperimento TLC su piastre di gel di silice pre-rivestite applicando il campione sulla linea di partenza e immergendo la linea di partenza della piastra nel solvente di sviluppo in un serbatoio di vetro sigillato. Dopo che il solvente di sviluppo ha raggiunto la linea di finecorsa, estrarre la piastra dal serbatoio e attendere 10 minuti affinché il solvente evapori.

Visualizzare le macchie, prima sotto la luce UV a 254 nanometri, quindi colorare la lastra spruzzandola con una soluzione acida di metanolo al 5% di anisaldeide utilizzando uno spruzzatore per cromatografia e riscaldandola a 85 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, concentrare la frazione in un residuo mediante evaporazione rotativa a pressione ridotta a 40 gradi Celsius per circa 30 minuti. Per eseguire la registrazione EOG, riempire gli elettrodi capillari polari e i portaelettrodi allo stato solido, prefabbricati con pellet di cloruro d'argento-argento, con cloruro di potassio a tre molari utilizzando una micropipetta.

Quindi, inserire gli elettrodi polari nei portaelettrodi. Successivamente, preparare 100 millilitri di L-arginina da 10 a meno cinque molari in acqua filtrata a carbone da una soluzione madre di L-arginina da 10 a meno due molari in acqua deionizzata in un matraccio tarato. Per la curva concentrazione-risposta, preparare 10 millilitri di diluizioni di 10 volte dei pool di frazioni.

Ora, orienta una lampreda anestetizzata in un supporto a forma di V e avvolgila con un tovagliolo di carta bagnato per evitare che si secchi. Inserire un tubo di acqua aerata a ricircolo contenente 50 milligrammi per litro di MS222 nella cavità buccale. Regolare la portata e assicurarsi che l'acqua esca attraverso le aperture branchiali per irrigare continuamente le branchie.

Sciacquare il tubo di mandata dell'odorizzante con acqua filtrata e collegarlo alla valvola montata su un micromanipolatore. Quindi, posizionare il tubo capillare di erogazione dell'odorizzante nella cavità dell'epitelio olfattivo per erogare acqua filtrata all'epitelio olfattivo per prevenire l'essiccazione quando non si somministrano odorizzanti. Quindi, montare gli elettrodi di registrazione e di riferimento sui micromanipolatori.

Abbassare l'elettrodo di riferimento sulla pelle esterna vicino alle narici. Utilizzando il microscopio stereoscopico, abbassare l'elettrodo di registrazione fino a toccare appena la superficie dell'epitelio olfattivo. Successivamente, trasferire l'assorbimento del tubo di erogazione dell'odorizzante dall'acqua filtrata di fondo alla soluzione di L-arginina da 10 a meno cinque molari.

Accendi il computer, l'amplificatore, il filtro e il digitalizzatore. Utilizzando il software del driver della valvola, programmare la procedura per somministrare un singolo impulso di quattro secondi di odorizzante selezionando la casella di T1, impostando T su quattro secondi e selezionando la casella di T2.In il software di acquisizione dati, impostando la modalità di acquisizione su un oscilloscopio ad alta velocità. Fare clic sull'icona Riproduci, quindi fare clic su Avvia nel driver della valvola per attivare l'impulso dell'odore.

Inizia a registrare il controllo del bianco, la L-arginina, e poi gli odoranti da basse ad alte concentrazioni con un lavaggio di due minuti di acqua filtrata tra un'applicazione e l'altra. Per identificare le frazioni comportamentali attive, acclimatare la femmina di lampreda di mare sessualmente matura nella gabbia di rilascio nel labirinto per cinque minuti. Rilasciare la lampreda di mare e registrare la quantità cumulativa di tempo che la lampreda trascorre nel canale sperimentale e nel canale di controllo, ciascuno contenente acqua di fiume, per 10 minuti.

Successivamente, applicare lo stimolo di prova al canale sperimentale assegnato in modo casuale nel veicolo al canale di controllo utilizzando pompe peristaltiche a velocità costanti di 200 millilitri al minuto per cinque minuti, quindi applicare lo stimolo di prova nel veicolo per altri 10 minuti e registrare la quantità cumulativa di tempo che la lampreda trascorre nei canali sperimentale e di controllo. In questa procedura, purificare ulteriormente le frazioni attive in composti con cromatografia ad esclusione dimensionale utilizzando una colonna sephadex LH-20. Preparare il campione in 0,5 millilitri della fase mobile iniziale, caricandolo nella colonna cloroformio-metanolo e poi nella colonna metanolo, ed eluire le frazioni attive per ottenere il composto.

Sciogliere e diluire il composto purificato nella fase mobile iniziale dell'HPLC per formare una soluzione da 10 microlitri di circa un microgrammo per millilitro. Quindi, trasferire la soluzione campione nelle fiale HPLC e inserirle nell'autocampionatore di HPLC. Iniettare il campione nella spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray e registrare gli spettri di spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray ad alta risoluzione utilizzando uno spettrometro di massa cromatografico.

Sciogliere completamente il campione nei solventi deuterati selezionati per formare una soluzione con una concentrazione compresa tra 0,1 e 10 milligrammi per millilitro circa. Trasferire la soluzione del campione in un tubo NMR per registrare gli spettri NMR 1D e 2D su uno spettrometro NMR da 900 megahertz. Qui è mostrato uno spettrometro NMR da 600 megahertz.

Sono stati identificati cinque nuovi feromoni putativi di lampreda di mare e le loro strutture sono state chiarite con metodi spettrometrici e spettroscopici. Questi feromoni putativi erano stimolatori per l'epitelio olfattivo della lampreda di mare adulta e avevano basse soglie di rilevamento nelle registrazioni dell'elettro-olfattogramma. Nei saggi comportamentali del labirinto a due scelte, le femmine di lampreda di mare ovulate sono state attratte dalla petromyzone A, dal petromyzene A e dal petromyzene B e respinte dalla petromyzone C.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la cristallografia a raggi X e le reazioni di derivatizzazione per rispondere a ulteriori domande come la stereochimica dei composti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei prodotti naturali e della neuroetologia per esplorare la biosintesi plausibile e la funzione biologica dei feromoni negli organismi acquatici come la lampreda di mare. Non dimenticare che lavorare con il cloroformio può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come lavorare nel cappuccio chimico, indossare guanti e occhiali di sicurezza, dovrebbero essere sempre prese durante la manipolazione di questo reagente.