Codifica genetica di un aminoacido Non-canonica per la generazione di anticorpo-farmaco coniugati attraverso una reazione di Bioorthogonal veloce

Questo metodo fornisce uno strumento importante nel campo della modifica delle proteine, consentendo la generazione facile ed efficiente di coniugati di farmaci anticorpali. I principali vantaggi di questa tecnica sono la facilità di manipolazione, l'elevata resa della produzione di anticorpi, la velocità della reazione di psicodisione e la stabilità del collegamento formato. Iniziare questa procedura con celle di sospensione HEK in crescita come descritto nel protocollo di testo.

Quando viene raggiunta la densità di 2,5 milioni di cellule per millilitro, preparare una nuova soluzione del derivato del ciclopropene della litina, o CpK, in 1 idrossido di sodio molare. Aggiungere 2,5 millilitri di CpK al mezzo di espressione integrato con antibiotici. Mescolare bene la soluzione e aggiungere 250 microlitri di un HCl molare, quindi sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 22 micron.

Ora centrifuga 125 milioni di cellule alla densità target per cinque minuti a 500 x g. Dopo la centrifugazione, aggiungere la miscela di reagente dna-trasfezione al mezzo di espressione contenente CpK e utilizzare questo mezzo per rimosombiare le cellule. Da sei a sette giorni dopo l'aggiunta di CpK, raccogliere il trastuzumab recante anticorpi CpK dal supernatante centrifugando le cellule per 15 minuti a 3.000 x g.

Quindi, filtra il supernatante. Ora aggiungi un tampone di lavaggio perline 5x in tubi conici da 250 millilitri e mescola con il supernatante e aggiungi la resina A proteica preequilibrata. Posizionare il tubo conico su un rullo per tre ore a temperatura ambiente per tirare giù l'anticorpo e il supernatante.

Dopo l'incubazione, trasferire la resina A con il supernatante in una colonna e lasciare che il liquido flui. Quindi aggiungere 25 millilitri di tampone di lavaggio e lasciare che flui. Aggiungere un millilitro di un tampone di fosfato molare, 150 millimolare cloruro di sodio al tubo di raccolta ed elutare l'anticorpo con quattro millilitri di 1 citrato di sodio molare pH 3.

La soluzione acida viene immediatamente neutralizzata in quanto esce dalla colonna dalla soluzione di base già presente nel tubo di raccolta. Successivamente, diluire l'anticorpo con 10 millilitri di PBS. Concentrare l'anticorpo su 5 a un millilitri mediante filtrazione centrifuga e scambiare il tampone tre volte con PBS.

Purificare i campioni da FPLC utilizzando una colonna di interazione idrofobica butile con gradiente da zero al 100% di tampone di sale basso in tampone di sale alto per 30 minuti. Raccogli tutte le frazioni e monitora l'eluizione a 280 nanometri. Concentrare le frazioni che contengono anticorpi mediante filtrazione centrifuga e scambiare il tampone tre volte con PBS.

L'anticorpo può quindi essere conservato a quattro gradi Celsius. La monometil auristatina E, o MMAE, è altamente tossica. Pertanto, utilizzare guanti e occhiali quando si maneggiano derivati MMAE.

Se si utilizza MMAE non modificato come controllo, maneggiare il prodotto solido all'interno di una cappa aspirante durante la preparazione della soluzione di scorta nell'MSO. Per coniugare l'anticorpo con la molecola portante di tetrazina, diluire 10 equivalenza molare di tetrazina MMAE per anticorpo con 20 microlitridi di acetonitrile e 76 microlitri di PBS in un piccolo tubo conico. Aggiungere un equivalente molare di trastuzumab recante CPK.

Mescolare accuratamente e lasciare reagire per tre ore a temperatura ambiente per formare trastuzumab collegato a MMAE. Molecole diverse da MMAE potenzialmente più grandi e più stericamente ostacolate possono essere collegate all'anticorpo usando questo protocollo. Aggiungere l'intero volume della reazione sulla colonna di spin e centrifugare a 1500 x g per un minuto.

Per analizzare il coniugato, equilibrare la colonna HPLC HIC con un buffer di sale alto al 100% per cinque minuti. Quindi mescolare 15 microlitri di una soluzione millilitro per millilitro di trastuzumab collegata a MMAE con 15 microlitri di tampone di sale alto 2 volte in una fiala. Iniettare la miscela sulla colonna HPLC.

Elute in un flusso isocratico di un millilitro al minuto con tampone di sale alto al 100% per un minuto. Segui questo con un gradiente di 15 minuti dal 100 allo zero percento di tampone di sale alto in tampone di sale basso. Monitorare l'eluizione a 280 nanometri.

Integrare i picchi sul cromatogramma con tempi di ritenzione di 7,5, 9,2 e 11,5 minuti, che corrispondono rispettivamente a trastuzumab con zero, una e due tossine coniugate. Ora, calcola il DAR sommando le aree dei picchi a 9,2 minuti, che ha un peso di uno, e 10,5 minuti, che ha un peso di due, e dividi per l'area totale dei tre picchi. Per analizzare il coniugato da LC-MS, in primo luogo, deglicosilato 30 microlitri di un milligrammo per millilitro ADC e l'anticorpo non modificato in condizioni non riducenti utilizzando 250 unità di PNGase F per almeno sei ore a 37 gradi Celsius.

Scongelare il siero e filtrarlo attraverso un filtro da 22 micron. Quindi riempire i pozzi esterni di una piastra da 96 pozza d'acqua. Nei pozzi centrali, mescolare in triplice copia 90 microlitri di siero con 10 microlitri di un milligrammo per millilitro trastuzumab tetrametillrhodamina in PBS ad una concentrazione finale di 1 milligrammo per millilitro.

Posizionare la piastra in un'incubatrice satura di umidità a 37 gradi Celsius e al 4% di CO2. Ogni 24 ore per cinque giorni, pipettare accuratamente ciascuno per mescolare e prendere un'aliquota di cinque microliter. Flash congelare l'aliquota con azoto liquido e conservare a 80 gradi Celsius.

Una volta raccolti tutti i campioni, scongelare le aliquote e analizzarle utilizzando un ELISA indiretto, come descritto nel protocollo di testo. In alternativa, un kit ELISA commerciale può essere utilizzato per misurare la concentrazione dell'ADC. Due giorni prima del test, riempire i pozzi esterni di una piastra di 96 po 'd'acqua.

Quindi sollevare le celle con 05% di tripside in EDTA da 5 millimolari. Centrifugare le cellule tre minuti a 250 x g e rimosodire in un nuovo mezzo. Quindi seminare 3.000 cellule in 100 microlitri per pozzo in 96 piastre di pozzo e rimetterli nell'incubatrice.

Due giorni dopo la semina delle cellule, preparare le diluizioni seriali di tutti i campioni in triplice copia con 1%DMSO in mezzo completo. Ora aggiungete 100 microlitri di ogni campione in ogni pozzo e incubate per cinque giorni a 37 gradi Celsius e al 4% di CO2. Il quinto giorno, misura la vitalità cellulare.

A tal fine, utilizzare un kit commerciale per liscire le celle e misurare l'ATP rilasciato. Tracciare la percentuale di segnale rispetto alle celle di controllo trattate con 1%DMSO. Gli ADC possono essere incubati a 37 gradi Celsius per cinque giorni nel siero e saggiati per la citotossicità per dimostrare la stabilità funzionale.

Un anticorpo con un manico di ciclopropene può essere ottenuto utilizzando questa procedura con rese superiori a 20 milligrammi per litro dopo la purificazione della proteina A. L'anticorpo prodotto può essere coniugato rapidamente e specificamente in loco ad una tossina recante una tetrazina. Dopo la coniugazione dell'anticorpo con una tossina, i rapporti medi farmaco-anticorpo sono superiori a 1,9, come misurato dalla cromatografia di interazione idrofobica.

L'identità dell'ADC è confermata dalla spettrometria di massa. Il legame diidropiridizene generato è stabile nel siero umano per oltre cinque giorni a 37 gradi Celsius. Il coniugato del farmaco anticorpale è potente e uccide selettivamente le cellule con alti livelli di HER2, piuttosto che le cellule con bassi livelli di HER2.

Inoltre, l'anticorpo senza la tossina e la tossina modificati con il linker tetrazina hanno una tossicità molto bassa. La sola tossina mostra una tossicità non dipendente da HER2 che evidenzia la necessità di mirare per raggiungere la selettività. Seguendo questa procedura, possiamo preparare in modo rapido ed efficiente coniugati di farmaci anticorpali per il trattamento dei tumori.

Potenzialmente, qualsiasi farmaco funzionalizzato con una tetrazina può essere collegato a qualsiasi anticorpo che prende di mira un biomarcatore di cellule tumorali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a qualsiasi coniugato proteico destinato alla terapia o alla diagnosi.