Name: Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Scopri un metodo per indurre abrasioni corneali nel topo usando una fresa oculare e soluzione di fluoresceina. Questa tecnica permette di studiare i meccanismi cellulari e molecolari della guarigione delle ferite epiteliali corneali in vivo.

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Vorremmo ringraziare Kaisa Ikkala per la sua preziosa assistenza tecnica e aiuto perspicace quando sta attuando questo metodo e anche più tardi durante l'attuazione alle nostre domande di ricerca centrale. Vorremmo anche ringraziare il laboratorio Animal Center e Anna Meller per aiutarla con le linee guida del lavoro veterinario di pianificazione.

Tutti gli esperimenti sono approvati dal Consiglio nazionale esperimento sugli animali.
1. preparati
<ol><li>Tutte le soluzioni di preparare e tenere a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Seguire le normative sullo smaltimento dei rifiuti per dispose utilizzato materiali e soluzioni.</li>
	<li>Uso NMRI e ICR esogami scorte, fra 4-12 settimane di età e di entrambi i sessi. Se si utilizza il ceppo C57BL/6, seguire il metodo di preparazione di ketamina-medetomidina nel passaggio 1.3.2. Per altre fasi, seguire le istruzioni descritte in 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Preparare la medicina veterinaria fresco e in tempo prima di iniziare l'operazione. Carprofen verrà utilizzato in seguito, quindi non è necessario prepararlo a questo punto.<ol>
<li>Per preparare una soluzione di ketamina-medetomidina per anestesia, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina (Ketaminol Vet) con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina (Cepetor Vet) e aggiungere 1,25 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).</li>
		<li>Per preparare una soluzione più diluita di ketamina-medetomidina per anestesia su topi C57BL/6, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina e aggiungere 2,5 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (3,75 mg/kg, ketamina e 0,5 mg/kg, medetomidina). Nota: Questo è un passo alternativo, solo per topi C57BL/6 adulti.</li>
		<li>Per preparare buprenorfin per analgesia, aggiungere 0,1 mL (stock concentrazione 0,3 mg/mL) di buprenorfin a 1,9 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse di 0,2 mL/20 g (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Per preparare atipamezolo interrompendo l'anestesia, aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 5 mg/mL) di atipamezolo a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse 0,15 mL/20 g (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Per analgesia durante la post-anestesia utilizzare carprofen. Aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di carprofen a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare soluzione colorante fluorescente<ol>
<li>Per visualizzare l'abrasione sotto la luce blu cobalto (Figura 1), utilizzare una soluzione fluorescente. Preparare una soluzione di fluorescina di 0,1% di prima misura 10 mg di sale della fluorescina con una scala fine e quindi aggiungerlo a 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteggere la soluzione di fluorescina da luce e agitare per 5 minuti su un agitatore. Nota: La soluzione di fluorescina è sensibile alla luce; mantenere la soluzione coperta dalla luce. Questa soluzione può essere conservata a + 4 ° C per 2-3 giorni. Per l'uso, è utile posizionare la soluzione della fluorescina in una bottiglia contagocce che viene utilizzata per collirio. Utilizzare un filtro sterile-quando si sposta la soluzione per il flacone con contagocce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire la punta di burr oculare prima e dopo l'uso; prima con PBS e poi con 70% EtOH. Se effettua un'abrasione ai topi diversi durante la stessa operazione, eseguire le fasi di pulizia tra ogni mouse.</li>
	<li>Mettere la piastra riscaldata su (+ 37 ° C) e posizionare un asciugamano di carta su di esso.</li>
</ol>2. corneale abrasione
Attenzione: Utilizzare abiti protettivi (guanti, camice da laboratorio) quando movimentazione topi. Pesare il mouse per stimare il volume di farmaco da somministrare.
<ol><li>Utilizzare il metodo scruffing con una sola mano per gestire il mouse23. Somministrare la miscela di ketamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) all'addome inferiore sinistra. Posizionare il mouse a una gabbia individuale e aspettare che si addormenti. Questo richiede in genere meno di 5 minuti. Quindi, amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione. Nota: Una volta che l'anestesia è dato, il protocollo non dovrebbe essere sospesa in qualsiasi momento.</li>
	<li>Prima di continuare, verificare che la piastra sia calda. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piastra riscaldata. Il livello di anestesia è buono se il riflesso di coda è assente, ma il riflesso di punta è presente. Controllare questi riflessi pizzicando la coda e qualsiasi punta con le dita o pinze. Non applicare una forza eccessiva. L'anestesia sarà di 20-25 minuti.</li>
	<li>Per rendere un'abrasione, utilizzare la bava oculare pulita. Ruotare la base della bava per attivare la vibrazione che è essenziale per rendere l'abrasione. Sentite la vibrazione in mano, quando la bava sta funzionando correttamente.<ol>
<li>Aprire un occhio alla volta tenendo le palpebre separatamente con le dita. Quindi saldamente toccare la bava alla cornea e muoversi avanti e indietro anche lo strumento come lateralmente sulla superficie oculare. La vibrazione della bava si esibirà il gratta e Vinci; non premere, scuotere o strappare la cornea. Nella cornea centrale, 20 movimenti sulla superficie di abrasione sono sufficienti per indurre la ferita. Non sollevare la bava e cercare di rimanere nella regione di cornea per essere abrasa. L'acquisizione di un'abrasione dimensioni standard richiederà diversi giri di pratica.</li>
	</ol>
 Nota: Asepsi corneale possono essere ottenuto prima all'abrasione utilizzando betadine soluzione oftalmica.</li>
</ol>3. l'abrasione di imaging
<ol><li>Illuminare l'area abrasa utilizzando blu cobalto penna luce (Figura 1) e soluzione di fluorescina. La superficie oculare appare incolore in luce ambiente. Dopo l'applicazione della fluorescina, regione abrasa reagisce in verde quando illuminando l'occhio con la penna luminosa.<ol>
<li>Se necessario, aprire l'occhio abrasa similmente come 2.3 e amministrare una goccia della soluzione di fluorescina dal flacone con contagocce. Lavare l'occhio una volta con PBS o 0,9% NaCl per ridurre di fondo della fluoresceina. Utilizzare un contagocce o una pipetta per il lavaggio. Aspirare il liquido via con un panno morbido e pulire le ciglia, se necessario. Il liquido in eccesso si raccoglie solitamente al bordo nasale dell'occhio, vicino all'apertura del canale lacrima. Attenzione: Evitare di toccare la cornea mentre cleaining abrasioni minori potrebbero essere indotti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scattare foto dell'abrasione cornea.<ol>
<li>Per ottenere immagini simili durante ogni sessione di imaging, è possibile utilizzare strumenti di attacco costante per la luce di penna blu cobalto e la fotocamera reflex (Figura 2). Questo protocollo fornisce un programma di installazione che è facile da ripetere (Figura 2).<ol>
<li>Per collegare la penna illuminante e la fotocamera, utilizzare una lampada da tavolo con un braccio flessibile e morsetto e braccio regolabile per una telecamera con un morsetto, rispettivamente. Fascetta di penna ottica per la lampada da tavolo e la posizione appena sopra l'occhio del mouse. Posizionamento la luce in modo diverso potrebbe alterare la visualizzazione dell'abrasione. Un suggerimento per il posizionamento di questi strumenti è descritto nella Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare la fotocamera reflex per scattare foto dell'occhio. Metti l'animale in una distanza desiderata e la posizione e la messa a fuoco della fotocamera (01:12) in luce ambiente. Dopo di che, chiudere tutte le altre luci tranne la luce di penna blu cobalto. Nota: L'impugnatura della penna luce del nastro verso il basso o utilizzare un elastico per tenere la luce accesa tutto il tempo durante la formazione immagine. Questo potrebbe aiutare se l'immagine diventa sfocata. È più semplice di eseguire il passaggio di imaging con un collega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. svegliarsi dopo abrasione corneale
<ol><li>Amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione come in 2.1.</li>
	<li>Mettere una goccia di unguento acido occhio fucidin antibatterico, (Isathal) agli occhi sia abrasi e non-raspato per idratare e mantenere la superficie oculare pulito da batteri dopo l'anestesia.</li>
	<li>Come il mouse si sveglierà in 5-20 minuti sulla piastra riscaldata, osservare il mouse durante il periodo di risveglio post-anestetico. Quando diventa mobile, posto in una gabbia individuale. Nota: Se svegliarsi richiede più tempo, posizionare il mouse nella gabbia con un pad riscaldato o collocare l'intera gabbia sulla piastra riscaldata e monitorare regolarmente il mouse. Mentre l'anestesia svanisce, il mouse in genere scuote e raggiunge verso l'alto con il corpo anteriore. Questo comportamento dovrebbe tornare alla normalità in 3-4 ore e quindi è possibile inserire il mouse indietro per una gabbia condivisa.</li>
	<li>Amministrare il carprofen i.p. per analgesia e occhio unguento per due giorni consecutivi dopo l'abrasione, similmente come in passaggi 2.2. e 4.2.</li>
</ol>5. imaging durante la guarigione della ferita
<ol><li>In questo protocollo, tempo di utilizzo punti 18 e 72 h dopo abrasione ad osservare la chiusura della ferita.<ol>
<li>Per l'imaging consecutivi, anestetizzare i topi come spiegato al punto 2.2.</li>
		<li>Scattare foto come spiegato in 3.</li>
		<li>Sveglia gli animali con atipamezolo i.p. e monitorare il periodo di risveglio, come spiegato al punto 4.3. Nota: se non continuando il follow-up, eutanasia il mouse subito dopo 5.1.2. L'eutanasia è descritto in 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. cornea insieme e inclusione in paraffina
<ol><li>Dopo l'ultimo punto di tempo, il sacrificio dell'animale. Posizionare il mouse in una camera che può essere riempita con CO2. Riempiono l'aria di camera di CO2. Quando l'animale è immobile, slogare vertebre cervicali tirando con forza dalla base della coda e premendo la regione del collo verso il basso allo stesso tempo. Attenzione: Seguire sempre le linee guida del corpo locale benessere degli animali.</li>
	<li>Raccogliere l'intero bulbo oculare dal taglio di un'apertura nella pelle al lato dell'occhio con le forbici di dissezione. Mettere le forbici sotto il bulbo oculare e tagliare il nervo oculare per far comparire il bulbo oculare fuori orbita. Utilizzare pinze se l'occhio non esce facilmente.<ol>
<li>Fare un foro sulla parte posteriore dell'occhio, sul lato della retina, con un ago da 26G per consentire la penetrazione gratuito delle soluzioni all'interno dell'occhio. Nota: Non lasciare che l'occhio diventa secca, invece, posto in PBS fino continuando con il protocollo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere il bulbo oculare in una provetta da 2 mL con PBS. Non mettere in pausa l'esperimento a questo punto.</li>
	<li>Rimuovere PBS e difficoltà bulbi oculari in paraformaldeide al 4% (PFA) a + 4 ° C per 4-5 ore.</li>
	<li>Spostare il bulbo oculare fisso su una videocassetta di tessuto per l'elaborazione del tessuto. Utilizzare un tessuto lavorazione macchina e il seguente programma:<ol>
<li>Risciacquare con PBS.</li>
		<li>Incubare 2 x 45 min in etanolo al 70% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 2 x 1 h in etanolo al 94% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 3 x 45 min in etanolo assoluto a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 3 x 1 h in xilene, a temperatura ambiente e ultimo xilene a 37 ° C.</li>
		<li>Incubare 3 x 1 h in cera di paraffina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la lavorazione del tessuto, incorporare il bulbo oculare in paraffina liquida (+ 60 ° C) utilizzando un blocco di incorporamento del tessuto. Posto l'occhio all'interno del blocco in modo che esso sta osservando obliquamente e il bordo periferico è rivolto verso l'alto. Lasciate che il blocco solidificare su una piastra fredda per 5-10 minuti.</li>
</ol>7. paraffina sezioni della Cornea
<ol><li>Preparare il microtomo per il sezionamento secondo le istruzioni dell'istituzione o del produttore. Attenzione: Fare attenzione a maneggiare la lama tagliente del microtomo.</li>
	<li>Posto un bagnomaria con acqua ultrapura a temperatura ambiente al lato del microtomo e l'altra con acqua ultrapura riscaldata a + 50 ° C.</li>
	<li>Fare 5 µm spessore sezioni del bulbo oculare. Nota: La lente si rompe facilmente durante il sezionamento. Per evitare questo, pulire la superficie di taglio con un tessuto umido ogni volta che viene avviata una nuova fila di sezioni. Usare acqua di rubinetto per inumidire il tessuto.</li>
	<li>Inserire le sezioni accanto a altro nel bagno d'acqua temperatura ambiente e quindi spostarli la vasca di acqua calda con l'aiuto di un vetrino. Allungare le sezioni nel bagno acqua calda fino a quando tutte le pieghe e rilassarsi e il mascherino sezioni diventano.</li>
	<li>Asciugare i vetrini con le sezioni durante la notte a + 37 ° C.</li>
	<li>Collegare le sezioni per le diapositive tenendo il vetrino per 1 minuto su un piatto riscaldato a + 60 ° C. Dopo questo, le sezioni possono essere direttamente trattate per immunohistological metodi di colorazione, o conservate a + 4 ° C.</li>
</ol>

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<li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL%2F6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital%2C+ketamine+and+nitrous+oxide%2C+but+not+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K14+%2B+Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li>
<li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP9+cleavage+of+the+%CE%B24+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Metodi di ferimento sono popolari strumenti per studiare diversi aspetti dell'omeostasi cornea e patologie. Il modello di abrasione offre un metodo ben controllato per risolvere problemi rilevanti in Oftalmologia. Tuttavia, alcuni punti critici nel protocollo sono la pena sottolineare. In particolare, i dettagli descritti per quanto riguarda la medicina veterinaria, timeline di guarigione della ferita ed il risultato sono ottimizzati per l'uso con le scorte nazionali di NMRI e ICR, ma possono variare tra i ceppi di topi<...

Strati epiteliali di numerosi organi sono esposti alle lesioni. Tuttavia, essi contengono anche la capacità di compensare la perdita di tessuto attraverso la guarigione della ferita. La cornea offre un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. Forma la superficie esterna dell'occhio e fornisce uno strato protettivo per il macchinario di oculare sensibile. In tal modo, cornea funziona come una barriera fisica per gli agenti patogeni e perdita di acqua. Si compone di tre strati; epitelio, stroma ed endotelio. L'epitelio della cornea costituisce lo strato più esterno della cornea. Cellule epiteliali mantengono la funzione di barriera della cornea aderendo strettamente tra loro attraverso giunzioni strette1,2,3. Una acellular della membrana dello scantinato cornea, membrana di Bowman, separa l'epitelio dallo stroma esteso, che contiene keratocytes refrattario. Sotto lo stroma, cellule endoteliali canale nutrienti, acqua e ossigeno allo strato superiore.
Abrasioni corneali sono molto comuni in clinica4. Lesioni alla cornea sono diverse, ma in gran parte sono causate da particelle piccole come polvere o sabbia, graffi o altri corpi estranei. Il protocollo qui descritto mira a riprodurre un tipo clinicamente rilevante di abrasione corneale epiteliale. In tal modo, questo protocollo fornisce un metodo controllabile e seminale per i medici e gli scienziati corneali implementare i propri studi. Abbiamo eseguito un test di riparazione del pregiudizio in vivo sulla cornea Murina da abrasione del tessuto con una bava oculare offuscato, il Algerbrush II. Qui, ci rivolgiamo l'abrasione solo all'epitelio cornea centrale e lasciare le altre parti dell'organo senza danni. Così, il protocollo è ideale per studio delle cellule epiteliali corneali dynamics o la membrana dello scantinato durante riepitelizzazione, cell migrazione, proliferazione e differenziamento in vivo5. Recentemente, questo modello è stato utilizzato per analizzare le dinamiche di cellule progenitrici nella cornea murina pure quanto a svelare la capacità delle cellule epiteliali corneale differenziate nel ristabilire la nicchia delle cellule staminali corneali dopo lesioni6,7. Dopo abrasione, la cornea torna alla sua normale trasparenza e resistenza alla trazione. Interessante, uno studio in vitro hanno indicato che riepitelizzazione avviene senza cellula aumentata proliferazione8. Questo protocollo descrive la sequenza temporale di guarigione senza interruzioni nella cornea murina. Il metodo è così applicabile per testare l'effetto delle droghe sulla guarigione modelli e velocità.
La cornea è stato ampiamente utilizzata per studi di cicatrizzazione. Tuttavia, molti studi hanno fatto affidamento su altri modelli della ferita. Un modello ben consolidato della lesione corneale è l'ustione alcalina che viene eseguita mediante l'applicazione di idrossido di sodio (NaOH) con o senza filtro di carta sulla superficie corneale9. L'esposizione alcalina provoca una ferita grande e diffusa che colpisce non solo l'epitelio corneale, ma anche la congiuntiva e lo stroma9,10. Soluzioni fortemente alcaline hanno dimostrati di indurre ulcere corneali, opacification e neovascolarizzazione9. Cellule infiammatorie invadono lo stroma in genere entro 6 ore e vi rimangono fino a 24 h11. Così, la ferita alcalina è un metodo consigliabile negli studi relazionati all'attivazione stromal. Un altro tipo di ferita chimica può essere inflitto applicando solfossido dimetilico (DMSO) sulla cornea9,10. Altri modelli di lesione comunemente usati includono ferite incisionale che penetrano attraverso le ferite keratectomy e stroma, che sono limitate alla parte superiore del stroma14,15. Questi metodi sono anche utili per rispondere a domande riguardanti la guarigione della ferita stromal. Modelli di diverse lesioni hanno i loro vantaggi e svantaggi. Abrasione o sbrigliamento, dell'epitelio corneale è stato sviluppato utilizzando offuscati bisturi o lame su ex vivo cornee16. Questo metodo è stato successivamente utilizzato in vivo sul topo, ratto e coniglio17,18,19,20,21,22. Utilizzando la bava oculare (Figura 1), togliamo solo un'area selezionata dell'epitelio, lasciando inalterato il resto dell'epitelio. In questo modo, è possibile indirizzare con precisione la rimozione epiteliale in diverse parti della cornea. Inoltre, la dimensione di abrasione è valutabile con la macchiatura della fluorescina. Inoltre, qui seguiamo chiusura abrasione durante il periodo di guarigione.
Questo metodo presenta diversi vantaggi, i) tra cui precisa posizione del sito di abrasione, che non è possibile con ferita chimica, ii) l'abrasione è veloce da eseguire, e iii) è non invasivo. Qui, descriviamo il metodo utilizzando il mouse NMRI nazionali come un modello, tuttavia questo potrebbe essere applicato per la vasta gamma di modelli genetici murini, così come per il ratto e coniglio, che sono comuni modelli usati per studiare la rottura cornea umana.

<table><tbody><tr><td>NMRI mouse</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td></td><td></td><td>uso sterile</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Nome di mercato: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Nome di mercato: Ketaminol</td></tr><tr><td>Vet Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Nome di mercato: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Nome di mercato: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Nome di mercato: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% fucidina acido unguento per gli occhi</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Nome di mercato: Isathal</td></tr><tr><td>Sale di fluoresceina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina</td><td></td><td></td> tamponata con fosfato <td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii bava oculare ( 0,5 mm punta)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Cobalto Blu penna luce</td><td>SP Servizi</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera reflex digitale</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Braccio e morsetto per fotocamera regolabili</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Altezza 28 cm</td></tr><tr><td>Lampada da tavolo con braccio flessibile e morsetto</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salvietta morbida</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr>Camera <td></td><td></td><td></td><td>di CO2</td></tr><tr><td>Set di strumenti di dissezione</td><td>Strumenti</td> per la scienza <td></td><td></td></tr><tr><td>fine Siringhe</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G Beckton</td><td>Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tubo</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per tessuti</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per la lavorazione dei tessuti ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Cera di paraffina</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per inclusione di tessuti 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria per sezionamento</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria per sezionamento</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Lama per microtomo</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino</td><td>Th.Geyer GmbH & Co.</td><td>7.695.019</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>MilliQ Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare burr come un modello per cornea

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

La cornea murina fornisce un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. La cornea è lo strato più esterno dell'occhio e così è la prima difesa per infortunio. Infatti, il tipo più comune di lesioni oculari trovati nella clinica è un'abrasione cornea. Qui, utilizziamo un oculare burr per indurre un'abrasione conseguente rimozione dello epitelio corneale in vivo sui topi anestetizzati. Questo metodo consente per rottura epiteliale mirata e riproducibile, lasciando altre aree intatte. In più, descriviamo la visualizzazione dell'epitelio abrasa con la macchiatura della fluorescina e fornire consigli concreti su come visualizzare la cornea abrasa. Quindi, seguiamo la linea temporale di guarigione delle ferite 0, 18 e 72 h dopo abrasione, fino a quando la ferita è re-epithelialized. Il modello di abrasione epiteliale della lesione corneale è ideale per gli studi sulla riepitelizzazione degli strati corneali, la migrazione e la proliferazione delle cellule epiteliali. Tuttavia, questo metodo non è ottimo per studiare l'attivazione stromal durante la guarigione delle ferite, perché la bava oculare non penetrano negli strati di cellule stromali. Questo metodo è anche adatto per applicazioni cliniche, ad esempio, i test pre-clinici di efficacia del farmaco.

Questo protocollo descrive un modello per infliggere un danno all'abrasione alla cornea del mouse e suggerisce come seguire e visualizzare il processo di guarigione dopo abrasione. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo delle cellule progenitrici epiteliali corneali durante6di cicatrizzazione. L'uso di strumenti consolidati è la chiave per un esperimento di successo all'abrasione. Noi ed altri, abbiamo utilizzato la bava oculare di Algerbru...

Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative ai meccanismi cellulari e molecolari coinvolti durante la guarigione della ferita corneale. Un vantaggio di questa tecnica è che riflette le situazioni in pronto soccorso in caso di inserto corneale, ovvero abrasione o graffio sulla superficie dell'occhio. Ho avuto l'idea di questo metodo quando stavo studiando le cellule progenitrici epiteliali corneali e il loro comportamento in una situazione che sfida il mantenimento omeostatico della cornea.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, perché l'esecuzione dell'abrasione corneale è difficile e richiede pratica. Innanzitutto, preparare una soluzione di florecina allo 0,1% per visualizzare l'abrasione sotto la luce blu cobalto misurando 10 milligrammi di sale di florecina con una scala fine. Quindi, aggiungere il sale a 10 millilitri di soluzione salina tamponata Fosfate.Proteggere la soluzione di Florecine dalla luce e agitare per cinque minuti. Filtrare sterile la soluzione in un flacone contagocce e proteggere dalla luce. La soluzione di Florecina può essere conservata a quattro gradi Celsius per due o tre giorni.Pulire la punta della fresa oculare prima e dopo l'uso. Prima, con PBS, e poi, con il 70% di etanolo. Inizia posizionando il topo anestetizzato su un tovagliolo di carta su una piastra riscaldante riscaldata a 37 gradi Celsius.Controllare il livello di anestesia somministrando un pizzico di coda e un pizzico di punta. Il livello di anestesia è buono se il riflesso della coda è assente ma è presente il riflesso delle dita dei piedi. Ruotare la base della fresa per attivare la vibrazione.Aprire l'occhio da abradere tenendo le palpebre divaricate con le dita. Quindi, toccare con decisione la fresa sulla cornea e muovere lo strumento avanti e indietro e lateralmente sulla superficie oculare senza sollevare la bava. La vibrazione della bava eseguirà il graffio.Non premere, scuotere o strappare la cornea. Nella cornea centrale, 20 movimenti di abrasione sulla superficie sono sufficienti per indurre la ferita. Effettuare l'abrasione corneale è impegnativo e richiede pratica.Assicurati di prestare attenzione alla pressione corretta e prova a eseguire l'abrasione in un solo tentativo. Somministrare una goccia di soluzione di Flourecine sull'occhio abraso dal flacone contagocce. Quindi, lavare l'occhio una volta con soluzione salina allo 0,9% per ridurre lo sfondo della Florecine.Assorbire il liquido in eccesso con una salvietta morbida e pulire le ciglia se necessario. Per visualizzare l'abrasione, posizionare una lampada da tavolo con una penna blu cobalto attaccata appena sopra l'occhio del topo. Il pulsante della luce della penna può essere fissato con nastro adesivo per mantenere la luce accesa quando si lavora da soli.Metti a fuoco una fotocamera reflex sull'occhio nella luce della stanza, quindi spegni tutte le altre luci tranne la luce della penna blu cobalto. Quando viene illuminata con la luce della penna blu cobalto, la regione abrasa diventa verde fluorescente a causa delle molecole di florecina intrappolate nella superficie irregolare. Usa la fotocamera reflex per scattare foto dell'occhio.Dopo aver eseguito l'imaging dell'occhio, rimettere il mouse sulla piastra riscaldata. Metti una goccia di unguento per gli occhi antibatterico Fucidin sia negli occhi abrasi che in quelli non abrasi per idratare e mantenere la superficie oculare pulita dai batteri dopo l'anestesia. Osservare il mouse sulla piastra riscaldata per il periodo di risveglio post-anestetico da cinque a 20 minuti.Quando diventa mobile, ospita da solo il topo in una gabbia pulita. Dopo aver soppresso l'animale con un metodo approvato, raccogli il bulbo oculare tagliando e aprendo prima la pelle sul lato dell'occhio con le forbici da dissezione. Quindi, posiziona le forbici sotto il bulbo oculare e taglia il nervo oculare per pompare il bulbo oculare fuori dall'orbita.Metti l'occhio in un piatto contenente PBS. Utilizzare un ago da 26 calibri per praticare un foro sul retro dell'occhio sul lato retinico, per consentire la libera penetrazione delle soluzioni all'interno dell'occhio. Trasferire l'occhio in una provetta da due millilitri contenente PBS.Quindi, rimuovere il PBS, aggiungere il quattro percento di paraformaldeide e fissare l'occhio a quattro gradi Celsius per quattro o cinque ore. Questa immagine mostra un occhio di topo subito dopo l'abrasione. Il segnale di Florecine segna la regione abrasa in verde brillante, dove tutte le altre regioni dell'epitelio rimangono scure.La linea tratteggiata segna i bordi della ferita. L'immagine mostra l'occhio bilaterale illeso che funge da controllo. Il punto bianco è il riflesso della fotocamera.18 ore dopo l'abrasione, l'epitelio corneale si è in gran parte chiuso sulla regione esposta con solo una piccola abrasione rimanente. A 72 ore dall'abrasione, non è visibile alcun segnale verde. Ciò indica che l'epitelio corneale è stato completamente riepitelizzato entro 72 ore dall'abrasione.L'abrasione è focalizzata sull'epitelio corneale, mostrato qui nell'occhio intatto, quindi gli strati più profondi della cornea sono rimasti intatti. Immediatamente dopo l'abrasione, la colorazione H ed E rivela il bordo dell'abrasione, indicato da questo asterisco come una sporgenza acellulare stretta, che è continua da un epitelio corneale spesso da quattro a cinque strati cellulari. A 18 ore dall'infortunio, il processo di guarigione è attivo e la riepitelizzazione è in corso.Ciò è suggerito dalla comparsa di un bordo anteriore di uno o due strati di cellule epiteliali che copre la regione esposta. La superficie appare completamente riepitelizzata entro 72 ore, poiché i fronti migratori coprono la ferita e tutti gli strati epiteliali sono di nuovo presenti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se viene eseguita correttamente da due ricercatori.Durante la pianificazione e il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire le linee guida locali sul benessere degli animali e di mantenere una buona e sterile pratica di laboratorio. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi come il tracciamento linis per rispondere a ulteriori domande sulla guarigione delle ferite corneali, sulla riepitelizzazione e sul recupero dell'omeostasi tissutale nella cornea.

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Qui viene descritta la creazione di un modello di chirurgia della cataratta simulata ex vivo clinicamente rilevante che può essere utilizzato per studiare i meccanismi della risposta al danno dei tessuti epiteliali all'interno del loro microambiente nativo.

Istituzione di un clinicamente rilevanti<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Qui, viene descritto un protocollo per la creazione di una ferita da abrasione epiteliale corneale centrale nel topo usando una trefina e uno spud smussato della mazza da golf. Questo modello di guarigione delle ferite corneali è altamente riproducibile e viene ora utilizzato per valutare la guarigione delle ferite corneali compromesse nel contesto delle malattie.

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

Qui, vengono sviluppati modelli animali basati su topo e coniglio per il danno meccanico e chimico dell'epitelio corneale per lo screening di nuove terapie e del meccanismo sottostante.

Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Questo articolo descrive un nuovo modello animale sviluppato per studiare l'anatomia e l'istologia della cornea e dei suoi processi di guarigione. Questo nuovo modello animale utilizza il gerbillo mongolo, che ha una cornea con molte somiglianze con la cornea umana.

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Il presente protocollo dimostra i diversi passaggi coinvolti nella ferita della cornea di un pulcino embrionale in ovo. Le cornee rigeneranti o completamente restaurate possono essere analizzate per il potenziale rigenerativo utilizzando varie tecniche cellulari e molecolari seguendo la procedura di ferita.

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Questo protocollo si concentra sul danneggiamento della superficie oculare del pesce zebra attraverso l'abrasione per valutare la successiva chiusura della ferita a livello cellulare. Questo approccio sfrutta una bava oculare per rimuovere parzialmente l'epitelio corneale e utilizza la microscopia elettronica a scansione per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare durante la chiusura della ferita.

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Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

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