Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative ai meccanismi cellulari e molecolari coinvolti durante la guarigione della ferita corneale. Un vantaggio di questa tecnica è che riflette le situazioni in pronto soccorso in caso di inserto corneale, ovvero abrasione o graffio sulla superficie dell'occhio. Ho avuto l'idea di questo metodo quando stavo studiando le cellule progenitrici epiteliali corneali e il loro comportamento in una situazione che sfida il mantenimento omeostatico della cornea.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, perché l'esecuzione dell'abrasione corneale è difficile e richiede pratica. Innanzitutto, preparare una soluzione di florecina allo 0,1% per visualizzare l'abrasione sotto la luce blu cobalto misurando 10 milligrammi di sale di florecina con una scala fine. Quindi, aggiungere il sale a 10 millilitri di soluzione salina tamponata Fosfate.

Proteggere la soluzione di Florecine dalla luce e agitare per cinque minuti. Filtrare sterile la soluzione in un flacone contagocce e proteggere dalla luce. La soluzione di Florecina può essere conservata a quattro gradi Celsius per due o tre giorni.

Pulire la punta della fresa oculare prima e dopo l'uso. Prima, con PBS, e poi, con il 70% di etanolo. Inizia posizionando il topo anestetizzato su un tovagliolo di carta su una piastra riscaldante riscaldata a 37 gradi Celsius.

Controllare il livello di anestesia somministrando un pizzico di coda e un pizzico di punta. Il livello di anestesia è buono se il riflesso della coda è assente ma è presente il riflesso delle dita dei piedi. Ruotare la base della fresa per attivare la vibrazione.

Aprire l'occhio da abradere tenendo le palpebre divaricate con le dita. Quindi, toccare con decisione la fresa sulla cornea e muovere lo strumento avanti e indietro e lateralmente sulla superficie oculare senza sollevare la bava. La vibrazione della bava eseguirà il graffio.

Non premere, scuotere o strappare la cornea. Nella cornea centrale, 20 movimenti di abrasione sulla superficie sono sufficienti per indurre la ferita. Effettuare l'abrasione corneale è impegnativo e richiede pratica.

Assicurati di prestare attenzione alla pressione corretta e prova a eseguire l'abrasione in un solo tentativo. Somministrare una goccia di soluzione di Flourecine sull'occhio abraso dal flacone contagocce. Quindi, lavare l'occhio una volta con soluzione salina allo 0,9% per ridurre lo sfondo della Florecine.

Assorbire il liquido in eccesso con una salvietta morbida e pulire le ciglia se necessario. Per visualizzare l'abrasione, posizionare una lampada da tavolo con una penna blu cobalto attaccata appena sopra l'occhio del topo. Il pulsante della luce della penna può essere fissato con nastro adesivo per mantenere la luce accesa quando si lavora da soli.

Metti a fuoco una fotocamera reflex sull'occhio nella luce della stanza, quindi spegni tutte le altre luci tranne la luce della penna blu cobalto. Quando viene illuminata con la luce della penna blu cobalto, la regione abrasa diventa verde fluorescente a causa delle molecole di florecina intrappolate nella superficie irregolare. Usa la fotocamera reflex per scattare foto dell'occhio.

Dopo aver eseguito l'imaging dell'occhio, rimettere il mouse sulla piastra riscaldata. Metti una goccia di unguento per gli occhi antibatterico Fucidin sia negli occhi abrasi che in quelli non abrasi per idratare e mantenere la superficie oculare pulita dai batteri dopo l'anestesia. Osservare il mouse sulla piastra riscaldata per il periodo di risveglio post-anestetico da cinque a 20 minuti.

Quando diventa mobile, ospita da solo il topo in una gabbia pulita. Dopo aver soppresso l'animale con un metodo approvato, raccogli il bulbo oculare tagliando e aprendo prima la pelle sul lato dell'occhio con le forbici da dissezione. Quindi, posiziona le forbici sotto il bulbo oculare e taglia il nervo oculare per pompare il bulbo oculare fuori dall'orbita.

Metti l'occhio in un piatto contenente PBS. Utilizzare un ago da 26 calibri per praticare un foro sul retro dell'occhio sul lato retinico, per consentire la libera penetrazione delle soluzioni all'interno dell'occhio. Trasferire l'occhio in una provetta da due millilitri contenente PBS.

Quindi, rimuovere il PBS, aggiungere il quattro percento di paraformaldeide e fissare l'occhio a quattro gradi Celsius per quattro o cinque ore. Questa immagine mostra un occhio di topo subito dopo l'abrasione. Il segnale di Florecine segna la regione abrasa in verde brillante, dove tutte le altre regioni dell'epitelio rimangono scure.

La linea tratteggiata segna i bordi della ferita. L'immagine mostra l'occhio bilaterale illeso che funge da controllo. Il punto bianco è il riflesso della fotocamera.

18 ore dopo l'abrasione, l'epitelio corneale si è in gran parte chiuso sulla regione esposta con solo una piccola abrasione rimanente. A 72 ore dall'abrasione, non è visibile alcun segnale verde. Ciò indica che l'epitelio corneale è stato completamente riepitelizzato entro 72 ore dall'abrasione.

L'abrasione è focalizzata sull'epitelio corneale, mostrato qui nell'occhio intatto, quindi gli strati più profondi della cornea sono rimasti intatti. Immediatamente dopo l'abrasione, la colorazione H ed E rivela il bordo dell'abrasione, indicato da questo asterisco come una sporgenza acellulare stretta, che è continua da un epitelio corneale spesso da quattro a cinque strati cellulari. A 18 ore dall'infortunio, il processo di guarigione è attivo e la riepitelizzazione è in corso.

Ciò è suggerito dalla comparsa di un bordo anteriore di uno o due strati di cellule epiteliali che copre la regione esposta. La superficie appare completamente riepitelizzata entro 72 ore, poiché i fronti migratori coprono la ferita e tutti gli strati epiteliali sono di nuovo presenti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se viene eseguita correttamente da due ricercatori.

Durante la pianificazione e il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di seguire le linee guida locali sul benessere degli animali e di mantenere una buona e sterile pratica di laboratorio. Seguendo questo protocollo, è possibile eseguire altri metodi come il tracciamento linis per rispondere a ulteriori domande sulla guarigione delle ferite corneali, sulla riepitelizzazione e sul recupero dell'omeostasi tissutale nella cornea.