Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di determinare quantitativamente il contenuto di ficobiliproteine nel cianobatterio modello Synechocystis utilizzando un metodo spettrofotometrico. Le ficobiliproteine sono complessi pigmento-proteina solubili in acqua che rappresentano i componenti principali delle antenne di raccolta della luce nei cianobatteri procariotici e in diversi gruppi di alghe eucariotiche. Essendo i principali complessi di raccolta della luce, le ficobiliproteine rappresentano uno dei fattori cruciali che determinano la produttività delle alghe e dei cianobatteri.

Synechocystis è un cianobatterio modello che viene utilizzato in centinaia di laboratori in tutto il mondo. La Synechocystis contiene due ficobiliproteine, la ficocianina e l'alloficocianine. Questo protocollo descrive un metodo semplice, efficiente e affidabile per la determinazione quantitativa di entrambe le ficobiliproteine in questo ceppo di muffa.

Abbiamo confrontato diversi metodi, l'estrazione di ficobiliproteine e la quantificazione spettrofotometrica. Il metodo di quantificazione deve essere testato per ogni singolo ceppo, poiché gli spettri di assorbimento delle ficobiliproteine possono variare tra i diversi ceppi. All'inizio dell'estrazione delle ficobiliproteine, trasferire un millilitro di coltura di cianobatterio in una provetta con chiusura di sicurezza.

Se si decide di determinare il peso secco dei campioni, pesare le provette vuote prima del campionamento della coltura. Assicurati che la coltura non sia sedimentata. Centrifugare le celle a 15.000 G a temperatura di laboratorio per cinque minuti.

Eliminare con cautela il surnatante. Assicurati di non disturbare il pellet. Metti i campioni in congelatore.

Per la conservazione a lungo termine, conservare i campioni a 80 gradi Celsius. Questo è necessario per prevenire la degradazione delle ficobiliproteine. Una volta congelati i campioni, inserirli nel liofilizzatore.

Una volta iniziata la liofilizzazione, controllare la temperatura e la pressione sul liofilizzatore. La temperatura deve essere inferiore a 60 gradi Celsius e la pressione deve essere di circa un ettaro Pascal. Liofilizzare i campioni durante la notte.

Dopo aver terminato il ciclo di liofilizzazione, chiudere i tubi il prima possibile per evitare il riassorbimento dell'acqua dall'aria. Aggiungere quattro pezzi di perle di vetro da due millilitri a ciascuna provetta del campione. Omogeneizzare i campioni con le perle di vetro per 15 secondi.

Il campione adeguatamente omogeneizzato viene distribuito su tutta la superficie interna delle provette di sicurezza. Dopo l'omogeneizzazione delle cellule, aggiungere un millilitro di soluzione salina tamponata con fosfato ai campioni per estrarre le ficobiliproteine. Il pH ottimale del PBS è di circa 7,4.

Mescolare le cellule con il PBS per cinque secondi sull'omogeneizzatore. In questo modo si garantisce una miscelazione ottimale dei campioni per un'estrazione efficiente delle ficobiliproteine. Dopo la miscelazione, i campioni sono verdastri.

Conservare i campioni in ghiaccio per 60 minuti per un'estrazione più efficiente delle ficobiliproteine. Dopo l'estrazione, centrifugare i campioni a 15.000 G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, il surnatante ha un colore blu ciano.

Prima della misurazione spettrofotometrica, calibrare lo spettrofotometro utilizzando il PBS come bianco. Una volta calibrato lo spettrofotometro, scartare il PBS da una cuvetta dello spettrofotometro e pipettare il surnatante con le ficobiliproteine estratte al posto del tampone scartato. Per la quantificazione della ficocianina e dell'allofocianina, il surnatante con le ficobiliproteine estratte viene misurato a 615, 652 e 720 nanometri.

Come descritto nel testo, esistono diverse equazioni per la quantificazione dei ficobilisomi conosciute in letteratura. L'equazione utilizzata in questo protocollo è risultata essere la migliore correlatura delle concentrazioni di ficociani e alloficocianine come i pigmenti e i punti. Le fasi critiche del protocollo sono l'omogeneizzazione e l'estrazione delle cellule, che dovrebbero fornire sia un'elevata resa che un'elevata specificità.

Abbiamo testato diverse procedure di estrazione, come la disgregazione delle cellule mediante sonicazione, l'omogeneizzazione con perle di zirconia o il collegamento delle celle di congelamento. Il metodo di questo protocollo ha fornito la più alta resa di ficobilisomi. Poiché anche una piccola contaminazione dell'estratto proteico da parte della clorofilla può portare a una sovrastima del contenuto di ficobiliproteine, è necessario evitare qualsiasi estrazione di clorofilla dalle cellule.

Abbiamo rilevato la clorofilla nell'estratto grezzo, quindi abbiamo usato la sonicazione per la distruzione cellulare. Con cicli di sonicazione ripetuti, la concentrazione di clorofilla aumentava. Il tempo di omogeneizzazione è stato ottimizzato in 15 secondi.

L'omogeneizzazione sia per cinque secondi che per 20 secondi ha fornito rese leggermente inferiori. L'aggiunta di cloruro di sodio o di potassio al tampone PBS o all'acqua non ha aumentato l'efficienza dell'estrazione delle ficobiliproteine, come l'estrazione nel tampone acetato di sodio. Il tempo di estrazione delle ficobiliproteine è stato ottimizzato per 60 minuti, poiché dopo 120 e anche 240 minuti, la concentrazione di ficobiliproteine non è cambiata in modo significativo.

Assicurarsi che l'assorbanza a 615, 652 e 720 nanometri si adatti all'intervallo di assorbanza vicino dello spettrofotometro. Lo spettrofotometro utilizzato in questo protocollo mostra l'intervallo di assorbanza da vicino compreso tra 0,1 e tre. Abbiamo confrontato diverse equazioni di quantificazione spettrofotometrica delle ficobiliproteine note in letteratura.

L'equazione di Bennett e Bogorad ha fornito la migliore ricostruzione del contenuto di ficocianina e alloficocianina negli standard dei pigmenti con concentrazioni proteiche note. Le differenze tra le singole equazioni sono legate alle variazioni dei coefficienti di estinzione delle ficobiliproteine dell'organismo specifico. L'uso della streptomicina solfato non ha portato alla riduzione della clorofilla A nei campioni in cui la sonicazione è stata applicata o evitata.

Come dati rappresentativi, abbiamo determinato il contenuto di ficobiliproteine nelle cellule di Synechocystis. Il contenuto di ficobiliproteine diminuisce con l'aumentare della luce. Il protocollo è stato stabilito per ridurre al minimo il tempo e i requisiti di attrezzatura per l'analisi scritta dei pigmenti che può essere eseguita in qualsiasi laboratorio standard di scienze dal vivo.

Inoltre, il protocollo contiene altre due fasi, come la liofilizzazione del pellet cellulare e l'estrazione delle proteine. Il tempo di lavoro totale per la quantificazione dei ficobilisomi non supera le due ore.