Name: Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Scopri come determinare quantitativamente il contenuto di ficobiliproteine in Synechocystis mediante spettrofotometria. Questo metodo semplice ed efficiente misura ficocianina e alloficocianina per valutare la produttività dei cianobatteri.

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Il protocollo è stato adottato da una precedente pubblicazione11. T. Z., ch. D. e J. Č. sono stati sostenuti dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e dello sport della Repubblica Ceca all'interno del programma di sostenibilità nazionale ho (NPU ho), concedere il numero LO1415. J. Č. fu appoggiato anche dal GA CR, concessione numero 18-24397S. Accesso a strumenti e altre strutture è stata sostenuta dall'infrastruttura di ricerca ceco per la biologia dei sistemi C4SYS (non progetto LM2015055). M. A. S. è stata sostenuta da una sovvenzione dalla Fondazione scienza russa [n. 14-14-00904].

1. i cianobatteri coltivazione

<ol><li>Coltivare cellule Synechocystis in matracci di Erlenmeyer o in fotobioreattori10,19 a tamponato BG11 medio20 per mantenere un pH di &lt; 10 (ad esempio, utilizzando 17 mM HEPES10). Nota: Condizioni di coltivazione Standard richiedono una temperatura controllata (30 ° C, la temperatura ottimale è in genere, 35 ° C)21, illuminazione (in genere, una luce bianca di intensità fino a 800 µmol [fotoni] / [m2p])21e un CO alimentazione 2 (in fotobioreattore di piatto di 400 mL, la crescita saturando la concentrazione di CO2 è 1.700 ppm)21.</li>
	<li>Per determinare la densità di cultura, misurare la densità ottica di cultura spettrofotometricamente a 730 nm (OD730) utilizzando una cuvetta con un percorso ottico di 1 cm. in alternativa, contare le cellule al microscopio usando un emocitometro o una cella automatizzata contatore.</li>
</ol>2. preparazione di campioni
<ol><li>Lavorare sotto basso irraggiamento per prevenire il degrado phycobiliprotein.</li>
	<li>Vendemmia: 3 x 1 mL di sospensione di cultura ai tubi di sicurezza bloccaggio. Utilizzare triplici copie per la stima di errori tecnici nella misurazione. Per eseguire il campionamento di cultura in condizioni sterili, raccogliere le cellule in una cappa laminare e seguire le pratiche di lavoro e di sicurezza adeguate.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min, prestare attenzione al rotore della centrifuga correttamente bilanciata. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante. Essere sicuri di non disturbare il pellet.</li>
	<li>Mettere i campioni in un congelatore. Per l'archiviazione a lungo termine, conservare i campioni a-80 ° C. Ciò è necessario per evitare la degradazione di phycobiliprotein. Per lo stoccaggio a breve termine, da-20 ° C è sufficiente.</li>
	<li>Liofilizzare i campioni durante la notte. Per un corretto processo di liofilizzazione, mantenere la temperatura del condensatore liofilizzatore sotto-60 ° C e la pressione nella camera di liofilizzatore intorno 1 hPa.</li>
	<li>Dopo aver terminato il ciclo di liofilizzazione, chiudere il tubo appena possibile per impedire il riassorbimento di acqua dall'aria.</li>
</ol>3. cellula omogeneizzazione e pigmenti di estrazione
<ol><li>Aggiungere quattro pezzi di perle di vetro (con un diametro di 2 mm) per ogni provetta e chiudere i tubi. Nota: Quando il coperchio del tubo sicuro-blocco utilizzato per omogeneizzazione è troppo sottile, si può rompere durante l'omogeneizzazione; di conseguenza, solo il sicuro-blocco tubi con coperchi forte sono raccomandati per questo protocollo.</li>
	<li>Omogeneizzare i campioni con i branelli di vetro per 15 s su un omogeneizzatore a temperatura di laboratorio. Nota: Un campione correttamente omogeneizzato si sviluppa sulla superficie interna di tutto dei tubi sicuro-blocco.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone PBS (pH 7,4), preraffreddata a 4 ° C, per i campioni al fine di estrarre ficobiliproteine. Nota: Da questo punto, mantenere i campioni sul ghiaccio per prevenire la degradazione delle proteine estratte. Questo è fondamentale.</li>
	<li>Mescolare i campioni con PBS per 5 s sull'omogeneizzatore a temperatura di laboratorio. Nota: Dopo la miscelazione, i campioni sono verdastri.</li>
	<li>Dopo la miscelazione, mantenere i campioni su ghiaccio per 60 min. copertura del bagno di ghiaccio con un coperchio per evitare il degrado di pigmenti.</li>
	<li>Dopo 60 min di phycobiliprotein estrazione, centrifugare i campioni a 15.000 x g a 4 ° C per 5 min, prestare attenzione a bilanciare correttamente il rotore della centrifuga. Nota: Dopo la centrifugazione, il sovranatante ha un colore blu ciano.</li>
</ol>4. Phycobiliprotein quantificazione
<ol><li>Prima della misurazione spettrofotometrica, calibrare lo spettrofotometro alla linea di base utilizzando il tampone PBS come uno spazio vuoto.</li>
	<li>Una volta lo spettrofotometro è calibrato, scartare il PBS da una cuvette spettrofotometro e pipettare il surnatante con estratti ficobiliproteine anziché con il buffer scartato.</li>
	<li>Quantificare la concentrazione di phycobiliprotein spettrofotometricamente, utilizzando una larghezza di fessura di 0,5 nm.<ol>
<li>Misurare l'assorbanza di phycocyanobilins in ficocianina e allophycocyanin contro il tampone PBS in bianco a 615 nm (un615) e 652 nm (un652), rispettivamente, e misurare l'assorbanza di detriti cellulari a 720 nm (un720).</li>
		<li>Calcolare la concentrazione di ficocianina e allophycocyanin secondo le equazioni (1) e (2) di Bennett e Bogorad12: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq2.jpg"> Nota: Un615, un652e un720 dovrebbe adattarsi alla gamma lineare assorbanza dello spettrofotometro. Se necessario, diluire il campione con il tampone PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ricalcolare la concentrazione di pigmento nei campioni originali. La concentrazione di pigmento nel campione corrisponde direttamente con i risultati delle equazioni (1) e (2) quando 1 mL di coltura e 1 mL di tampone di estrazione vengono utilizzati per l'analisi. In caso di utilizzo di diversi volumi di campioni di cianobatteri e/o tampone PBS, la concentrazione di pigmento finale deve essere calcolata secondo l'equazione (3): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq3.jpg">(3) Nota: In caso di un contenuto di phycobiliprotein normalizzante per peso a secco delle cellule, la concentrazione di pigmento finale dovrebbe essere calcolata secondo equazione (4)<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58076/58076eq4.jpg"> (4)</li>
</ol>5. determinazione del peso secco cellulare (opzionale)
<ol><li>Pesano tre tubi vuoti di sicurezza bloccaggio su bilance analitiche. Attenzione: È fondamentale che i tubi di sicurezza bloccaggio siano asciutti. In caso di immagazzinare i tubi in un ambiente umido, asciugare i tubi per diverse ore in un essiccatore prima della pesatura loro congelamento. Manipolare le provette delicatamente e solo con i guanti senza polvere per evitare qualsiasi contatto tra il materiale e le dita del ricercatore. Tenere tutti i sostegni e centrifugare pulite per evitare il trasferimento di qualsiasi materiale per i tubi.</li>
	<li>Esempio 1 x 15 mL di sospensione per provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione di cultura nelle provette coniche da 15 mL a 4.000 x g a temperatura di laboratorio per 10 min. bilanciamento del rotore della centrifuga con tre ulteriori provette coniche da 15 mL, ciascuna contenente 15 mL di acqua. Dopo la centrifugazione, scartando 12 mL di surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet nel surnatante rimanente e trasferire 3 x 1 mL di miscela a tre tubi di sicurezza bloccaggio 1,5 mL con una pipetta. Nel caso in cui alcuni avanzi del pellet rimangono nel tubo conico da 15 mL, aggiungere 1,5 mL di acqua deionizzata al tubo conico, vortice o agitare il tubo per risospendere il restante a pellet e trasferire i tre tubi di sicurezza bloccaggio di 1,5 mL (già containi 3 x 0,5 mL della miscela ng 3 x 1 mL del pellet) con una pipetta. Nota: Dividendo il pellet sopra tre tubi di sicurezza bloccaggio 1,5 mL consentirà la stima di qualsiasi errore tecnico di misura il peso a secco.</li>
	<li>Centrifugare le cellule in 1,5 mL sicuro-blocco tubi a 15.000 x g a temperatura di laboratorio per 5 min, equilibrio del rotore della centrifuga con un tubo di sicurezza bloccaggio 1,5 mL aggiuntivo contenente 1 mL di acqua. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante.</li>
	<li>Mettere i campioni nel congelatore. Per l'archiviazione a lungo termine, conservare i campioni a-80 ° C; per la memorizzazione a breve termine, da-20 ° C è sufficiente.</li>
	<li>Liofilizzare i campioni durante la notte. Per un corretto processo di liofilizzazione, mantenere la temperatura del condensatore asciugatrice congelamento sotto-90 ° C e la pressione nella camera di liofilizzatore intorno 1 hPa.</li>
	<li>Dopo liofilizzazione, chiudere le provette e pesare i campioni su bilance analitiche. Nota: Il valore di peso a secco può essere utilizzato per la normalizzazione del contenuto phycobiliprotein al peso a secco delle cellule.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo semplice, veloce e riproducibile per la quantificazione del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Diversi metodi di omogeneizzazione delle cellule, estrazione di proteine e quantificazione di ficocianina e allophycocyanin vengono confrontati e protocollo finale rappresenta una combinazione della procedura ottima di ogni singola procedura. Come dati rappresentativi, il contenuto di ficobiliproteine è stato quantificato in Synechocystis...

fPhycobiliproteins sono complessi pigmento-proteina solubile in acqua che rappresentano i componenti principali delle antenne di luce-raccoglitrici in cellule procariotiche cianobatteri (Cyanophyta) e diversi taxa eucariotiche (Glaucophyta, Rhodophyta e Criptofite)1. Si presentano principalmente come complessi sopramolecolari chiamati ficobilisomi e sono in genere collegati alla superficie delle membrane fotosintetiche sul lato stromale, ad eccezione di Cryptophyta, dove sono localizzate le ficobiliproteine nella thylakoid lumen2. Sono stati identificati quattro tipi di ficobiliproteine fino a Data: allophycocyanin il nucleo e la periferica di ficocianina e ficoeritrina phycoerythrocyanin1. Come i complessi di raccolta di luce principali, ficobilisomi rappresentano uno dei fattori cruciali di produttività di massa colture di alghe e cianobatteri. È stato dimostrato che il troncamento ficobilisomi può migliorare accumulo di biomassa sotto forte luce3. D'altra parte, sotto modesto o basso irraggiamento, il troncamento dell'antenna ha provocato i tassi di crescita e biomassa accumulo riduzione3,4. Ficobiliproteine commercialmente sono utilizzati come coloranti per alimenti, prodotti farmaceutici e additivi alimentari, nell'industria cosmetica e come fluorescenza sonde con applicazioni in citometria a flusso, immunodosaggi fluorescente e di microscopia di fluorescenza5.
Questo protocollo è centrato sulla determinazione quantitativa di ficobiliproteine nel cianobatterio modello Synechocystis. I cianobatteri sono più presto autotrofi fotosintetici ossigenati; Essi hanno stato formando la biosfera terrestre per più di 2,4 miliardi di anni6. Giocano un ruolo cruciale nei cicli biogeochimici globali di azoto, carbonio, ossigeno e altri elementi. Tra i cianobatteri, un ceppo unicellulare Synechocystis guadagnato una posizione unica, poiché era il primo cianobatterio con l'intero genoma sequenziato7,8, è naturalmente trasformabile da DNA esogeno9, e esegue una crescita stabile e relativamente veloce10,11. In Synechocystis, il componente principale dell'antenna, allophycocyanin, è associato con le proteine integrali di membrana e la ficocianina annesso si trova alla periferia di membrana tilacoidale.
Diversi metodi per phycobiliprotein estrazione e quantificazione sono confrontati all'interno di questo protocollo. La procedura di estrazione finale è stata applicata con successo a Synechocystis, nonché ad altri ceppi di cianobatteri, tra cui Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP.e di Nostoc SP. ed è stato applicato con successo anche alghe rosse Porphyridium cruentum. Pertanto, il metodo sviluppato in questo protocollo può essere considerato come un metodo universale per estrazione phycobiliprotein. Anche se alcuni dei metodi di estrazione testata ha provocato i rendimenti più elevati di proteina totale, qui descritta procedura di estrazione purché il phycobiliprotein più alto produce insieme con il più basso contenuto di clorofilla un residuo nella Estratto di Phycobiliprotein. Riduzione del contenuto di clorofilla un era essenziale per la corretta ficocianina e quantificazione spettrofotometrica allophycocyanin.
Gli spettri di assorbimento di phycobiliprotein può variare significativamente tra varie alghe e cianobatteri specie12,13,14,15,16,17 e anche tra i diversi ceppi di un genere di cianobatteri singolo18. Pertanto, le lunghezze d'onda specifiche e coefficienti di assorbimento come usato per la determinazione della ficocianina e allophycocyanin in Synechocystis non sono generalmente applicabili ad altri ceppi. Inoltre, Synechocystis non contiene ficoeritrina e phycoerythrocyanin che può essere trovato in alcune altre alghe e cianobatteri. Ai fini della determinazione di ficobiliproteine in ceppi diversi da Synechocystis, si raccomanda di valutare singolarmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.
Sebbene il protocollo contiene due passi più lunghi (una notte liofilizzazione del pellet cellulare ed estrazione della proteina 1 ora), il tempo di lavoro totale per la quantificazione di ficobiliproteine è non più di 2 ore.

<table><tbody><tr><td>PCC 6803</td><td>Institut Pasteur, Parigi, Francia</td><td>6803</td><td>Cyanobacterium ceppo</td></tr><tr><td>Roti-CELL PBS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germania</td><td>9143.1</td><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf safe-lock&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburk, Germania</td><td>30120086</td><td>Provette con chiusura di sicurezza 1,5 ml</td></tr><tr><td>VWR Sistema di stoccaggio a 80 posti</td><td>VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA</td><td>30128-282</td><td>Supporto per provette con chiusura di sicurezza&nbsp;</td></tr><tr><td>RAININ 100 &micro; l -1000 &micro; l&nbsp;</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, Stati Uniti</td><td>17014382</td><td>pipetta</td></tr><tr><td>GP-LTS-A-1000&micro; L-/F-768/8</td><td>Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA</td><td>30389272</td><td>Puntali per pipette</td></tr><tr><td>Rotina 420R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Germania</td><td>4701</td><td>Centrifuga refrigerata per provette da 1,5 ml con chiusura di sicurezza e provette da centrifuga coniche da 15 ml</td></tr><tr><td>LCexv 4010</td><td>Liebherr, Bulle, Svizzera</td><td>9005382197172</td><td>Frigorifero e congelatore -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Revco ExF -86&deg; C Congelatore verticale a bassissima temperatura</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>EXF24086V&nbsp;</td><td>Congelatore -80&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>CoolSafe</td><td>LaboGene, Liller&oslash; d, Danimarca</td><td>7.001.000.615</td><td>Liofilizzatore&nbsp;</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV-2600</td><td>Shimadzu, Kyoto, Giappone</td><td>Spettrofotometro</td> <td>UV-2600</td></tr><tr><td>Cuvette di assorbimento Hellma, semi Micro</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>Z600288&nbsp;</td><td>Cuvette semi-micro VIS/UV-VIS 0,75-1,5 ml, gamma spettrale 200-2500 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Silamat S6</td><td>Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein</td><td>602286WU</td><td>Omogeneizzatore&nbsp;</td></tr><tr><td>Perle di vetro solido</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>Z273627</td><td>Perla di vetro del diametro 2&nbsp; mm</td></tr><tr><td>CPA225D-0CE</td><td>Sartorius AG, G&ouml; ttingen, Germania</td><td>SECURA225D-1OBR</td><td>Bilance analitiche</td></tr><tr><td>C-Ficocianina da Spirulina sp.</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P2172</td><td>Ficocianina standard</td></tr><tr><td>Alloficocianina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>A7472</td><td>Alloficocianina standard</td></tr> Kit <tr><td>acido bicinconinico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>BCA1, B9643</td><td>Kit completo per la determinazione delle proteine totali</td></tr><tr><td>AlgaeTron&nbsp;</td><td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, Repubblica Ceca</td><td>AG 130-ECO&nbsp;</td><td>Camera di coltivazione per fiasche di E., con luce e atmosfera controllabili</td></tr><tr><td>Photobioreactor</td><td>Photon System Instruments Ltd., Dr&aacute; sov, Repubblica Ceca</td><td>FMT-150</td><td>Attrezzature per la coltivazione di cianobatteri e alghe con ambiente completamente controllabile</td></tr><tr><td>Cellometro&nbsp;</td><td>Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA</td><td>Auto M10</td><td>Contatore di</td></tr><tr><td>cellule Corning 15 mL provette da centrifuga</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>CLS430791&nbsp;</td><td>Provetta da centrifuga da 15 ml per il campionamento del peso secco</td></tr><tr><td>Herasafe KS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>51024579</td><td>Cappa a flusso laminare</td></tr></tbody></table>

determinazione spettrofotometrica del contenuto di phycobiliprotein in cyanobacterium synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Si tratta di un semplice protocollo per la determinazione quantitativa del contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio modello Synechocystis. Ficobiliproteine sono i componenti più importanti di ficobilisomi, le antenne di luce-raccolta principali nei cianobatteri e diversi taxa di alghe. I ficobilisomi di Synechocystis contengono due ficobiliproteine: ficocianina e allophycocyanin. Questo protocollo descrive una semplice, efficiente e un metodo affidabile per la determinazione quantitativa di ficocianina e allophycocyanin in questo cianobatterio modello. Abbiamo confrontato i diversi metodi di phycobiliprotein estrazione e quantificazione spettrofotometrica. La procedura di estrazione come descritto in questo protocollo è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di cianobatteri come Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., e Nostoc SP., anche per quanto riguarda le alghe rosse Porphyridium cruentum. Tuttavia, i coefficienti di estinzione di specifici ficobiliproteine da vari taxa possono differire e pertanto, si raccomanda di convalidare il metodo di quantificazione spettrofotometrica per ogni singolo ceppo individualmente. Il protocollo richiede poco tempo e può essere eseguito in qualsiasi laboratorio di scienze biologiche standard poiché si richiede attrezzature solo standard.

Per i test di metodo iniziale, Synechocystis era coltivata come batch colture in matracci di Erlenmeyer su un agitatore BG11 coltivazione medio20 (completati con 17 mM HEPES) a 25 ° C, sotto una luce bianca calda di un'intensità di 50 µmol (fotoni) / (m p 2) e con 1% di CO2 nell'atmosfera coltura. Durante la coltivazione, le culture sono state campionate a sicuro-blocco tubi e centrifugati (15.000 x g a temperatura di laborat...

Qui, presentiamo un protocollo per determinare quantitativamente il contenuto di phycobiliprotein nel cianobatterio Synechocystis utilizzando un metodo spettrofotometrico. La procedura di estrazione è stata applicata con successo anche ad altri ceppi di alghe e cianobatteri; Tuttavia, a causa delle variazioni negli spettri di assorbimento del pigmento, è necessario testare individualmente le equazioni spettrofotometriche per ogni ceppo.

Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di determinare quantitativamente il contenuto di ficobiliproteine nel cianobatterio modello Synechocystis utilizzando un metodo spettrofotometrico. Le ficobiliproteine sono complessi pigmento-proteina solubili in acqua che rappresentano i componenti principali delle antenne di raccolta della luce nei cianobatteri procariotici e in diversi gruppi di alghe eucariotiche. Essendo i principali complessi di raccolta della luce, le ficobiliproteine rappresentano uno dei fattori cruciali che determinano la produttività delle alghe e dei cianobatteri.Synechocystis è un cianobatterio modello che viene utilizzato in centinaia di laboratori in tutto il mondo. La Synechocystis contiene due ficobiliproteine, la ficocianina e l'alloficocianine. Questo protocollo descrive un metodo semplice, efficiente e affidabile per la determinazione quantitativa di entrambe le ficobiliproteine in questo ceppo di muffa.Abbiamo confrontato diversi metodi, l'estrazione di ficobiliproteine e la quantificazione spettrofotometrica. Il metodo di quantificazione deve essere testato per ogni singolo ceppo, poiché gli spettri di assorbimento delle ficobiliproteine posso

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Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

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Determinazione spettrofotometrica del contenuto di Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

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