Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla sintesi proteica dinamica e sul proteoma coinvolto nel processo. Questa tecnica consente di identificare gli mRNA che vengono selezionati per la traduzione, i microRNA che possono partecipare al processo e interferire con la traduzione e le proteine che contribuiscono alla traduzione delle proteine o che vengono esse stesse tradotte. Questo metodo può fornire informazioni sulle risposte cardiache allo stress, ma può anche essere applicato allo studio delle risposte acute allo stress in altri organi.

A dimostrare la procedura sarà Miroslava Stastna, una scienziata del progetto del laboratorio di Jennifer Van Eyk. Il giorno dell'esperimento, riempire lo scomparto sinistro di un miscelatore a gradiente con cinque millilitri di soluzione a gradiente di saccarosio al 15% e riempire lo scomparto destro con cinque millilitri di soluzione a gradiente di saccarosio al 50%. Aprire il rubinetto e accendere la pompa per mescolare i due piccoli scomparti con un agitatore magnetico, quindi utilizzare un tubo collegato al secondo rubinetto per consentire alle soluzioni di saccarosio miscelate di fluire in un'unica provetta per ultracentrifuga con pareti sottili su ghiaccio.

Successivamente, omogeneizzare il tessuto cardiaco fresco o congelato con un POLYTRON in tampone di lisi filtrato per 15 secondi su ghiaccio. Al termine dell'incubazione, centrifugare il lisato per rimuovere il materiale insolubile e raccogliere il surnatante. Mettere da parte 50 microlitri di surnatante per la determinazione delle proteine, l'isolamento dell'RNA e l'analisi dell'integrità dell'RNA e sovrapporre da 100 a 500 microlitri del surnatante rimanente sulla soluzione a gradiente.

Utilizzare un tampone di lisi fresco per bilanciare i volumi tra le due provette a gradiente e ultracentrifugare i campioni in un'ultracentrifuga con rotore a secchiello oscillante. Fare molta attenzione a non disturbare il gradiente di saccarosio prima o dopo la centrifugazione. Per raccogliere i gradienti, programmare il collettore di frazioni per scartare i primi tre minuti di raccolta e per raccogliere le frazioni pesanti, leggere e non traslanti alla velocità di un millilitro al minuto in 17 frazioni da quattro a 19 minuti con monitoraggio continuo dell'assorbanza a 254 nanometri.

Metti ogni frazione sul ghiaccio non appena viene raccolta. Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius, se non vengono elaborati immediatamente. Per estrarre le proteine dalle frazioni dei polisomi, combinare le frazioni di saccarosio raccolte in tre frazioni finali e contrassegnare le frazioni come pesanti, leggere e non traducenti.

Mescolare 0,5 millilitri di ciascun campione con 60 microlitri di acido tricloroacetico al 100% o TCA. Incubare le frazioni durante la notte a meno 20 gradi Celsius al buio. La mattina successiva, scongelare i campioni su ghiaccio prima di pellettare le proteine mediante centrifugazione.

Scartare i surnatanti e lavare i pellet due volte con 0,5 millilitri di acetone refrigerato a meno 20 gradi Celsius per centrifugazione. Assicurarsi che il pellet, dopo la precipitazione del TCA, sia completamente disciolto, utilizzando la sonicazione a impulsi per garantire la completa solubilizzazione, se necessario. Asciugare i pellet all'aria dopo l'ultimo lavaggio prima della risospensione in 360 microlitri di tampone Tris-HCl.

Quindi aggiungere 40 microlitri di ditiotreitolo per un'incubazione di 45 minuti a 55 gradi Celsius con agitazione. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di iodoacetamide ai campioni per un'incubazione di 30 minuti sull'agitatore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, seguita dalla digestione dei campioni con un rapporto peso/peso di tripsina/proteine di uno a 50 per un'incubazione notturna con agitazione a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, dopo il raffreddamento, centrifugare brevemente i campioni e regolare il pH a due o tre con acido formico al 10% per spegnere l'attività della tripsina.

Per dissalare i campioni, condizionare prima il sorbente nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 200 microlitri di metanolo per tre volte, quindi condizionare con 200 microlitri di acido formico allo 0,1% per pozzetto per tre volte. Quindi, caricare i campioni su ciascun pozzetto e lavare i campioni tre volte con 200 microlitri di acido formico allo 0,1% per lavaggio. Utilizzando la gravitazione, seguita dal basso vuoto, eluire i campioni con 100 microlitri di acido formico allo 0,1% in acetonitrile al 50% due volte in una provetta da 0,5 millilitri a bassa ritenzione proteica per campione.

Quindi utilizzare un concentratore per far evaporare gli eluati del campione fino a secchezza e ricostituire ogni pellet di peptide triptico in 50-100 microlitri di acido formico allo 0,1% per l'analisi della spettrometria di massa. L'analisi dell'mRNA può essere eseguita per valutare la distribuzione di un particolare mRNA di interesse in ciascuna frazione o per la quantificazione e il confronto delle frazioni di traduzione poliribosomiale combinate con la frazione non traducente come rapporto dell'abbondanza di mRNA per ogni frazione. Ad esempio, qui, vengono mostrati i cambiamenti nella distribuzione dell'mRNA tra le frazioni traducenti e non traducenti dopo la sottomissione del cuore del topo a ischemia o riperfusione ischemica, rispetto al trattamento cardiaco fittizio.

In questo esperimento rappresentativo, l'analisi di un sottoinsieme di microRNA nelle frazioni pesanti raggruppate ha rivelato che 22 microRNA erano associati a polisomi durante l'ischemia, nove erano associati durante l'ischemia e la riperfusione e sette erano comuni a entrambe le condizioni, dimostrando che l'associazione dei microRNA è dinamica in risposta agli stress dell'ischemia e della riperfusione. Inoltre, la maggior parte delle proteine ribosomiali mitocondriali sono state identificate nella frazione leggera e la maggior parte delle proteine ribosomiali citosoliche sono state identificate comunemente sia nella frazione pesante che in quella leggera. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare molta attenzione al gradiente di saccarosio.

precipitazione del TCA per l'estrazione di proteine da frazioni polisomiali è stata selezionata nel nostro flusso di lavoro in base sia alla capacità di elaborare la frazione con un'alta concentrazione di saccarosio sia al numero di proteine identificate mediante spettrometria di massa. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa delle sfide associate alla riproducibilità del gradiente di saccarosio. La precipitazione del TCA è vantaggiosa poiché sono necessari solo piccoli volumi per far precipitare le proteine, il pellet è visibile sul fondo del tubo e non vi è accumulo di saccarosio durante la precipitazione.