Name: Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Scopri il profilo dei polisomi da cuore di topo isolato con perfusione Langendorff per analizzare la sintesi proteica dinamica, mRNA, miRNA e proteoma. Questo metodo avanzato rivela le risposte cardiache allo stress.

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HL112730 NIH P01 (straccio, JVE), NIH R01 HL132075 (straccio, JVE), centro Barbra Streisand femminile del cuore (straccio, JVE), Dorothy ed E. Phillip Lione sedia in cardiologia molecolare (RAG), Erika Glazer dotato sedia in salute del cuore della donna (JVE) e Accademia Ceca delle scienze Sostegno istituzionale RVO: 68081715 (MS).

<ol><li>Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+pseudohypoxia+targets+ambra1+mrna+to+p-bodies+for+translational+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression.</a> PLoS ONE. 10, e0129750(2015).</li>
<li>Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+in+atrial+tissue+of+patients+undergoing+heart+surgery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass.</a> JCI Insight. 2, e89303(2017).</li>
<li>Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+Combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+trafficking+of+transcripts+and+micrornas+in+regenerating+liver+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).</li>
<li>Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+Mirnas+and+mrnas+in+ischemic+preconditioning+and+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+enzymology.+Laboratory+methods+in+enzymology%3A+Rna.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface.</a> Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).</li>
<li>Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysomal+fractions+from+mouse+brain+synaptoneurosomes+and+analysis+of+polysomal-bound+mrnas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Molotski, N., Soen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+association+of+micrornas+with+polysomes+reflects+distinct+strengths+of+interactions+with+their+mrna+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets.</a> RNA. 18, 1612-1623 (2012).</li>
<li>Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+micrornas+are+associated+with+translating+messenger+rnas+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).</li>
<li>Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mirnas+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interplay between mirnas and human diseases.</a> Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrna+therapeutics%3A+Towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).</li>
<li>Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnp%3AMrna+association+in+polyribosomes+in+a+human+neuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line.</a> RNA. 10, 387-394 (2004).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+mirna+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).</li>
<li>Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+many+micrornas+that+copurify+with+polyribosomes+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).</li>
<li>Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-linked+microrna-21+exhibits+drastically+reduced+mrna+binding+and+silencing+activity+in+healthy+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver.</a> RNA. 18, 1510-1526 (2012).</li>
<li>Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+rna-binding+protein+hu+antigen+r%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).</li>
<li>McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+azidohomoalanine+labeling+in+mammals+%28palm%29+detects+changes+in+liver-specific+lkb1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice.</a> Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).</li>
<li>Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+biotinylated+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichloroacetic+acid-induced+protein+precipitation+involves+the+reversible+association+of+a+stable+partially+structured+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate.</a> Protein Science. 18, 980-993 (2009).</li>
<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Analisi del profilo polisoma consente lo studio della traduzione della proteina analizzando lo stato traduzionale di un mRNA specifico o l'intero trascrittoma6,7. Inoltre è di grande aiuto quando traduzione locale deve essere studiato come sinaptosomi8. Tradizionalmente, questo metodo comporta la separazione di mono - e poliribosomi e i mRNAs associati su un gradiente di saccarosio che potrebbe essere accoppiato con genomica o tecniche di ...

Il cuore risponde al pregiudizio di ischemia (I) e di riperfusione (R) in modo dinamico. Tuttavia, non esiste una visione poco in cambiamenti acuti nella sintesi delle proteine durante la risposta. Per risolvere questo problema, abbiamo approfittato del metodo consolidato di polisoma profilatura1 per identificare le modifiche in abbondanza di proteine che riflettono la ridistribuzione dei ribosomi e fattori di regolazione traduzionale dal citosol di polisomi, e la aumento di proteine recentemente sintetizzati (NSP). Nell'impostazione di I / R, l'aumento nella sintesi di nuove proteine avviene in un lasso di tempo che non è coerente con la trascrizione di mRNA nuovo2; Inoltre, discordanza tra i livelli di espressione di mRNA e proteina abbondanza è stato segnalato3. Per queste ragioni, abbiamo scelto di analizzare i cambiamenti nel proteoma dinamico come riflesso dalla traduzione della proteina. Per fare questo, abbiamo quantificare mRNA nelle frazioni polisoma e analizzare la composizione della proteina nelle frazioni polisoma. Infine, perché i microRNA (miRs) regolano la disponibilità dei mRNAs per traduzione e possono interferire con l'efficienza di proteina traduzione4,5, abbiamo esaminato la distribuzione di Mir nelle frazioni polisoma, concentrandosi sulla risposta a I / r.
Abbiamo scelto di utilizzare il modello di aspersione di isolato mouse Langendorff e tessuto raccolto in condizioni basali della perfusione continua, dopo ischemia globale di no--flusso 30 min e dopo 30 min di ischemia seguita da 30 min di riperfusione. Abbiamo poi solubilizzato il tessuto cardiaco e separato polisomi sopra un gradiente di saccarosio, seguita da analisi proteomica e rivelazione selettiva del mRNA e Mirna mediante PCR e microarray, rispettivamente. Questa combinazione di metodi rappresenta un approccio potente per comprendere il proteoma dinamico, consentendo la rilevazione simultanea di mRNA, miRNA e NSP, così come la ridistribuzione delle proteine regolatrici, miRNA e mRNA tra le frazioni di nontranslating, bassa efficienza polisomi e ad alta efficienza polisomi (Vedi Figura 1). Intuizioni la regolazione dinamica di questo processo saranno esteso da un'ulteriore analisi della fosforilazione di fattori regolatori chiave quali eIF2α o mTOR. Questi singoli passi ora sono descritti dettagliatamente.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>per l'eutanasia</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>utilizzato nelle pinze per la preparazione di Langendorff</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>utilizzato per appendere il cuore</td></tr><tr><td>Sistema Langendorff</td><td>Radnoti + fatto in casa</td><td>n/a</td><td>Un sistema a "quattro cuori" composto da vetro soffiato personalizzato, tubi e bagni d'acqua</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>Tampone Krebs e gradiente di saccarosio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Tampone Krebs e tampone di lisi</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>Tampone Krebs</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>Tampone Krebs</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>Buffer di Krebs</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Tampone Krebs</td></tr><tr><td>Polvere di saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>Gradiente di saccarosio</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>Gradiente di saccarosio e tampone di lisi</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Gradiente di saccarosio e tampone di lisi</td></tr><tr><td>Xilene Cianole</td><td>Sigma</td><td>X-4126</td><td>Gradiente di saccarosio</td></tr><tr><td>Cicloesimide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>Gradiente di saccarosio e tampone di lisi</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>Inibitore dell'RNAsi per tampone di lisi</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Tampone di lisi</td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Compresse cocktail, senza EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Provetta, a parete sottile, ultra trasparente, 13,2 mL, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman</td><td>LE-80K</td><td>Ultracentrifugazione dei gradienti</td></tr><tr><td>Rotore</td><td>Beckman</td><td>SW41</td><td>Ultracentrifugazione dei gradienti Biologic</td></tr><tr><td>LP (pompa)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>Frazionamento dei gradienti</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>Frazionamento dei gradienti</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga Eppendorf RNA/DNA LoBind, provetta da 2 mL</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>Frazione di gradiente ed estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol Tecnologie</td><td>di vita</td><td>AM9738</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Luciferasi Controllo RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>Estrazione del</td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-4</td><td>RNA estrazione</td></tr><tr><td>Glicogeno, grado RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Estrazione RNA</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Estrazione RNA</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>E7023-1L</td><td>Estrazione RNA</td></tr><tr><td>iScript Kit di sintesi cDNA</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>Trascrizione inversa</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>PCR quantitativa</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td> 217084 <td>Kit per l'isolamento totale dell'RNA</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit per la trascrizione inversa</td></tr><tr><td>dei miRNA miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td> 218073 <td>Kit per l'analisi dell'espressione PCR in tempo reale dei miRNA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Per la centrifugazione di provette da 1,5 mL o 2,0 mL a diverse temperature. Velocità massima - 21130 x g</td></tr><tr><td>Centrifuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Per la centrifugazione di piastre PCR in tempo reale a diverse temperature. Velocità massima - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Per la trascrizione inversa</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Per l'analisi PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>Per il controllo di qualità dell'isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Piastre PCR a 96 pozzetti rigide, a basso profilo, a parete sottile, bordate, verdi/trasparenti</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>Per analisi PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Pellicola sigillante per piastre PCR Microseal 'B', adesiva, ottica</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Per la sigillatura di piastre PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Research plus Pipetta monocanale, grigia; 0,5-10 &; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>Per il pipettaggio</td></tr><tr><td>delle pipette PIPETMAN Classic, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td><td>Per il pipettaggio</td></tr><tr><td>delle pipette PIPETMAN Classic, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>Per il pipettaggio</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipetta 100-1000 &; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>Per il pipettaggio</td></tr><tr><td>del glicogeno, grado RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>Migliora l'efficienza totale dell'isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Provette Posi-Click da 1,7 mL, colore naturale</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>Isolamento e conservazione dell'RNA; miscela di reagenti</td></tr><tr><td>Provette per cicli termici -0,2 mL Tappi singoli, provette standard da 0,2 mL con Denville</td><td></td><td>C18098-4 ottico (1000910)</td><td>Reazione di trascrizione inversa</td></tr><tr><td>Sharp 10 Puntali barriera di precisione</td><td>Denville</td><td>P1096-FR</td><td>Per il pipettaggio</td></tr><tr><td>Puntali barriera di precisione Sharp 20</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td>Per pipettaggio</td></tr><tr><td>Puntali barriera di precisione Sharp 200</td><td>Denville</td><td>P1122</td><td>Per puntali di pipettaggio</td></tr><tr><td>Filtro LTS 1 mL</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>Per pipettaggio</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay ( 200)</td><td>Qiagen</td><td>(cambia in base al miRNA)</td><td>Per l'analisi PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Modello 108</td><td>Strumenti BioComp</td><td></td><td>Per la preparazione di gradienti di saccarosio</td></tr><tr><td>acido tricloroacetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris cloridrato</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>iodoacetammide</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>tripsina modificata di grado di sequenziamento, suino</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato di ammonio</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>acido formico, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>metanolo, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile, Optima LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Provette Protein LoBind 0,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>Provette Protein LoBind 1,5 mL</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &micro; Piastra di eluizione 30 & micro; m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sonicatore SPD2010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Savant Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC trappola PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC colonna di separazione PepMap RSLC C18</td><td>Spettrometro di massa Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td> Spettrometro <td></td><td>di massa a trappola ionica Elite</td></tr> Software <tr><td>MSConvert Software</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST</td><td>Software Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dinamica proteomica e mirna analisi di polisomi da mouse cuore dopo langendorff aspersione isolata

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Gli studi in cambiamenti dinamici nella traduzione della proteina richiedono metodi specializzati. Qui abbiamo esaminato i cambiamenti in proteine appena sintetizzate in risposta all'ischemia e riperfusione usando il cuore isolato e perfuso del mouse accoppiato con profilatura polisoma. Per capire meglio i cambiamenti dinamici nella traduzione della proteina, abbiamo caratterizzato i mRNAs che sono stati caricati con i ribosomi citosolici (poliribosomi o polisomi) e anche recuperato polisomi mitocondriale e rispetto distribuzione mRNA e proteina nella le frazioni ad alta efficienza (numerosi ribosomi attaccati al mRNA), basso-efficienza (meno ribosomi allegati) che comprendeva anche polisomi mitocondriale e le frazioni non tradurre. Mirna possono anche associare mRNAs che vengono tradotti, riducendo così l'efficienza della traduzione, abbiamo esaminato la distribuzione dei miRNA attraverso le frazioni. La distribuzione dei mRNAs, Mirna e proteine è stata esaminata in condizioni basali irrorate, alla fine di 30 min di ischemia globale no-flusso e dopo 30 min di riperfusione. Qui presentiamo i metodi utilizzati per realizzare questa analisi — in particolare, l'approccio all'ottimizzazione dell'estrazione di proteine dal gradiente di saccarosio, come questo non è stato descritto prima — e fornire alcuni risultati rappresentativi.

analisi del mRNA risultati di mRNA possono essere espressa come una distribuzione di un particolare mRNA in ogni frazione (Figura 3A); per la quantificazione, combinare polyribosomal traduzione frazioni e confrontarlo con la frazione non-tradurre (Figura 3B), che presentano un rapporto di abbondanza del mRNA nella traduzione al nontranslating frazioni. Ulteriori informazioni sono maturate esaminando le frazioni di alt...

Qui presentiamo un protocollo per eseguire polisoma profilatura sul cuore isolato e perfuso del mouse. Descriviamo i metodi per aspersione di cuore, polisoma profiling e l'analisi delle frazioni polisoma rispetto al mRNA, Mirna e il proteoma polisoma.

Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla sintesi proteica dinamica e sul proteoma coinvolto nel processo. Questa tecnica consente di identificare gli mRNA che vengono selezionati per la traduzione, i microRNA che possono partecipare al processo e interferire con la traduzione e le proteine che contribuiscono alla traduzione delle proteine o che vengono esse stesse tradotte. Questo metodo può fornire informazioni sulle risposte cardiache allo stress, ma può anche essere applicato allo studio delle risposte acute allo stress in altri organi.A dimostrare la procedura sarà Miroslava Stastna, una scienziata del progetto del laboratorio di Jennifer Van Eyk. Il giorno dell'esperimento, riempire lo scomparto sinistro di un miscelatore a gradiente con cinque millilitri di soluzione a gradiente di saccarosio al 15% e riempire lo scomparto destro con cinque millilitri di soluzione a gradiente di saccarosio al 50%. Aprire il rubinetto e accendere la pompa per mescolare i due piccoli scomparti con un agitatore magnetico, quindi utilizzare un tubo collegato al secondo rubinetto per consentire alle soluzioni di saccarosio miscelate di fluire in un'unica provetta per ultracent

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Langendorff-mode perfusione cuore isolato, in collaborazione...

Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR

Singoli profili di espressione delle cellule consente la dettagliata analisi di espressione genica di cellule singole. Noi descrivere i metodi per l'isolamento dei cardiomiociti, e preparare il lisati risultante sia per microarray intero trascrittoma o qPCR di obiettivi specifici.

Cella singola Profiling trascrizionale dei cardiomiociti adulti mouse

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad...

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

L'analisi dell'espressione proteica nelle giovani valvole embrionali di topo è stata ostacolata dal limitato tessuto disponibile. Questo manoscritto fornisce un protocollo per la preparazione di proteine da regioni valvolari embrionali di topo in via di sviluppo per l'analisi del western blot.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

micro-RNA (Mirna) è brevi e altamente omologhi sequenze di RNA, che serve come regolatori trascrizionali di RNA messaggeri (mRNA). Attuali metodi di rilevazione di miRNA variano nella sensibilità e specificità. Descriviamo un protocollo che unisce l'ibridazione in situ e immunostaining per il rilevamento simultaneo di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo.

Tessuto-specifici miRNA Expression Profiling in Mouse cuore sezioni mediante ibridazione In Situ

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Abbiamo sviluppato un metodo semplicie per isolare le singole cellule cardiache del topo di alta qualità con la tecnica della perfusione antegrada. Questo metodo è privo di Langendorff e utile per isolare miociti ventricolari e atriali o cellule interstiziali, come fibroblasti cardiaci o progenitori.

Un metodo di perfusione antegrada per l'isolamento dei cardiomiociti dai topi

Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell'espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.

Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

Qui, descriviamo un protocollo per isolare una quantità sufficiente di singoli non cardiomiociti con elevata vitalità da un cuore di topo post-infarto miocardico (MI). Questo può essere utilizzato per il successivo sequenziamento di singole cellule, l'analisi della citometria a flusso e la coltura cellulare primaria.

Preparazione di una sospensione di cellule non cardiomiocitarie per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula da un cuore di topo adulto post-infarto miocardico

Scopri il profilo dei polisomi da cuore di topo isolato con perfusione Langendorff per analizzare la sintesi proteica dinamica, mRNA, miRNA e proteoma. Questo metodo avanzato rivela le risposte cardiache allo stress.

Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

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