Name: Utilizzando 22 3 dellanticorpo Anti-PD-L1 concentrarsi sulla biopsia e campioni di citologia dai malati di cancro del polmone Non a piccole cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri il metodo con anticorpo 22C3 per valutare l'espressione di PD-L1 in biopsie e campioni di citologia del carcinoma polmonare non a piccole cellule. Questa tecnica supporta la selezione affidabile dei pazienti per l'immunoterapia.

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Questo studio è stato sponsorizzato da Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, Stati Uniti d'America. I finanziatori non ha svolto ruolo nel disegno di studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto.

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico locale (Comitato di etica umana ricerca, Centre Hospitalier Universitaire de Nizza/Tumorothèque BB-0033-00025).
Nota: Questo protocollo è specificamente regolato per l'uso di 22 3 anticorpo concentrato su un commercialmente disponibile stainer IHC automatizzato (denominato per come autostainer qui, vedere la Tabella materiali) per le biopsie del tumore e campioni di citologia.
1. preparazione dei campioni di tessuto tumorale
<ol><li>Difficoltà tessuto tumorale in formalina 10% neutra tamponata (NBF), in una cassetta. Nota: Il tessuto del tumore dai tumori del polmone prossimale è generalmente ottenuto da bronchoscopy, eseguite sotto sedazione moderata da un pneumologo, o esperto del polmone. Per lesioni periferiche e affezione polmonare diffusa, è indicata una biopsia transbronchial o dell'ago. Queste procedure sono di solito fatto in una sala operatoria o unità di cure intensive.</li>
	<li>Incorporare la cassetta in paraffina. Nota: Fissazione può essere realizzata mediante aspersione o immersione immediatamente dopo la dissezione e in genere richiede 8-10 h. Il fissativo volume dovrebbe essere 15 – 20 x maggiore del volume di campione. Non è consigliabile risolvere il tessuto di biopsia per più di 10 h, poiché overfixation può causare mascheramento dell'antigene. La velocità di fissazione è di circa 1 mm/h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Infiltrare il campione di tessuto fisso con cera nel processore del tessuto (Vedi Tabella materiali). Nota: Disidratazione viene eseguita in tre vasche di alcool con aumento delle concentrazioni di 70%, 85% e 90%. Acqua è finalmente rimosso da tre bagni di alcool assoluto finale. La compensazione viene eseguita in tre bagni di toluene e l'infiltrazione di cera in bagni di paraffina calda (44 – 60 ° C).</li>
	<li>Incorporare il tessuto all'interno di uno stampo riempito con paraffina fusa (Vedi Tabella materiali) e attendere per solidificazione.</li>
	<li>Sezione del tessuto paraffina-incastonato con uno spessore di 3 μm su un microtomo.</li>
	<li>Trasferimento il nastro di paraffina per un bicchiere di carica positiva microscopio slide (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Far asciugare il vetrino per 1h a 37 ° C. Nota: Conservare le sezioni di tessuto a 2 – 8 ° C (preferito) o a temperatura ambiente fino a 25 ° C per preservare l'antigenicità e macchia entro 15 d di sezionamento.</li>
</ol>2. preparazione dei campioni di citologia
<ol><li>
Raccogliere i lavaggi bronchiali in una soluzione conservante (Vedi tabella materiali). Nota: Per questo, viene utilizzata la tecnica standard broncoscopia.<ol>
<li>La distribuzione del Bronco da campionare il lavaggio. Raccogliere il lavaggio in un recipiente pulito. Etichetta del contenitore con il paziente il primo e ultimo nome, data di nascita e origine del campione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire i lavaggi bronchiali a una provetta conica da 50 mL e aggiungere 2 g di DL-ditiotreitolo polvere (Vedi Tabella materiali), vortice il tubo per 30 min e poi lo Centrifugare a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di una soluzione mucolitica (Vedi Tabella di materiale).</li>
	<li>Agitare il campione per 20 min a velocità media (livello 9) e centrifugare esso a 250 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e depositare il pellet cellulare in provette contenenti 10% NBF.</li>
	<li>Aggiungere 4 gocce di un reagente di preparazione del blocco delle cellule (Vedi Tabella materiali) per il pellet cellulare.</li>
	<li>Trasferire il pellet cellulare su una videocassetta, risolvere il problema in 10% NBF e paraffina-incorporarlo per preparazione di blocco delle cellule e il sezionamento (vedere i passaggi 1.1 – 1,7).</li>
</ol>3. PD-L1 macchiatura Assay
<ol><li>Accendere l'autostainer e il computer.</li>
	<li>Fare doppio clic sull'icona autostainer e scegliere l'utente.</li>
	<li>Fare clic su 'Crea etichetta' e poi su 'Protocollo'.</li>
	<li>Fare doppio clic sul protocollo 22 3. Nota: Il protocollo è prima installato sul computer di autostainer cliccando su «creare protocollo». Il protocollo completo è fornito come File supplementari 1.</li>
	<li>Scrivere l'ID del paziente sull'etichetta e fare clic su 'Stampa'.</li>
	<li>Incollare l'etichetta sulla diapositiva.</li>
	<li>Aprire il cassetto di diapositiva premendo sul pulsante del cassetto che è stato scelto.</li>
	<li>Porre il vetrino con etichettato sul pad termico con l'etichetta rivolta verso Monte e verso l'interno.</li>
	<li>Chiudere il cassetto scorrevole.</li>
	<li>Togliere i tappi dai dispenser e caricare i reagenti sulle cremagliere dei reagenti.</li>
	<li>Aprire il cofano del coloratore e posizionare le cremagliere su Carosello dei reagenti assicurandosi che si adattano e tenere in posizione.</li>
	<li>Chiudere il cofano.</li>
	<li>Sul software, fare clic sullo strumento che verrà utilizzato e cliccare su 'Esecuzione'.</li>
	<li>Alla fine della procedura IHC, sciacquare il vetrino per alcuni secondi con l'acqua del rubinetto e una goccia di una soluzione di pulizia.</li>
	<li>Reidratare il vetrino con un bagno di etanolo al 100% e un secondo bagno di etanolo al 95% per alcuni secondi.</li>
	<li>Porre il vetrino nella macchina coprioggetto per un caricamento automatizzato del coprivetrino.</li>
</ol>4. interpretazione della colorazione PD-L1
Nota: Un patologo qualificato dovrebbe eseguire l'interpretazione del test IHC PD-L1.
<ol><li>Valutare la qualità della colorazione PD-L1 analizzando i controlli positivi e negativi prima dell'esame dell'esemplare del paziente. Nota: I risultati ottenuti sul campione del paziente sono considerati non validi se la macchiatura dei controlli non è accettabile.</li>
	<li>Confermare la presenza di un minimo di 100 cellule tumorali vitali sotto un microscopio. Nota: Rapporto quando esemplare del paziente ha meno di 100 cellule del tumore.</li>
	<li>A bassi ingrandimenti 4x, valutare tutte le zone di tumore ben conservato di positivi e negativi. Nota: Un basso ingrandimento, colorazione parziale della membrana o membrana macchiatura di debole intensità (1 +) può essere difficile da riconoscere.</li>
	<li>Punteggio di colorazione parziale o completa della membrana cellulare. Nota: La macchiatura citoplasmica dev'essere escluso dall'interpretazione.</li>
	<li>Calcolare il TPS valutando la proporzione delle cellule del tumore positivo PD-L1 rispetto a tutte le cellule del tumore presenti nelle aree del tumore ben conservato. Nota: Solo le cellule vitali del tumore dovrebbero essere esaminate. Tutti gli altri elementi cellulari, quali cellule del sistema immunitario, le cellule necrotiche, le cellule normali e artefatti, devono essere esclusi dall'esame.</li>
</ol>

<ol><li>Garon, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+for+the+treatment+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Reck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+Chemotherapy+for+PD-L1-Positive+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).</li>
<li>Langer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboplatin+and+pemetrexed+with+or+without+pembrolizumab+for+advanced%2C+non-squamous+non-small-cell+lung+cancer%3A+a+randomised%2C+phase+2+cohort+of+the+open-label+KEYNOTE-021+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study.</a> The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).</li>
<li>Buttner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Death-Ligand+1+Immunohistochemistry+Testing%3A+A+Review+of+Analytical+Assays+and+Clinical+Implementation+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).</li>
<li>Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+diagnosis+and+staging+in+the+minimally+invasive+age+with+increasing+demands+for+tissue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).</li>
<li>Padmanabhan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Adequacy+of+Small+Biopsy+and+Fine-Needle+Aspiration+Specimens+for+Molecular+Testing+by+Next-Generation+Sequencing+in+Patients+With+Lung+Cancer%3A+A+Quality+Improvement+Study+at+Dartmouth-Hitchcock+Medical+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).</li>
<li>Tsao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTsao%2C+MS+%22IASLC+ATLAS+of+PD-L1+Immunohistochemistry+Testing+in+Lung+Cancer%22">IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer</a>. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).</li>
<li>Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+IHC+in+NSCLC+with+a+global+and+methodological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective.</a> Lung Cancer. , 102-105 (2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-PD-L1+antibody+to+determine+PD-L1+expression+in+multiple+automated+immunohistochemistry+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms.</a> PLoS One. 12 (8), e0183023(2017).</li>
<li>Ilie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+22C3+anti-programmed+death+ligand+1+antibody+to+determine+programmed+death+ligand+1+expression+in+cytology+samples+obtained+from+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).</li>
<li>Skov, B. G., Skov, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+Comparison+of+PD-L1+Expression+on+Cytologic+and+Histologic+Specimens+From+Malignancies+in+the+Lung+Assessed+With+PD-L1+IHC+28-8pharmDx+and+PD-L1+IHC+22C3pharmDx%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).</li>
<li>Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytologic-histologic+correlation+of+programmed+death-ligand+1+immunohistochemistry+in+lung+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas.</a> Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).</li>
<li>Heymann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+non-small+cell+lung+carcinoma%3A+Comparison+among+cytology%2C+small+biopsy%2C+and+surgical+resection+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens.</a> Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).</li>
<li>Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-ligand+1+testing+of+lung+cancer+cytology+specimens+obtained+with+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy.</a> Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).</li>
<li>Ilie, M., Hofman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+PD-L1+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer-know+your+limits+but+never+stop+trying+to+exceed+them%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo convalidato un LDT ottimizzata utilizzando il concentrato di anticorpo del PD-L1 22 3, attraverso il confronto con il corrispondente test commerciale clinicamente validato10,11. 3 22 concentrato anticorpo-basato LDT ha mostrato un alto tasso di concordanza tra biopsia (~ 100%) e campioni di citologia (~ 95%) quando confrontata con l'espressione di PD-L1 IHC valutata mediante il saggio di PD-L1 IHC 3 22 a ≥ 1% TPS sia il ≥ 50% TPS taglio punti. Come recent...

Recenti studi clinici hanno dimostrato l'efficacia di pembrolizumab, un anticorpo di isotipo monoclonale umanizzato di kappa IgG4 che blocca l'interazione tra la morte programmata delle cellule 1 (PD-1) ed i suoi ligandi, PD-L1 e L2-PD, nel trattamento di pazienti con avanzato NSCLC1,2,3,4.
Attualmente, pembrolizumab è approvato per il trattamento di NSCLC PD-L1-esprimendo in entrambi i pazienti naïve al trattamento con un'espressione di PD-L1 TPS di ≥ 50% e nessun recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) o aberrazioni di linfoma anaplastic della chinasi (ALK) tumore genomico3 e per precedentemente trattati pazienti con un TPS PD-L1 di ≥ 1%1.
PD-L1 espressione proteica rilevata da IHC è stato ampiamente usato come analisi predittiva biomarcatore per terapie anti-PD-1/PD-L1. Negli studi clinici di pembrolizumab, il PD-L1 TPS ottenuti con formalina di campioni di tessuto paraffina (FFPE) è stato determinato utilizzando il PD-L1 IHC 3 22 compagno test5. Questo test è stato approvato da la US Food and Drug Administration (FDA) ed è stato marcato CE in Europa per la determinazione del tumore PD-L1 TPS5.
Ulteriori opzioni globali attraverso istituzioni per valutazioni affidabili e di alta qualità del TPS PD-L1 con LDTs che usare il concentrato di 22 3 anticorpo sono essenziali per sostenere le decisioni cliniche in materia di ammissibilità paziente per pembrolizumab trattamento. Un gran numero di laboratori di patologia non hanno accesso per il dosaggio di PD-L1 IHC 22 3 diagnostico compagno. Di conseguenza, lo sviluppo di affidabili e coerenti LDTs compatibile con piattaforme IHC autostainer ulteriori, ampiamente disponibili è essenziale.
Inoltre, c'è la necessità di stabilire LDTs usando campioni di citologia che sono il tipo di unico esemplare frequentemente disponibile da pazienti con NSCLC. Il dosaggio di compagno PD-L1 IHC 3 22 è convalidato per le resezioni, biopsie dell'ago e broncoscopie solo se la broncoscopia produce 100 cellule del tumore. Anche se spesso si ottengono i suddetti tipi di campione, campioni di citologia sono più facilmente raccolti e sono il tipo di campione più comunemente disponibile in alcune istituzioni6,7. Tuttavia, non c'è attualmente nessun test diagnostico convalidato disponibile per la valutazione dell'espressione PD-L1 in campioni di citologia; affidabile LDTs compatibile con campioni di citologia faciliterebbe ulteriori test di alta qualità PD-L1.
Inoltre, quando si stabilisce la validazione clinica di un LDT, l'IHC deve essere eseguita in modo simile ai test commerciale clinicamente validato corrispondente8. Per esempio, diversi passaggi critici devono essere verificate per ottenere lo stesso segnale in sezioni seriali quali titolazione di anticorpi, pretrattamento ritardi, tempi di incubazione e di sistemi di amplificazione9.
Recentemente abbiamo sviluppato un LDT ottimizzato che utilizza il concentrato 22 3 anticorpo per valutare l'espressione di PD-L1 su biopsie del tumore e citologia campioni10,11. Abbiamo trovato un'alta concordanza con la LDT contro il "gold standard" PD-L1 IHC 22 3 analisi10,11. Questo protocollo clinicamente validato sosterrà affidabile, di alta qualità PD-L1 test tra le regioni a livello mondiale.

<table><tbody><tr><td>NovaPrep HQ1</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Soluzione conservante per campioni citologici</td></tr><tr><td>Novaprep&reg; HQ+ B</td><td>Novacyt</td><td>NA</td><td>Soluzione mucolitica</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6</td><td>Sakura</td><td>6042 VIP 6</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek TEC 5 Sistema di console per l'inclusione dei tessuti</td><td>Sakura</td><td>5229 TEC 5</td><td></td></tr><tr><td>vetrino per microscopio SuperFrost Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3801</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph Multi Reax Vortex</td><td>Shaker Thermo Fisher Scientific</td><td>13-889-410</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytoblock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7401150</td><td></td></tr><tr><td>22C3 anti-PD-L1 concentrato anticorpo</td><td>Agilent Dako</td><td>#M365329</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 IHC 22C3 pharmDx</td><td>Agilent Dako</td><td>SK006</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Agilent Dako</td><td>AS480</td><td></td></tr><tr><td>Autocoloratore BenchMark ULTRA</td><td>Ventana</td><td>#750-600</td><td></td></tr><tr><td>OptiView HQ Linker universale</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>Multimero OptiView HRP</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>Amplificazione OptiView H2O2</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Amplificatore</td><td>Ventana</td><td>#760-099</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Multimero di amplificazione</td><td>Ventana</td><td>#760-100</td><td></td></tr><tr><td>OptiView DAB</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>OptiView Copper</td><td>Ventana</td><td>#760-700</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina II</td><td>Ventana</td><td>#790-2208</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bluing</td><td>Ventana</td><td>#760-2037</td><td></td></tr><tr><td>Condizionamento cellulare 1 (CC1)</td><td>Ventana</td><td>#950-124</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Coprioggetto</td><td>Sakura</td><td>4742</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando 22 3 dell'anticorpo anti-pd-l1 concentrarsi sulla biopsia e campioni di citologia dai malati di cancro del polmone non a piccole cellule

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab in monoterapia è stato approvato per il trattamento di prima e seconda linea di pazienti con PD-L1-esprimendo avanzata di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC). Test per PD-L1 espressione con l'analisi diagnostica di PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22 3 compagno, che dà una percentuale di tumore Punteggio ottenuto (TPS), è stato convalidato il tessuto del tumore. Abbiamo sviluppato un test ottimizzato laboratorio-sviluppato (LDT) che utilizza il concentrato 22 3 anticorpo (Ab) su un autostainer IHC ampiamente disponibile per gli esemplari di biopsia e citologia. Il TPS PD-L1 è stato valutato con 120 sezioni di accoppiati insieme-tumore del tessuto e i campioni di biopsia e con 70 accoppiato i campioni di biopsia e citologia (lavaggi bronchiali, n = 40; le effusioni pleuriche, n = 30). Il 22 3 Ab che concentrato a base di LDT ha mostrato un alto tasso di concordanza tra biopsia (~ 100%) e citologia (~ 95%) esemplari quando confrontata con IHC PD-L1 espressione valutata mediante il saggio di 22 3 compagno IHC PD-L1 a entrambi TPS taglio punti (≥ 1%, ≥ 50%). LDT ottimizzato presentato qui, usando il concentrato di Ab 22 3 per determinare l'espressione di PD-L1 in entrambi il tessuto del tumore e in campioni citologici, si espanderà la capacità dei laboratori in tutto il mondo per valutare l'ammissibilità dei pazienti con NSCLC trattati con pembrolizumab in monoterapia in modo affidabile e riproducibile.

Utilizzando la procedura presentata qui e come descritto in dettaglio in recenti pubblicazioni10,11 di questo gruppo, LDT ottimizzato è stato clinicamente validato con 120 campioni di biopsia FFPE NSCLC archivistici da pazienti sottoposti a chirurgia resezione o una biopsia presso l'ospedale universitario di Pasteur, Nizza, tra marzo 2007 e marzo 2016. Inoltre, per la valutazione dell'espressione di PD-L1 dei campioni di citologia...

Per espandere la capacità dei laboratori in tutto il mondo per valutare l'ammissibilità dei pazienti con cancro del polmone per il trattamento con pembrolizumab, in modo affidabile e riproducibile, abbiamo sviluppato un test che utilizza il 22 3 anticorpo concentrato su un ampiamente disponibile immunohistochemical autostainer, per gli esemplari di biopsia e la citologia.

Utilizzando 22 3 dell'anticorpo Anti-PD-L1 concentrarsi sulla biopsia e campioni di citologia dai malati di cancro del polmone Non a piccole cellule

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Questo metodo che utilizza il concentrato di anticorpi 22C3 per determinare l'espressione di PD-L1 sia nel tessuto tumorale che nel campione di citologia amplierà la capacità dei laboratori di valutare la selezione di pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole per l'immunoterapia in modo affidabile e riproducibile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente concorde con il saggio gold standard e supporterà test PD-L1 affidabili e di alta qualità in tutte le regioni del mondo. In generale, i patologi nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della colorazione granulare osservata occasionalmente.Inoltre, la colorazione delle cellule umane è un po 'più intensa di quella osservata con il gold standard. Pertanto la formazione dei patologi è necessaria per ottenere una corretta interpretazione della colorazione PD-L1 con il 22C3 LDT. A dimostrare la procedura sarà la signoraMarame Hamila, una tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, fissare il tessuto tumorale in formalina tamponata al 10% in una cassetta e incorporare la cassetta in paraffina come delineato nel protocollo di testo. Incorporare il tessuto infiltrato all'interno di uno stampo riempito con paraffina fusa.Lasciare che il tessuto rimanga nello stampo fino a quando la paraffina non si è solidificata. Successivamente, utilizzare un microtomo per sessare il tessuto incorporato nella paraffina a uno spessore di tre micrometri. Trasferire il nastro di paraffina su uno scivolo al microscopio in vetro caricato positivamente.Quindi, asciugare lo scivolo per un'ora a 37 gradi Celsius. In primo luogo, raccogliere i lavaggi bronchiali in una soluzione conservante. Trasferire i lavaggi in un tubo conico da 50 millilitri.Aggiungere due grammi di DL-Ditiothreitol e vortice il tubo per 30 minuti, quindi centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 millilitri di una soluzione mucolitica. Agitare il campione a media velocità per 20 minuti e centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.Successivamente, rimuovere il supernatante e depositare il pellet cellulare in un tubo di raccolta contenente formalina tamponata al 10% neutra. Aggiungere quattro gocce di un agente di preparazione del blocco cellulare. Trasferire il pellet di cella su una cassetta.Fissare il pellet cellulare per l'incorporamento e la sessatura della paraffina utilizzando il processo precedentemente descritto per la preparazione di campioni di tessuto tumorale. Per iniziare, accensione dell'autostainer e del computer. Fare doppio clic sull'icona del rilevamento automatico e scegliere l'utente.Fare clic su Crea etichetta e quindi su Protocollo. Fare doppio clic sul protocollo 22C3. Compilare l'ID del paziente e fare clic su Stampa.Successivamente, attaccare l'etichetta sulla diapositiva. Premere il pulsante sul cassetto diapositiva scelto per aprirlo e posizionare la diapositiva etichettata sul pad termico con l'etichetta rivolta verso l'alto e verso l'interno. Chiudere il cassetto scorrevole.Quindi, rimuovere i tappi dai distributori. Caricare i reagenti sul rack dei reagenti. Aprire il cofano della scala e posizionare i rack dei reagenti sulla giostra dei reagenti, assicurandosi che si adattino correttamente e si tengano in posizione, quindi chiudere il cofano.Nel software, fare clic sullo strumento che verrà utilizzato e quindi fare clic su In esecuzione. Al termine della procedura IHC, utilizzare l'acqua del rubinetto con una singola goccia di soluzione detergente per risciacquare il vetrino per diversi secondi. Disidratare lo scivolo immergendolo in sequenza in due bagni di etanolo per diversi secondi ciascuno, quindi posizionare lo scivolo in una macchina di copertura per caricare automaticamente lo slittamento del coperchio.Per iniziare a valutare la qualità della colorazione PD-L1, analizzare i controlli positivi e negativi prima di esaminare il campione del paziente. Utilizzando un microscopio, confermare la presenza di almeno 100 cellule tumorali vitali. Con un basso ingrandimento di 4 volte, valuta tutte le aree tumorali positive e negative ben conservate.Successivamente, segnare la colorazione parziale o completa della membrana cellulare e calcolare il punteggio della proporzione tumorale valutando la proporzione di cellule tumorali PD-L1 positive rispetto a tutte le cellule tumorali presenti nelle aree tumorali ben conservate. In questo studio, il punteggio di proporzione tumorale o TPS viene valutato per campioni di biopsia dei tessuti accoppiati in blocchi di cellule preparati da lavaggi bronchiali o effusioni pleuriche. I modelli di colorazione rappresentativi con campioni di biopsia vengono utilizzati per confrontare il concentrato di anticorpi 22C3 con il saggio complementare PD-L1 IHC 22C3.Il coefficiente di correlazione intraclasse, che viene utilizzato per misurare la correlazione del punteggio TPS come variabile continua, è del 99% tra l'LDT e il gold standard. Modelli di colorazione rappresentativi con campioni di citologia vengono utilizzati anche per confrontare il concentrato di anticorpi 22C3 con il saggio complementare PD-L1 IHC 22C3. Il tasso di concordanza dei campioni di biopsia e citologia con l'LDT è superiore al 95% quando si utilizza uno dei punti di taglio TPS.Il coefficiente di correlazione intraclasse durante l'utilizzo di TPS come variabile continua è compreso tra 0,88 e 0,90. Una volta padroneggiata, questa tecnica dà un alto tasso di concordanza con il gold standard nel valutare il cutoff per positività o istologia tumorale sia per i campioni di tessuto che per i ciclici. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i campioni devono essere valutati con riferimento alla diapositiva HE e in alcuni casi difficili possono essere eseguite macchie complementari per valutare le cellule immunitarie per escludere un'interpretazione errata dell'espressione PD-L1 solo nelle cellule tumorali.Seguendo questa procedura, è possibile valutare altri campioni come biopsie ad ago fine, EUS-FNA o spazzole bronchiali. Dopo la sua impostazione nelle cliniche, la robustezza del saggio deve essere mantenuta nel tempo cercando l'accreditamento, seguendo procedure operative standard e partecipando regolarmente a schemi esterni di valutazione della qualità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare il protocollo ottimizzato utilizzando l'anticorpo anti-PD-L1 22C3 concentrato su un autostainer IHC ampiamente disponibile sia campioni di biopsia che di citologia da pazienti con cancro polmonare a cellule non piccole.

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