Name: In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri come isolare neutrofili canini dal sangue e visualizzare la formazione di NET in tempo reale mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di quantificare citH3 e studiare le funzioni dei neutrofili in vivo.

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L'autore corrispondente è stato finanziato dalla Fondazione di animale Morris (D15CA-907). Lo studio è stato sostenuto dall'Università di California, Davis, centro per la salute equina e centro per la salute animale compagno (2016-24-F). Gli autori desidera ringraziare Geena Ng per la sua assistenza con le figure e Nghi Nguyen per la sua assistenza con il video.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la University of California, Davis e istituzionali cura degli animali (numero di protocollo: 18338).
1. prelievo sangue
<ol><li>Disegnare 10 mL di sangue da una vena cefalica o giugulare utilizzando un ago 21G dall'aspirazione di siringa.</li>
	<li>Per evitare un'eccessiva sollecitazione di taglio, rimuovere l'ago dalla siringa prima di trasferire il sangue in provette contenenti eparina sodica (75 USP). Capovolgere delicatamente le provette un paio di volte a garantire un'adeguata miscelazione di anticoagulante e sangue. Verifica l'evidenza di coaguli o aggregati di eritrociti prima di posizionare i campioni sul ghiaccio.</li>
</ol>2. isolamento del neutrofilo
<ol><li>Diluire il sangue anticoagulato con un volume uguale di tampone fosfato salino di gelida Dubecco (DPBS) (pH 7.4, senza cationi bivalenti). Trasferire 8 mL di sangue diluito in una provetta conica in polipropilene da 50 mL contenente 25 mL di 3% destrano (da Leuconostoc spp. sciolto in soluzione di cloruro di sodio 0,9%). Disporre il tubo verticalmente a temperatura ambiente per 30 min consentire l'aggregazione e la sedimentazione degli eritrociti.</li>
	<li>Con attenzione strato 5 mL di plasma leucocita-ricco (Figura 1) sulla cima di 5ml di media gradiente di densità in un tubo di turno-fondo 14 mL in polipropilene. Fare attenzione a non mescolare i 2 soluzioni11.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 400 x g con accelerazione/decelerazione (A/D) impostato su 0 (nessun freno) per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando un 5ml pipetta sierologica raccogliere lo strato delle cellule del granulocyte bypassando il plasma e i livelli di sangue periferico (PBMC) di cellule mononucleate (Figura 1). Utilizzare una nuova pipetta ogni volta per minimizzare la contaminazione.</li>
	<li>Posto 4 a 6 mL di strato delle cellule del polymorphnuclear (PMN) in un tubo conico in polipropilene da 50 mL. Dal momento che una piccola quantità di aggregati di eritrociti può essere aspirata insieme al livello PMN, usare una pipetta sierologica da 1 mL per rimuovere delicatamente gli aggregati dell'eritrocito che sono depositati nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Lisare gli eritrociti rimanenti con 20 mL di acqua distillata fredda. Capovolgere delicatamente la provetta più volte per 30 a 60 s per garantire adeguata lisi prima di aggiungere un volume uguale di soluzione di cloruro di sodio 1,8% ghiacciata.</li>
	<li>Centrifugare a 112 x g per 10 min a 4 ° C, A/D impostato a 0.</li>
	<li>Ripetere il passo di lisi degli eritrociti se questo pellet viene visualizzato in rosso. Scartare il surnatante con cura con una pipetta sierologica e delicatamente risospendere il pellet in 100 µ l di DPBS (destrosio di 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM CaCl2 e 1% albumina di siero bovino, pH 7,3). Unire tutte le celle di sedimento e metterli su ghiaccio.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle cellule usando un analizzatore automatizzato delle cellule e verificare il conteggio di un emocitometro. Se necessario, concentrarsi PMNs su una lastra di vetro utilizzando una citocentrifuga (1.000 giri/min, 5 min) e determinare la percentuale dei neutrofili contando il numero di neutrofili rispetto al numero totale delle cellule.</li>
	<li>Determinare la fattibilità dei neutrofili eseguendo un test di esclusione del blu di trypan, come indicato dalla Strober et al. 12 isolamento successo dovrebbe produrre una redditività dal 95 al 100% e neutrofili dovrebbero essere superiori al 95%.</li>
	<li>Determinare la concentrazione dei neutrofili moltiplicando il conteggio totale delle cellule con la vitalità percentuale e la percentuale dei neutrofili. Isolamento di successo dovrebbe produrre una concentrazione dei neutrofili da 1,5 a 6 x 106/ml.</li>
	<li>Diluire i neutrofili a una concentrazione finale di 1 x 106/ml con DPBS contenente destrosio di 5 mM, 0.9 mM MgCl2, 1,9 mM di CaCl2e 1% di albumina di siero bovino con pH regolato a 7.3.</li>
</ol>3. fluorescente microscopia di neutrofili dal vivo
<ol><li>Posto da 200 a 400 μL di neutrofili (1 x 106/ml) in ciascun pozzetto della poli-L-lisina 12-pozzetti cultura piatto rivestito. Consentire i neutrofili ad aderire al fondo dei pozzetti incubando le cellule a 37 ° C per 30 min.</li>
	<li>Etichetta di acidi nucleici con 1 μM di uno dei due acidi nucleici coloranti, uno che le macchie in cellule con membrane intatte e uno che le macchie in cellule con membrane permeabili (Vedi Tabella materiali), per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Attivare i neutrofili con il lipopolysaccharide di 100 μg/mL (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) come controllo positivo, o un equivalente volume di DPBS come controllo negativo per 180 min a 37 ° C.</li>
	<li>Acquisire immagini utilizzando la GFP (eccitazione: 470/22 nm, emissione: 525/50 nm) e canali di Texas Red (eccitazione: 585/29 nm, emissione: 628/32 nm) su un microscopio a fluorescenza a 40 ingrandimenti presso i seguenti punti di tempo: 30, 90, 120 e 180 min.</li>
</ol>4. netto quantificazione e l'individuazione delle componenti netti mediante immunofluorescenza
<ol><li>Posizionare con attenzione il coprioggetto 18 mm diametro poli-D-lisina rivestito nei pozzetti di una piastra di coltura 12-pozzetti. Etichettare correttamente i pozzi.</li>
	<li>Seme 100 a 200 μL di isolato neutrofili (1 x 106/ml) direttamente sulle lamelle e consentire i neutrofili ad aderire al coprioggetto incubando le cellule a 37 ° C per 30 min.</li>
	<li>Attivare i neutrofili come descritto al punto 3.3. Inibiscono la formazione netta pretrattando i neutrofili con µΜ 200 Cl-amidine (15 min, 37 ° C) prima dell'attivazione come precedentemente descritto da Li et al. 13 assicurarsi che il controllo del proprio veicolo (DMSO) è incluso nell'esperimento.</li>
	<li>Rimuovere con cautela i vetrini con una pinzetta. Strato un foglio di pellicola di paraffina sopra un cavalletto di provetta creare pozzi poco profondi e inserire 2 o 3 gocce di 4% PFA in ogni ben10. Etichettare correttamente i pozzetti e appoggialo delicatamente con il coprioggetto upside-down sui pozzi di PFA-riempito. Consentire alle cellule di essere fissato a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Lavare le cellule 3 volte in DPBS per 5 min, spostandoli da un pozzetto per il prossimo.</li>
	<li>Se immunolabelling non può essere eseguita subito dopo la fissazione e l'attivazione del neutrofilo, consentire vetrini coprioggetto essere essiccato inserendo i vetrini a faccia in su un pezzo di carta di assorbanza. Vetrini possono essere conservati per fino a 1 settimana a faccia in su in una piastra di coltura di 12-pozzetti etichettati a 4 ° C fino a ulteriori analisi. Lavare le cellule 3 volte in DPBS per 1 min, utilizzando la stessa tecnica come descritto in 4.4 prima di procedere al passaggio successivo.</li>
	<li>Per permeabilize le cellule, appoggiare delicatamente il vetrino coprioggetto capovolta su una goccia di 1% NP-40 per 1 min, utilizzando la tecnica descritta in 4.4. Lavare 3 volte in DPBS per 1 minuto su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Assegnare ogni campione a un numero e utilizzare un indicatore di punte di diamante per etichetta di conseguenza i coprioggetti in modo casuale.</li>
	<li>Preparare ed etichetta individuale di Petri allineato con il film di paraffina e 100 a 200 μL di siero di capra del 5% sulla pellicola (tampone di arresto). Posare i coprioggetti upside-down sul tampone bloccante. Mettere su un rocker e incubare per 1h a 37 ° C.</li>
	<li>Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo primario (istone di 1: 400 coniglio policlonale anti-citrullinated H3 (citH3) nel 5% di siero di capra). Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Mettere su un rocker e incubare per 1h a 37° C.</li>
	<li>Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Diluire anticorpo secondario coniugato con un fluoroforo (1: 200) in siero di capra 5%. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Posto su un rocker e Incubare 1h a 37 ° C al buio.</li>
	<li>Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.</li>
	<li>Per il rilevamento simultaneo del myeloperoxidase (MPO) seguire i seguenti passi per un protocollo modificato Doppio immunolabeling come descritto da Li et al. 13
</li>
	<li>Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down su 100 e 200 μL di 10% coniglio siero sotto dolce dondolo (durante la notte, 4 ° C, al buio).</li>
	<li>Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.</li>
	<li>Incubare le cellule in capra non coniugata di 50 μg/mL anti-coniglio Fab frammenti per 2 h a temperatura ambiente su un rocker nel buio.</li>
	<li>Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo primario (1: 200 coniglio anti-umani MPO anticorpi policlonali) in siero di capra 5%. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Posto su un rocker e Incubare 1h a 37° C al buio.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo secondario coniugato ad un fluoroforo in siero di capra del 5% e incubare come descritto in 4.8</li>
	<li>Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.</li>
	<li>Controlli di interferenza devono essere preparati da escluse incubazione con entrambi gli anticorpi primari nel secondo passaggio immunitario-etichettatura.</li>
	<li>Macchia di DNA con 300 nM di 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI) per 5 min al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare 3 volte in DPBS per 1 minuto su un rocker nel buio.</li>
	<li>Applicare una goccia (~ 50 μl) del montante antifade su una lastra di vetro. Picchiettare delicatamente il bordo del coverslip su una carta assorbente per rimuovere il tampone in eccesso prima di montare il vetrino coprioggetto con le cellule upside-down. Il mezzo di montaggio dovrebbe formare uno strato sottile tra il vetrino coprioggetto e il vetrino. Per rimuovere le bolle d'aria, premere molto delicatamente il vetrino coprioggetti con una pinzetta.</li>
	<li>Permetta che i campioni curare una notte al buio a 4 ° C. Il mezzo di montaggio dovrebbe indurire per analisi microscopiche con lenti ad immersione. Conservare i campioni a 4 ° C al buio.</li>
</ol>5. del neutrofilo trappola extracellulare quantificazione
<ol><li>Accecare gli operatori di acquisire e analizzare le immagini del microscopio alle condizioni sperimentali.</li>
	<li>Usando un microscopio a fluorescenza a 40 ingrandimenti, prendere 10 immagini in modo casuale da varie regioni di ogni vetrino coprioggetti in un esperimento sotto i rispettivi canali. Assicurarsi che il tempo di esposizione, la luminosità e il contrasto di ogni canale sono mantenuti costante durante l'acquisizione di immagini.</li>
	<li>Analizzare le immagini utilizzando il software disponibile come ImageJ (NIH). Identificare le reti basate su co-localizzazione di cfDNA, citH3 e MPO (Figura 3A, B). Quantificare il numero delle reti e dei neutrofili in 10 campi casuali per ogni condizione sperimentale. Numeri di reti rilasciato può essere espressa come rapporto (numero di reti: numero totale dei neutrofili) per ogni condizione sperimentale.</li>
	<li>Per valutare gli effetti del trattamento sull'espressione intracellulare citH3, contare il numero dei neutrofili con citH3 intracellulare e il numero dei neutrofili senza citH3 intracellulare in 10 campi casuali a 40 ingrandimenti sotto i rispettivi canali ( Figura 3, frecce rosse). Espressione citH3 intracellulare può essere espresso come il rapporto tra numero dei neutrofili con citH3 intracellulare al numero di neutrofili senza citH3 intracellulare.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+suicide%3A+why+neutrophils+die%2C+to+make+NETs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li>
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<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Presentiamo qui un protocollo per osservare i cambiamenti nella conformazione e cfDNA i nuclei dei neutrofili canini vivente utilizzando un colorante permeante cella sia un colorante impermeant cella. Il vantaggio principale di questo test è che permette per il rilevamento in tempo reale di formazione netta di microscopia ad alta risoluzione nei neutrofili dal vivo senza fissazione delle cellule, di conseguenza, fornendo uno strumento semplice e prezioso per l'osservazione in vitro formazione netta. Poiché quest...

I neutrofili sono di breve durati granulociti responsabili della iniziale difesa contro agenti patogeni d'invasione. Neutrofili, reclutati nel sito di infezione, eliminano microrganismi di fagocitosi, la degranulazione e la generazione di ossigeno reattivo (ROS) specie1. In presenza di batteri o endotossine, neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), composto di cromatina extracellulare decorato con gli istoni e proteine granulari come elastasi e mieloperossidasi (MPO)2. Anche se le reti sono indispensabili proprietà antimicrobiche, crescenti evidenze sperimentali e cliniche suggerisce che troppo zelante formazione netta durante la sepsi può condurre a più organo disfunzione e morte3,4, 5 , 6.
Poiché le reti possono svolgere un simile ruolo patofisiologico nei cani, gli interventi terapeutici che prevenire o diminuiscono formazione netta possono servire da nuove strategie terapeutiche in animali settici. Per questo motivo, c'è la necessità di una tecnica affidabile valutare e quantificare i componenti netti nei cani e NETosis. NET componenti tra cui DNA libero (cfDNA) e nucleosomi sono state valutate in precedenza in neutrofili canini e plasma dai clinici cani7,8,9. Facendo uso delle analisi di fluorescenza, Goggs e Letendre trovato che settici cani hanno livelli elevati di cfDNA rispetto a cani sani,8. Anche se queste tecniche sono altamente oggettiva e quantitativa, misura di cfDNA e nucleosomi come marcatori di NETosis è non specifica, poiché essi possono essere derivate da cellule necrotiche diverso da NETosing neutrofili. Qui descriviamo una tecnica che utilizza la microscopia di fluorescenza per esaminare i comportamenti dei neutrofili NETosing dal vivo. Dettagliamo anche un protocollo modificato utilizzando double-immunolabeling soggettivamente quantificare le reti e i loro componenti quali MPO e citH3 in neutrofili canini10.

<table><tbody><tr><td>Destrano da Leuconostoc spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Peso molecolare 450.000 - 650.000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>con cationi bivalenti</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Senza cationi bivalenti</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Colorazione fluorescente arancione dell'acido nucleico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM in DMSO; colorazione in cellule con membrane permeabili</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Colorazione fluorescente dell'acido nucleico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM in DMSO; colorazioni in cellule con membrane intatte</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti rivestiti di poli-D-lisina</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>diametro 12 mm</td></tr><tr><td>Anticorpo H3 istone anti-citrullinato</td><td>Abcam Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Frammenti di capra non coniugati anti-coniglio</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Specificità: IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-mieloperossidasi</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilina (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In risposta ad agenti patogeni d'invasione, neutrofili rilasciare trappole extracellulari del neutrofilo (reti), che sono reti extracellulare del DNA decorato con gli istoni e proteine antimicrobiche. Eccessiva formazione netta (NETosis) e citH3 rilascio durante la sepsi è associato con più disfunzione dell'organo e la mortalità nei topi e nell'uomo ma le sue implicazioni nei cani sono sconosciuti. Qui, descriviamo una tecnica per isolare canini neutrofili dal sangue intero per l'osservazione e la quantificazione dei NETosis. Plasma leucocita-ricco, generato dalla sedimentazione del dextrano, è separato dai mezzi di comunicazione di commercialmente disponibile densità gradiente separazione e granulociti raccolti per conteggio e test di vitalità delle cellule. Per osservare in tempo reale NETosis dal vivo dei neutrofili, cellule permeante e macchie fluorescenti impermeant dell'acido nucleico cellulare vengono aggiunti ai neutrofili attivati da lipopolisaccaride (LPS) o phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA). Cambiamenti nella morfologia nucleare e formazione netta sono osservati nel corso del tempo da microscopia di fluorescenza. In vitro NETosis è ulteriormente caratterizzata da co-colocalizzazione di DNA libero (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) e citrullinato istone H3 (citH3) utilizzando un protocollo modificato di doppio-immunolabelling. Per quantificare oggettivamente formazione netta e citH3 espressione utilizzando la microscopia a fluorescenza, reti e cellule citH3-positive sono quantificate in un modo accecato utilizzando il software disponibile. Questa tecnica è un dosaggio specifico per valutare la capacità in vitro dei neutrofili canini di subire NETosis.

Usando questo protocollo dell'imaging di cellule vive, gli investigatori possono osservare la morfologia nucleare, l'integrità della membrana del plasma e la presenza di cfDNA vivente dei neutrofili. Un colorante nucleare impermeant cella macchie acidi nuclei rosso in cellule con membrane cellulari danneggiate. Un altro colorante cellulare-permeante, etichette sugli acidi nucleici intracellulare in cellule vive con le membrane intatte di plasma. Tutti i neutrofili intatti, indipendentemen...

Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Questo metodo può rispondere a domande chiave sulla trappola extracellulare dei neutrofili o sulla formazione di NET nei cani o in altre specie. I principali vantaggi di queste tecniche includono la rilevazione in tempo reale della formazione di NET e l'identificazione di componenti NET come la perossidasi lieve e l'istone H3 citrullinato. Inizia prelevando da 10 a 20 millilitri di sangue dalla vena giugulare di un donatore canino sano, rimuovendo l'ago dalla siringa prima di erogare il sangue in tubi di eparina di sodio per evitare un'eccessiva condivisione. Capovolgere delicatamente le provette alcune volte per garantire un'adeguata miscelazione del sangue e dell'anticoagulante e verificare la presenza di coaguli e aggregati di globuli rossi prima di mettere i campioni sul ghiaccio.Diluire il sangue anticoagulato con un volume uguale di PBS di Dulbecco ghiacciato e trasferire otto millilitri di sangue diluito in una provetta conica in polipropilene da 50 millilitri contenente 25 millilitri di destrano filtrato al 3%. Posizionare la provetta in posizione verticale per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire l'aggregazione e la sedimentazione degli eritrociti. Quindi sovrapporre con cura cinque millilitri di plasma ricco di leucociti sopra cinque millilitri di terreno a gradiente di densità in un tubo a fondo tondo in polipropilene da 14 millilitri.Dopo la centrifugazione in gradiente di densità, utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per trasferire lo strato di cellule granulocitarie intermedie in una conica da 50 millilitri e lisare gli eritrociti coaspirati con le cellule polimorfonucleate con 20 millilitri di acqua fredda e ultrapura. Capovolgere delicatamente la provetta per 30-60 secondi per garantire un'adeguata lisi prima di lavare le cellule in un volume uguale di soluzione ghiacciata di cloruro di sodio all'1,8%. Dopo aver capovolto la provetta alcune volte, centrifugare a quattro gradi Celsius.Utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere con cura il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 100 microlitri di tampone per colture cellulari. Conta e conferma la loro fattibilità con l'esclusione del trypan blue. Quindi diluire i neutrofili a una volta dieci o sei cellule per millilitro di concentrazione di tampone di coltura cellulare.È essenziale utilizzare una tecnica sterile adeguata e maneggiare i neutrofili con cura durante tutto il processo di isolamento, poiché la contaminazione e le forze di taglio possono portare alla necrosi in vitro e alla lisi cellulare. Per visualizzare i neutrofili mediante microscopia a fluorescenza, aggiungere da 200 a 400 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti rivestita di poli-L-lisina per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quando i neutrofili si sono attaccati al fondo dei pozzetti, etichettare le cellule con un colorante fluorescente di acido nucleico adatto per 10 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, attivare i neutrofili con 100 microgrammi per millilitro di LPS, 100 nanomolari di PMA come controllo positivo, o un volume equivalente di tampone di coltura cellulare come controllo negativo a 37 gradi Celsius. Quindi visualizzare le colture di neutrofili mediante microscopia a fluorescenza a un ingrandimento di 40 volte nei punti temporali indicati. Per una quantificazione NET, posizionare con cura i vetrini coprioggetto rivestiti di poli-D-lisina di 18 millimetri di diametro nei singoli pozzetti di una piastra di coltura a 12 pozzetti ed etichettare i pozzetti in base allo stimolo sperimentale.Quindi seminare da 100 a 200 microlitri di neutrofili isolati direttamente sui vetrini coprioggetti per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quando i neutrofili hanno aderito ai vetrini, attivare i neutrofili in ciascun pozzetto con LPS, PMA o DPBS per 180 minuti, come appena dimostrato. Durante gli ultimi 30 minuti dell'incubazione, sovrapporre un foglio di pellicola di paraffina su un supporto per provette per creare pozzetti poco profondi e aggiungere due o tre gocce di paraformaldeide al 4% a ciascun pozzetto.Etichettare i pozzetti come sperimentalmente appropriati e utilizzare una pinza fine per trasferire delicatamente i vetrini coprioggetti da ciascun pozzetto della piastra capovolto sul pozzetto riempito di PFA corrispondente appropriato. Dopo 20 minuti a temperatura ambiente, lavare le celle fisse tre volte per cinque minuti in due o tre gocce di soluzione salina tamponata per lavaggio, spostando le celle da un pozzetto di DPBS all'altro. Per permeabilizzare le cellule, stendere delicatamente i vetrini coprioggetti a testa in giù su una goccia di 1%NP-40 per un minuto, seguita da tre lavaggi salini tamponati di un minuto su un bilanciere.Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare i vetrini coprioggetti a testa in giù in 100-200 microlitri di siero di capra al 5% in piastre di Petri etichettate singolarmente e rivestite con pellicola di paraffina di plastica fresca per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius con oscillazione. Al termine dell'incubazione bloccante, lavare i vetrini coprioggetti tre volte in soluzione salina tamponata con oscillazione come appena dimostrato. Trasferire i vetrini coprioggetti in singole piastre di Petri rivestite con film di paraffina di plastica in 50-100 microlitri dell'anticorpo appropriato di interesse per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius con oscillazione.Dopo il lavaggio, incubare i vetrini coprioggetti con l'anticorpo secondario coniugato con fluorofori appropriato per un'ora a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione dell'anticorpo secondario, lavare i vetrini tre volte in soluzione salina tamponata al buio con oscillazione seguita da colorazione con colorante di acido nucleico con DAPI per cinque minuti al buio a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi salini tamponati di un minuto al buio con oscillazione, applicare una goccia da 50 microlitri di terreno di montaggio antisbiadimento su un vetrino per campione e montare con cura ogni vetrino asciutto capovolto su una goccia di terreno di montaggio.Quindi lasciare che i campioni polimerizzino durante la notte a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. La mattina successiva, ottieni 10 immagini casuali da diverse regioni di ogni vetrino coprioggetti con un ingrandimento di 40 volte. Tutti i neutrofili intatti, indipendentemente dal trattamento, dovrebbero apparire verdi e mostrare i caratteristici nuclei lobulati da zero a 30 minuti dopo la stimolazione.A circa 90 minuti, i nuclei dei neutrofili trattati con PMA iniziano a perdere il loro aspetto lobulato e continuano a decondensarsi fino al rilascio di DNA libero da cellule. L'LPS, uno stimolante più lento e fisiologico dei neutrofili canini, in genere non provoca decondensazione della cromatina o NETosi fino a 90 minuti dopo la stimolazione. Entro 120 minuti, i neutrofili attivati da LPS e PMA possono essere visti circondati da DNA libero da cellule.Rispetto alle cellule stimolate con LPS, più neutrofili attivati da PMA perdono l'integrità della membrana plasmatica, come evidenziato dalla loro colorazione con colorante impermeante cellulare. I neutrofili non stimolati dovrebbero mantenere i nuclei lobulati e le membrane plasmatiche intatte per tutto il periodo di incubazione. I neutrofili stimolati da LPS per 180 minuti, producono discreti scaffold NET simili a ragnatele in prossimità dei neutrofili vicini.Al contrario, i neutrofili attivati da PMA producono grandi quantità di NET che sono notevolmente più grandi in area. Infatti, la PMA, un potente stimolante di un enzima che catalizza l'istone H3 citrullinato citrullinato componente essenziale della NET, induce un numero maggiore di cellule che esprimono l'istone H3 citrullinato intracellulare rispetto ai neutrofili non stimolati e stimolati da LPS. Durante l'esecuzione di questo test, è estremamente importante che l'operatore che acquisisce e analizza le immagini del microscopio sia cieco rispetto alle condizioni sperimentali per mantenere una valutazione obiettiva del test.La metà di queste procedure ha i loro saggi, come l'ELISA o la citometria a flusso, che possono essere eseguiti per quantificare ulteriormente l'istone H3 citrullinato nelle cellule. Non dimenticare di includere controlli negativi costituiti da neutrofili non stimolati o neutrofili trattati con l'inibitore della peptidil arginina, la crolide amidina. Si consiglia inoltre di testare diverse diluizioni di anticorpi primari e secondari per ridurre al minimo i legami e le interferenze aspecifiche.

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Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Questo video dimostra l'induzione e la visualizzazione di trappole extracellulari neutrofile o NET in neutrofili pre-marcati utilizzando siero paziente contenente anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili. Inoltre, l'utilizzo di un colorante di DNA impermeabile e della microscopia a fluorescenza consente la visualizzazione dei NET.

Induzione e visualizzazione di trappole extracellulari di neutrofili in neutrofili pre-marcati

trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono reti di DNA, istoni e proteine ​​neutrofili. Sebbene un componente della risposta immunitaria innata, NET sono implicati in autoimmunità e trombosi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'isolamento dei neutrofili canina e la quantificazione di NET utilizzando un saggio micropiastra fluorescenza.

Un semplice test di fluorescenza per la quantificazione del Canine neutrofili extracellulare Trappola di uscita

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di trappole extracellulari neutrode (NETT) e il funzionamento di NETQUANT, un'opzione software completamente automatica per la quantificazione dei NET nelle immagini di immunofluorescenza.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Questo protocollo descrive un'analisi di trappola extracellulari del neutrofilo (NET) altamente sensibile e ad alto rendimento per la quantificazione semiautomatizzata di ex vivo NET formazione mediante microscopia confocale tridimensionale di immunofluorescenza. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la formazione netta e degrado dopo stimoli diversi e può essere utilizzato per lo studio di potenziali terapie mirate al NET.

Un'analisi di High-throughput per valutare e quantificare la trappola extracellulari del neutrofilo formazione

Le trappole extracellulari neutrofilo (NET) sono strutture tridimensionali generate da granulociti neutrofili stimolati. È diventato chiaro negli ultimi anni che i NET sono coinvolti in una vasta gamma di malattie. Il rilevamento di RETI nei tessuti può avere rilevanza diagnostica, quindi sono necessari protocolli standardizzati per l'etichettatura dei componenti NET.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Descriviamo un metodo per identificare le trappole extracellulari neutrofiche (NET) nei trombi arteriosi cardiogenici felini fissi e incorporati in parina di formaldeide utilizzando il recupero di antigeni indotti dal calore e un doppio protocollo di immunoetichettatura.

Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza

Presentato qui è un protocollo per l'induzione e l'analisi di trappole extracellulari (NET) di neutrofili in vitro . La quantificazione del DNA, della catelicidina (LL37) e dell'attività enzimatica ha prodotto dati che mostrano la variabilità nella composizione e morfologia dei NET indotta da stimoli microbici e chimici in condizioni controllate simili.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono associate a varie malattie e l'immunofluorescenza viene spesso utilizzata per la loro visualizzazione. Tuttavia, esistono vari protocolli di colorazione e, in molti casi, viene esaminato un solo tipo di tessuto. Qui, stabiliamo un protocollo generalmente applicabile per la colorazione dei NET nel topo e nel tessuto umano.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Questo protocollo definito descrive un approccio di microscopia ad alto rendimento in tempo reale per visualizzare e quantificare il rilascio di trappole extracellulari (NET) di neutrofili umani in vitro. Il metodo riproducibile consente di studiare le caratteristiche e la cinetica del rilascio di NET dopo stimolazione con induttori distinti di NETosi e consente di valutare la farmacologia degli antagonisti di NETosi.

Quantificazione microscopica in tempo reale e ad alto rendimento del rilascio di trappole extracellulari di neutrofili umani e valutazione della farmacologia degli antagonisti

Scopri come isolare neutrofili canini dal sangue e visualizzare la formazione di NET in tempo reale mediante microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente di quantificare citH3 e studiare le funzioni dei neutrofili in vivo.

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal

In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

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