Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano
16 novembre 2018
Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come dove le cellule staminali del follicolo dentale umano potrebbero essere geneticamente progettate per migliorare le loro proprietà terapeutiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule staminali possono essere modificate con l'introduzione di microRNA senza il rischio di un'integrazione stabile del genoma. Iniziare la procedura per la digestione enzimatica dei due follicoli, prerifabbturando a temperatura ambiente, le cellule staminali del follicolo dentale umano o il mezzo di coltura hDFSC e la soluzione PBSPSG.
Scongelare un'aliquota ciascuna delle soluzioni stock collagenasi di tipo I e Dispasi II. Preparare una soluzione di digestione aggiungendo 500 microlitri della soluzione stock di collagenasi di tipo I e 500 microlitri della soluzione stock di Dispasi II a 4 millilitri di Basal Medium contenenti 1%di agente antibiotico. Per evitare la contaminazione del sito durante l'isolamento delle cellule staminali dentali umane, i tamponi di lavaggio e i mezzi di coltura utilizzati devono contenere agenti antibiotici.
Posizionare un follicolo dentale estratto in una piastra di Petri sterile. Aggiungere 10 millilitri di soluzione PBSPSG per lavare il tessuto estratto. Aspirare e scartare la soluzione e aggiungere una fresca soluzione PBSPSG per ripetere il lavaggio.
Usando un bisturi sterile tritare il follicolo estratto in pezzi se circa 1 per 1 millimetro. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione PBSPSG dalla piastra di Petri in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri, lavare la piastra di Petri con 10 millilitri di soluzione PBSPSG e trasferire la soluzione nello stesso tubo. Centrifugare il tubo conico a 353 x g a temperatura ambiente per dieci minuti.
Aggiungere 5 millilitri di soluzione di digestione al tessuto pallettizzato, mescolare delicatamente la soluzione e il tessuto, incubare la miscela a 37 gradi celsius e 5%CO2 in un'incubatrice di scuotimento per due ore. Dopo due ore, centrifugare la sospensione di cellule e tessuti digerita a 353 g per dieci minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pallet ottenuto in 6 millilitri di mezzo di coltura HDFSC.
Seedare la sospensione cellulare in un pallone da coltura cellulare di 25 centimetri quadrati e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo la raccolta cellulare e la caratterizzazione dell'HDFSC è come descritto nel protocollo di testo, i hDFSC di semi in una piastra di coltura cellulare da 24 po '. Incubare a 37 gradi celsius, 5%CO2 e 20%Ossigeno per 24 ore.
Il giorno seguente diluire 40 picomoli di microRNA in 66,7 microlitri di mezzo siero ridotto e vortice la soluzione. Diluire 0,67 microlitri a base di lipidi cationici, reagente di trasfezione in 66,7 microlitri di mezzo sierico ridotto, vortice la soluzione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti aggiungere il microRNA predilutato al reagente di trasfezione prediluto, mescolare la soluzione e incubare a temperatura ambiente per quindici minuti.
Quindi, aggiungere le complessità di trasfezione preparate, dropwise, direttamente al mezzo di coltura sulle cellule. Mescolare delicatamente dondolando la piastra di coltura cellulare di 24 pozzi avanti e indietro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore.
24 ore dopo la trasfezione, raccogliere il supernatante di campioni nei rispettivi tubi di centrifuga conica da 15 millilitri. Lavare le celle con 1 millilitro di PBS e trasferire il PBS nel rispettivo tubo di centrifuga. Aggiungere 500 microlitri di gocciolamenti ed EDTA alle cellule e incubare la piastra del pozzo 24 a 37 gradi celsius, per 3 minuti.
Interrompere la tripsininazione aggiungendo 1 millilitro di mezzo di coltura cellulare per le cellule e trasferendo la soluzione nel rispettivo tubo di centrifuga. Centrifugare le cellule a 300 x g e 4 gradi Celsius per dieci minuti. Da qui in poi tenere le cellule e i reagenti sul ghiaccio, salvo diversa indicazione.
Scartare il supernatante, rimescolare le cellule in 100 microlitri di tampone di colorazione e trasferire la soluzione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere 0,5 millilitri di colorante reattivo all'ammina a ciascun campione per distinguere tra cellule vive e morte. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare a 4 gradi celsius per dieci minuti.
Aggiungere 1 millilitro di PBS alle cellule e centrifugare a 300 g e 4 gradi celsius per dieci minuti Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di PBS, aggiungere 33 microlitri di paraformaldeide e mescolare le soluzioni, conservare i campioni a 4 gradi celsius protetti dalla luce fino alle misurazioni citometriche del flusso. Trasferire i campioni in tubi adatti alle misurazioni citometriche del flusso ed eseguire la citometria del flusso utilizzando la strategia di gating descritta nel protocollo di testo. Le cellule staminali del follicolo dentale umano isolato mostravano tutte le caratteristiche descritte per la definizione di cellule stromali mesenchimali, le cellule erano aderenti alla plastica e mostravano una morfologia simile alla fibra di vetro, in condizioni di coltura standard.
L'analisi citometrica del flusso ha rivelato che gli hDFSC esprimerono un pannello di alcuni antigeni di superficie, tra cui CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105. Mentre CD45 e CD117 erano assenti. I potenziali di differenziazione adipogenica, osteogenica e condrogenica delle cellule in specifiche condizioni di coltura in vitro sono stati confermati dall'immunostaining, una proteina legante gli acidi grassi per:Osteocalcina e Aggrecan.
La strategia di gating utilizzata per la quantificazione della citotossicità e dell'efficienza di assorbimento del microRNA etichettato Cy3 24 ore dopo la trasfezione, ha confermato l'assorbimento di microRNA nel 100% delle cellule vitali. Quantità comparabili di cellule morte in campioni trasfettati e non trasfettati indicano che il microRNA viene introdotto in modo efficiente senza effetti citotossici. Seguendo questa procedura, altri metodi come la transdifferenziazione possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la plasticità di Cytolab.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria di cellule staminali dentali isolate dal follicolo dentale umano. Il metodo consente la modifica delle cellule staminali mediante l'introduzione di microRNA, senza i rischi associati all'integrazione stabile nel genoma.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Medicina Rigenerativa
- Biologia delle Cellule Staminali
Sfondo
- Le cellule staminali del follicolo dentale umano (hDFSC) hanno potenziali applicazioni terapeutiche.
- L'ingegneria genetica può potenziare le proprietà di queste cellule staminali.
- Le strategie di modifica non virali sono alternative più sicure rispetto ai metodi tradizionali.
Scopo dello studio
- Studiare l'ingegneria genetica delle hDFSC per migliorare i risultati terapeutici.
- Stabilire un protocollo per la modifica transitoria delle cellule staminali dentali.
Metodi Utilizzati
- Digestione enzimatica dei follicoli dentali.
- Preparazione della soluzione di digestione con Collagenasi di tipo I e Dispasi II.
- Uso di agenti antibiotici nei tamponi di lavaggio e nei mezzi di coltura per prevenire contaminazioni.
- Introduzione di microRNA per modificazione genetica transitoria.
Risultati principali
- È stata raggiunta una modificazione transitoria con successo delle hDFSC.
- Il metodo ha dimostrato sicurezza evitando l'integrazione stabile nel genoma.
- Sono state osservate proprietà terapeutiche migliorate nelle cellule staminali.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce una base per migliorare le terapie con cellule staminali.
- L'ingegneria genetica transitoria può rappresentare un approccio valido nella medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente una modificazione genetica transitoria delle cellule staminali del follicolo dentale umano mediante microRNA, senza integrazione stabile nel genoma, affrontando una questione chiave di sicurezza nelle terapie basate su cellule staminali. L'approccio facilita la riduzione del rischio preclinico, permettendo la validazione funzionale di potenziamenti terapeutici prima del trapianto. Fornisce un metodo scalabile e non virale per ottimizzare l'efficacia delle cellule staminali in applicazioni di medicina rigenerativa.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione funzionale dei percorsi mediati da microRNA nel comportamento delle cellule staminali e nel loro potenziale differenziativo.
- Valore operativo: Fornisce un metodo affidabile per modulare il fenotipo delle cellule staminali senza alterazioni genomiche, supportando la validazione ipotesi-guidata dei bersagli.
- Valore predittivo: Facilita la valutazione del meccanismo terapeutico attraverso variazioni fenotipiche transitorie, migliorando la fiducia nella selezione dei candidati principali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera popolazioni standardizzate di cellule staminali pronte per la trasfezione, utili per schermature di composti o modulatori in modo costante.
- Valore operativo: Fornisce letture quantificabili dell'assorbimento di microRNA e della vitalità tramite citometria a flusso, consentendo la riproducibilità del saggio tra diversi laboratori.
- Scalabilità: Utilizza una trasfezione con lipidi cationici compatibile con formati a piastre multipozzetto, adatta a flussi di lavoro di schermatura a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta il passaggio da cellule staminali isolate a cellule funzionalmente modificate per test di efficacia preclinica.
- De-risking meccanicistico: Permette di valutare gli effetti dei microRNA sulla funzione delle cellule staminali senza i rischi associati alla mutagenesi da inserzione.
- Sistema rilevante per le malattie: Utilizza il follicolo dentale postnatale come fonte accessibile di cellule staminali multipotenti con elevato potenziale proliferativo, utile per la modellizzazione della riparazione dei tessuti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo un passaggio di modifica transitoria dopo l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule staminali, consentendo un'ottimizzazione funzionale prima delle applicazioni successive.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sul destino e sul comportamento delle cellule staminali mediante l'introduzione controllata di microRNA.
- Screening: Permette la preparazione standardizzata di cellule staminali per la valutazione di modulatori genetici o farmacologici in formati a pozzetti multipli.
- Analisi: Fornisce una quantificazione basata sulla citometria a flusso dell'efficienza di trasfezione e della citotossicità, consentendo un confronto oggettivo tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega l'isolamento delle cellule staminali alla validazione preclinica generando cellule modificate con potenziale terapeutico migliorato.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di trasfezione riutilizzabile, applicabile a diversi tipi di cellule staminali e a vari candidati microRNA.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle terapie con cellule staminali consentendo una modulazione transitoria e reversibile dell'espressione genica.
- Valore operativo: Offre un metodo di trasfezione non virale sicuro, efficiente e riproducibile, con effetti citotossici minimi.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico in fase avanzata permettendo la valutazione preclinica del meccanismo senza i pericoli legati all'integrazione genomica.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sul rischio dei candidati terapeutici a base di cellule staminali attraverso una validazione funzionale prima degli studi abilitanti alla richiesta di autorizzazione sperimentale (IND).
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella dissociazione enzimatica dei tessuti e nelle tecniche di trasfezione.
- Necessita dell'accesso a incubatori orbitali, citometri a flusso e infrastrutture standard per la coltura cellulare.
- Richiede la standardizzazione dei rapporti tra reagenti di trasfezione e dei tempi di incubazione tra diversi gruppi di lavoro per garantire la riproducibilità.
- Richiede l'adattamento della dose di microRNA e delle condizioni di trasfezione a seconda della fonte o della specie delle cellule staminali.
- Limitato a effetti transitori; non adatto ad applicazioni che richiedono una modificazione genetica stabile.
