Name: Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Scopri come modificare geneticamente le cellule staminali del follicolo dentale umano mediante introduzione di microRNA senza rischi di integrazione genomica stabile. Questo protocollo sicuro migliora le proprietà terapeutiche per la medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato supportato dal foro con. rar programma di il Rostock University Medical Centre (889018) e la Fondazione umida (2016-11). In aggiunta, P.M. e R.D. sono supportati da BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs sono isolati dai follicoli dentali dei denti del giudizio estratti forniti dal dipartimento di chirurgia orale e maxillo-facciale plastica Rostock University Medical Center. Approvazione scritta e consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. Questo studio è stato autorizzato dal comitato etico locale dell'Università di Rostock (autorizzazione No. A 2017-0158).
1. isolamento di hDFSCs
Nota: Per evitare la contaminazione batterica, denti del giudizio non dovrebbe essere scoppiati prima dell'estrazione
<ol><li>
Preparazione delle soluzioni richieste
	<ol>
<li>Preparare il tampone fosfato salino (PBS) / soluzione di penicillina-streptomicina-glutamina (P-S-G): mescolare 495 mL di PBS con 5 mL di soluzione di P-S-G. Conservare le aliquote da 50 mL a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare il terreno di coltura di hDFSC: mescolare 445 mL di sostanza basale con 5 mL di agente antibiotico e 50 mL di siero bovino fetale (FBS). Conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare collagenasi tipo stock soluzione (30 mg/mL): diluire 300 mg di tipo collagenosi io in 10 mL di sostanza basale completato con agente antibiotico 1%. Agitare energicamente la soluzione. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 µm. Le aliquote di negozio di 500 µ l di collagenasi di tipo I soluzione di riserva a-20 ° C.</li>
		<li>Preparare la soluzione di riserva Dispase II (40 mg/mL): diluire 40 mg di Dispase II in 10 mL di basale supplementato con agente antibiotico 1%. Agitare energicamente la soluzione. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 µm. Conservare le aliquote di 500 µ l di soluzione di riserva Dispase II a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedura chirurgica
	<ol>
<li>Iniettare una quantità sufficiente (massimo: 2 mL) di anestetico locale.</li>
		<li>Creare e generare una falda mucoperiosteal tre lati. Non è necessario sollevare un lembo linguale.</li>
		<li>Proteggere l'aspetto linguale con un Scollaperiostio.</li>
		<li>Delicatamente mulino buccale e distale dell'osso con una bava di metallo dura rotonda.</li>
		<li>Allentare il tessuto del follicolo con un Scollaperiostio. Rimuovere con cautela il dente completo (germe) e follicolo estraendo la corona (e follicolo) con una pinza posteriore (terzo molare).</li>
		<li>Sbrigliare e irrigare la presa accuratamente con soluzione di NaCl.</li>
		<li>Sostituire la falda mucoperiosteal con punti di sutura vicryl (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Rimuovere il follicolo dente dalla cavità orale e inserirli in un'aliquota di 50 mL di soluzione di PBS/P-S-G. Nota: Il campione può essere conservato a 4 ° C fino a ulteriore elaborazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Digestione enzimatica del follicolo di dente
	<ol>
<li>Pre-riscaldare il terreno di coltura hDFSC e soluzione di PBS/P-S-G a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Scongelare, un'aliquota di ciascun tipo di collagenasi io e soluzioni di riserva Dispase II. Preparare una soluzione di digestione di 3mg/mL collagenasi di tipo I e 4 mg/mL Dispase II aggiungendo 500 µ l di ogni collagenasi di tipo I e la soluzione di riserva Dispase II a 4 mL di medium basale contenente 1% agente antibiotico.</li>
		<li>Posizionare il follicolo Estratto in una capsula di Petri sterile e aggiungere 10 mL di soluzione di PBS/P-S-G per lavare il tessuto Estratto. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.</li>
		<li>Tritare il follicolo Estratto a pezzi di circa 1 mm x 1 mm con un bisturi sterile all'interno della capsula di Petri contenente 10 mL di soluzione di PBS/P-S-G.</li>
		<li>Trasferimento del tessuto macinato e soluzione di PBS/P-S-G da di Petri in una provetta conica per centrifuga da 50 mL. Lavare la capsula di Petri con 10 mL di soluzione di PBS/P-S-G e trasferire la soluzione nella provetta stessa.</li>
		<li>Centrifugare la provetta conica per centrifuga per 10 min a 353 x g a RT e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di soluzione di digestione al tessuto pellettato. Mescolare delicatamente il tessuto e la soluzione. Incubare la miscela a 37 ° C e 5% di CO2 per 2 h in un incubatore d'agitazione.</li>
		<li>Centrifuga digerito sospensione di cellule/tessuti a 353 x g per 10 min a RT. scartare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 6 mL di terreno di coltura di hDFSC.</li>
		<li>Sospensione di cellule di seme in un 25 cm2 cellulare cultura pallone e incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 e 20% O2. Nota: Se il tessuto non è completamente digerito, trasferire il tessuto restante nel matraccio di cultura cellulare pure.</li>
		<li>Sostituire il terreno con attenzione 24h dopo la semina delle cellule. In seguito sostituire il terreno ogni tre giorni fino alla confluenza. Nota: HDFSCs dovrebbe essere plastica-aderente 24 h dopo la semina delle cellule e possono essere separati da cellule non aderenti e componenti del sangue, semplicemente cambiando il mezzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cella di raccolta
	<ol>
<li>Pre-riscaldare il terreno di coltura di hDFSC, soluzione di PBS/P-S-G e soluzione di tripsina/Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) a RT.</li>
		<li>Scartare il surnatante da matraccio di cultura e lavare le cellule confluenti con 5 mL di soluzione di PBS/P-S-G.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA il matraccio di cultura e incubare per 3 min a 37 ° C. Interrompere il processo di digestione con l'aggiunta di 3 mL di terreno di coltura di hDFSC nel matraccio di cultura.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga a fondo conico da 15 mL e centrifugare la sospensione per 10 min a 353 x g a RT. scartare il supernatante e risospendere il pellet in una quantità appropriata di terreno di coltura di hDFSC.</li>
		<li>Contare le celle: mescolare delicatamente 10 µ l di sospensione cellulare con 10 µ l di soluzione di blu di Trypan. Applicare 10 µ l in una camera di conteggio e calcolare la quantità di cellule hDFSC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caratterizzazione di hDFSCs
<ol><li>
Immunophenotyping
	<ol>
<li>Preparazione delle cellule per l'analisi cytometric di flusso<ol>
<li>Preparazione delle soluzioni richieste<ol>
<li>Preparare PBS/EDTA (2 mM): mescolare 996 mL di PBS con 4 mL di EDTA (0,5 M).</li>
				<li>Preparare il tampone colorazione: mescolare 995 mL di PBS/EDTA (2 mM) con 5 g di BSA. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 µm e conservare a 4 ° C fino al momento d'uso.</li>
				<li>Preparare la soluzione di riserva di paraformaldeide (PFA) (4%): diluire 4G PFA in 100 mL di PBS e riscaldare la soluzione a 80 ° C. Miscelare la soluzione e regolare il pH a 7,3. Aliquota ottenuti soluzione PFA in rispettivi importi (1,5 mL) e conservare a-20 ° C fino a quando l'utilizzo. Attenzione: Poiché PFA fumi sono tossici, preparare la soluzione PFA in una cappa ventilata.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Dopo cella di raccolta (1,4), trasferire 14 campioni di 5 x 104 celle in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare le sospensioni a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata. Tenere le celle e reagenti il ghiaccio se non diversamente specificato.</li>
			<li>Risospendere le cellule in determinate quantità di macchiatura tampone (4 ° C) e aggiungere FcR blocco reagente (4 ° C) come indicato nella tabella 1.</li>
			<li>Aggiungere i seguenti anticorpi sul lato interno del rispettivo campione come indicato nella tabella 1: Allophycocyanin (APC) del mouse anti-umano CD29; Mouse APC controllo di isotipo IgG1 κ; Proteina peridinin-clorofilla (PerCP)-Cyanine5.5 murino anti-umano CD44; PerCP-Cyanine5.5 mouse controllo di isotipo κ IgG2b; V500 murino anti-umano CD45; V500 mouse controllo di isotipo IgG1 κ; Ficoeritrina (PE) murino anti-umano CD73; Mouse PE controllo di isotipo IgG1 κ; PerCP-Cyanine5.5 murino anti-umano CD90; PerCP-Cyanine5.5 mouse controllo di isotipo IgG1 κ; del mouse CD105 anti-umano: Alexa Fluor (AF) 488; il controllo negativo IgG1 del mouse: AF488; PE-Cyanine7 murino anti-umano CD117; PE-Cyanine7 mouse IgG1, controllo di isotipo κ. Dopo che gli anticorpi sono stati aggiunti a ciascun campione, rotazione verso il basso gli anticorpi e mescolare delicatamente. Incubare le soluzioni per 10 min a 4 ° C.</li>
			<li>Aggiungere 1 mL di PBS (4 ° C) e centrifugare i campioni a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
			<li>Risospendere le cellule in 100 µ l di PBS (4 ° C) e µ l 33 di PFA (4%). Mescolare le soluzioni e conservare in ghiaccio o a 4 ° C fino a quando l'analisi cytometric di flusso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Misura di cytometric di flusso delle cellule Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata. Mantenere le cellule su ghiaccio fino a misura.<ol>
<li>Per esaminare l'espressione degli antigeni di superficie, è possibile trasferire campioni in tubi adatti per misure di cytometric di flusso.</li>
			<li>Misurare almeno 2 x 104 eventi utilizzando un citometro a flusso. Analizzare come raffigurato in Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Potenziale di differenziazione multipotente di hDFSCs
	<ol>
<li>Utilizzare un Kit disponibile in commercio umano Mesenchymal Stem Cell funzionale identificazione per confermare adipogenico, osteogenico e potenziale di differenziazione condrogenica di hDFSCs. Applicare anticorpo secondario di asino anti-capra AF488 per la macchiatura della proteina dell'acido grasso 4 (FABP4) e Aggrecano così come anticorpo secondario di asino anti-topo AF488 per la colorazione dell'osteocalcina. Per la colorazione dei nuclei, utilizzare il mezzo di montaggio con 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI). Nota: Preparare i campioni senza anticorpo primario come controlli negativi per analisi al microscopio.</li>
		<li>Analizzare l'espressione delle proteine mediante microscopia confocale a scansione laser. Impostazioni di microscopia: obiettivo 40x con olio da immersione; eccitazione laser 488 nm (per AF488) e 405 nm (per DAPI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. la transfezione di hDFSCs
<ol><li>Dopo cella di raccolta (1,4), seme hDFSCs su una piastra di coltura cellulare 24 pozzetti 24 h prima di transfezione. Nota: A partire di densità delle cellule è circa 4 x 104 cellule per pozzetto. Cellule dovrebbero raggiungere la confluenza di ~ 80% giorno di transfezione. Nota: Campione di cellule supplementari di un seme come controllo per analisi cytometric di flusso.</li>
	<li>Preparazione di complessi di transfezione Nota: Per evitare la contaminazione da RNasi, pulire l'area di lavoro direttamente prima della preparazione di complessi di transfezione usando la soluzione di decontaminazione di RNAsi. Utilizzare solo materiale privo di RNAsi e soluzioni. Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata.<ol>
<li>Preparare la soluzione di riserva di miR (50 µM): risospendere miR precursore Cy3-etichettati (nmol 5) in acqua priva di nucleasi di 100 µ l. Soluzione di riserva di aliquota miR ottenuti in rispettivi importi (5 µ l) e conservare al buio a-20 ° C fino a quando l'utilizzo.</li>
		<li>Diluire 40 pmol di miR (0,8 µ l della soluzione madre miR 50 µM) in 66,7 µ l di siero riduttore terreno. Mescolare delicatamente la soluzione</li>
		<li>Diluire 0,67 µ l di reagente di transfezione basata sui lipidi cationici in 66,7 µ l di siero riduttore terreno. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare per 5 minuti a TA.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, aggiungere il reagente di transfezione pre-diluito il miR pre-diluito. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare per 15 minuti a TA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere goccia a goccia i complessi di transfezione preparati direttamente al terreno di coltura sulle cellule. Mescolare delicatamente a dondolo avanti e indietro la piastra di coltura cellulare 24 pozzetti.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2e 20% O2 per 24 h.</li>
</ol>4. analisi di transfezione
Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata.
<ol><li>
Cella di raccolta dopo la trasfezione Nota: Raccogliere tutte le soluzioni di cella di un campione nella stessa provetta conica da 15 mL.<ol>
<li>24 ore dopo la trasfezione, raccogliere il surnatante di campioni nelle rispettive provette.</li>
		<li>Lavare le cellule con 1 mL di PBS, trasferire PBS nella provetta da centrifuga rispettivi e aggiungere 500 µ l tripsina/EDTA (RT) alle cellule. Incubare le soluzioni per 3 min a 37 ° C.</li>
		<li>Fermare trypsinization aggiungendo 1 mL di terreno di coltura (RT) alle cellule e trasferire la soluzione nella provetta da centrifuga rispettivi. Cellule di centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Nota: Da questo momento, è necessario tenere le celle e reagenti il ghiaccio se non diversamente specificato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione delle cellule per l'analisi cytometric di flusso
	<ol>
<li>Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 µ l di buffer di colorazione (4 ° C) e soluzione di cella di trasferimento in una microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 µ l di coloranti reattivi ammina ai campioni al fine di distinguere tra cellule vivi e morte. Delicatamente mescolare la soluzione e incubare per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di PBS (4 ° C) alle cellule e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 100 µ l di PBS (4 ° C) e µ l 33 di PFA (4%). Mescolare le soluzioni e conservare in ghiaccio o a 4 ° C fino a quando l'analisi cytometric di flusso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Misura di cytometric di flusso delle cellule Nota: Eseguire le operazioni seguenti in una camera piuttosto ombreggiata. Mantenere le cellule su ghiaccio fino a misura.<ol>
<li>Trasferire i campioni in tubi adatti per misure di cytometric di flusso.</li>
		<li>Esaminare la vitalità cellulare e l'efficienza di assorbimento di miR utilizzando un citometro a flusso. Misurare almeno 2 x 104 eventi. Utilizzare la strategia di gating raffigurata nella Figura 4. Nota: Utilizzare cellule untransfected come controllo negativo per organizzare il gating per cellule positive Cy3 e calcolare la morte delle cellule causata dalla transfezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Cellule staminali adulte sono attualmente a fuoco per il trattamento di parecchie malattie degeneranti. In particolare, dell'osso midollo osseo (BM)-cellule staminali, tra cui le cellule staminali ematopoietiche (HSCs) e MSCs, sono sotto indagine clinica intensiva47. Tuttavia, BM raccolta è una procedura invasiva, causando dolore al sito di donazione e può portare a eventi avversi48. Recentemente, il tessuto dentale postnatale è emerso come un romanzo e una fonte facilmente...

Il follicolo dentale umano è un derivato ectomesenchymally tessuto connettivo che circonda il dente in via di sviluppo1,2. Al lato della sua funzione di coordinamento osteoclastogenesi e osteogenesi per il processo di eruzione dei denti, questo tessuto nutre le cellule staminali e progenitrici soprattutto per lo sviluppo del parodonto3,4,5. Di conseguenza, il follicolo dentale è considerato come una fonte alternativa per la raccolta di cellule staminali adulte umane6,7.
Diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali del follicolo dentale umano (hDFSCs) sono in grado di differenziarsi in lignaggio parodontale tra cui osteoblasti, fibroblasti del legamento e cementoblasti8,9,10 . Inoltre, queste cellule sono state indicate per abbinare tutte le caratteristiche delle cellule stromali mesenchimali (MSCs) tra cui capacità di auto-propagarsi, plastica aderenza, espressione di marcatori di superficie specifici (ad esempio, CD73, CD90, CD105) anche come osteogenica, adipogenico e condrogenica differenziazione potenziali11,12,13. Altri studi hanno anche rivelato un potenziale di differenziazione neurale di hDFSCs2,14,15,16,17,18.
A causa di loro proprietà promettente e un facile accesso, hDFSCs è diventato recentemente relativo per tessuto ingegneria19,20,21. I primi studi concentrano sulle potenzialità del DFSCs per rigenerare osso, parodontale e19,22,23,24,25,26, radici di dente 27,28,29,30. Poiché la conoscenza delle capacità neurogena di hDFSCs, loro applicazione come trattamento potenziale per le malattie neurodegenerative è stato indagato31,32,33. HDFSCs hanno anche acquisito importanza rispetto alla la rigenerazione di altri tessuti (ad es., epitelio corneale)34,35. Il potenziale terapeutico di hDFSC non si basa solo sul loro potenziale di differenziazione diretto, ma anche sulla loro attività paracrina. Recentemente, hDFSCs sono stati indicati a secernere una ricchezza di fattori bioattivi, come metalloproteinasi della matrice (MMPs), fattore di crescita insulino-simile (IGF), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF) e crescita dell'epatocita Factor (HGF), che svolgono un ruolo cruciale per l'angiogenesi, immunomodulazione, rimodellamento della matrice extracellulare e processi riparativi36.
Tuttavia, ampio traduzione clinica della terapia con cellule staminali è ancora compromessa da diverse sfide, come la morte iniziale massiccia delle cellule e cellule staminali benefico basso effetti37,38. Ingegneria genetica fornisce una strategia promettente per affrontare queste sfide e di conseguenza può migliorare notevolmente l'efficacia terapeutica delle cellule staminali38,39,40. Per manipolazione cellulare transitoria, microRNA (miRs) sono candidati adatti, come questi piccoli regolatori traduzionali controllano il destino e il comportamento delle cellule staminali senza il pericolo di genoma stabile integrazione41,42, 43. ad oggi, sono stati identificati diversi benefici miRs promuovere la proliferazione delle cellule staminali, sopravvivenza, homing, attività paracrina, nonché la loro differenziazione in diversi lignaggi44. Per esempio, miR-133a ingegnerizzato MSCs ha mostrato un aumento della sopravvivenza e l'attecchimento nei cuori del ratto colpito da infarto conseguente a un miglioramento della funzione cardiaca rispetto ai non modificato MSCs45. Allo stesso modo, miR-146a overesprimenti MSCs sono stati indicati per secernono una maggiore quantità di VEGF che a sua volta ha condotto ad una migliorata efficienza terapeutica nel tessuto ischemico46.
Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per l'estrazione selettiva e dell'ingegneria genetica di hDFSCs. Per questo scopo, abbiamo descritto la digestione enzimatica e raccolta dei follicoli dentali umane nonché l'isolamento successivo di hDFSCs. Per caratterizzare le cellule isolate, importanti istruzioni per la verifica delle proprietà MSC sono state incluse in conformità con le linee guida della società internazionale per la terapia cellulare13. Inoltre, forniamo una descrizione dettagliata per la generazione di hDFSCs miR-modificato applicando una strategia di trasfezione basata sui lipidi cationici e la valutazione di efficienza di trasfezione e citotossicità.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-umano CD105 di topo: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Clone SN6, monoclonale</td></tr><tr><td>di topo IgG1 Anticorpo di controllo negativo: Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>monoclonale</td></tr><tr><td>APC Topo Anticorpo CD29 anti-umano</td><td>BD Biosciences</td><td>559883</td><td>Clone MAR4, monoclonale</td></tr><tr><td>APC IgG1 di topo, &kappa; Anticorpo per il controllo dell'isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>clone MOPC-21, monoclonale</td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>Clone AD2, PE monoclonale</td></tr><tr><td>IgG1 di topo, &kappa; Anticorpo per il controllo</td><td>dell'isotipo BD Biosciences</td><td>555749</td><td>clone MOPC-21, monoclonale</td></tr><tr><td>PE-Cy7 topo anti-umano CD117 Anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>clone 104D2, monoclonale</td></tr><tr><td>PE-Cy7 IgG1 di topo, &kappa; Anticorpo per il controllo</td><td>dell'isotipo BD Biosciences</td><td>557872</td><td>Clone MOPC-21, monoclonale</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Anticorpo umano CD44 di topo</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>Clone G44-26, monoclonale</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 IgG2b di topo, &kappa; Anticorpo per il controllo dell'isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone 27-35, monoclonale</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Topo Anti-Umano CD90&nbsp; Anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>Clone 5E10, monoclonale</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 IgG1 di topo, &kappa; Anticorpo per il controllo</td><td>dell'isotipo BD Biosciences</td><td>55095</td><td>Clone MOPC-21, monoclonale</td></tr><tr><td>V500 Topo Anti-Umano CD45 Anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>560777</td><td>Clone HI30, monoclonale</td></tr><tr><td>V500 IgG1 di topo, &kappa; Anticorpo per il controllo</td><td>dell'isotipo BD Biosciences</td><td>560787</td><td>Clone X40, reagente bloccante FcR monoclonale</td></tr><tr><td>, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0,5 M, pH 8,0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0,22 &; m, radio-sterilizzato, polietersulfone</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>Kit di identificazione funzionale delle cellule staminali mesenchimali umane</td><td>R& D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione con RNasi; RNaseZap Soluzione di decontaminazione con RNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Precursore miR marcato con Cy3; Cy3 Dye-Marcato Pre-miR Controllo negativo #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA Precursor Controllo negativo #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17110</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione cationico a base di lipidi; Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Terreno sierico ridotto; Opti-MEM I Siero Ridotto Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-IgG di capra (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>anticorpo secondario policlonale</td></tr><tr><td>Asino anti-Topo IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>terreno di montaggio policlonale</td></tr><tr><td>; Fluoroshield con DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>Terreno di montaggio istologico</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII Citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ZEN2011</td><td>Soluzione Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (0,05%/ 0,02%)</td><td>Biochrom</td><td>L2143</td><td>in PBS, s/o: Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>Colorante reattivo all'ammina; VIVO/MORTO & COMMERCIO; Kit Macchia Cellule Morte Vicino IR Fissabile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH: 7,4; s/o: Ca e Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Terreno basale; Dulbecco's Modified Eagle Miscela di Mezzi/Nutrienti F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico, ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Filtro, filtro per siringa Sterifix 0,2 & micro; m</td><td>Braun</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; mL provetta da centrifuga conica</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL provetta da centrifuga conica</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833.910.002</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari, 25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833.911.002</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di congelamento, Biofreeze</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>Thermo Fisher Scientific 377267</td><td></td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>Camera di conteggio</td><td>Paul Marienfeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestetico locale, Xilocitina (lidocaina cloridrato) 2% con epinefrina (adrenalina) 0,001%</td><td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl soluzione</td><td>Braun</td><td></td><td>0,9 %</td></tr> <tr><td>Vicryl saturi, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

isolamento, caratterizzazione e microrna-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Ad oggi, diversi tipi di cellule staminali a diversi stadi di sviluppo sono nel fuoco per il trattamento di malattie degenerative. Ancora, alcuni aspetti, ad esempio iniziale massiccia delle cellule morte e bassi effetti terapeutici, alterato la loro ampia traduzione clinica. Ingegneria genetica delle cellule staminali prima del trapianto è emerso come un metodo promettente per ottimizzare gli effetti terapeutici delle cellule staminali. Tuttavia, mancano ancora sistemi di consegna del gene sicuro ed efficiente. Pertanto, lo sviluppo di metodi adatti può fornire un approccio per risolvere le sfide attuali in terapie basate sulle cellule staminali.
Il presente protocollo descrive l'estrazione e caratterizzazione di cellule staminali umane follicolo dentale (hDFSCs) così come loro modificazione genetica non-virali. Il follicolo dentale postnatale ha presentato come una fonte promettente e facilmente accessibile per la raccolta di cellule staminali adulte multipotenti che possiede potenziale elevata proliferazione. La procedura di isolamento descritto presenta un metodo semplice e affidabile per la raccolta hDFSCs da denti del giudizio. Anche questo protocollo comprende i metodi per definire le caratteristiche di cellule staminali di cellule isolate. Per l'ingegneria genetica di hDFSCs, una strategia di trasfezione basata sui lipidi cationici ottimizzato è presentata abilitazione microRNA altamente efficiente introduzione senza causare effetti citotossici. I microRNA sono candidati adatti per la manipolazione di transitoria delle cellule, come questi piccoli regolatori traduzionali controllano il destino e il comportamento delle cellule staminali senza il pericolo di integrazione del genoma stabile. Così, questo protocollo rappresenta una procedura sicura ed efficiente per l'ingegneria di hDFSCs che potrebbe diventare importante per ottimizzare la loro efficacia terapeutica.

Qui, presentiamo un istruzioni dettagliate isolamento per raccogliere hDFSCs dal tessuto umano del follicolo dentale. A causa del facile accesso del follicolo dentale durante l'intervento chirurgico di routine, è una fonte di promessa per l'estrazione di cellule staminali adulte.
Il hDFSCs isolato ha mostrato tutte le caratteristiche descritte per la definizione di MSCs13. Infatti, le cellule erano plasti...

Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come dove le cellule staminali del follicolo dentale umano potrebbero essere geneticamente progettate per migliorare le loro proprietà terapeutiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule staminali possono essere modificate con l'introduzione di microRNA senza il rischio di un'integrazione stabile del genoma. Iniziare la procedura per la digestione enzimatica dei due follicoli, prerifabbturando a temperatura ambiente, le cellule staminali del follicolo dentale umano o il mezzo di coltura hDFSC e la soluzione PBSPSG.Scongelare un'aliquota ciascuna delle soluzioni stock collagenasi di tipo I e Dispasi II. Preparare una soluzione di digestione aggiungendo 500 microlitri della soluzione stock di collagenasi di tipo I e 500 microlitri della soluzione stock di Dispasi II a 4 millilitri di Basal Medium contenenti 1%di agente antibiotico. Per evitare la contaminazione del sito durante l'isolamento delle cellule staminali dentali umane, i tamponi di lavaggio e i mezzi di coltura utilizzati devono contenere agenti antibiotici.Posizionare un follicolo dentale estratto in una pias

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Il metodo descritto l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali dentali umane Pulp (hDPSCs)...

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Abbiamo stabilito una tecnica per l'isolamento, la caratterizzazione fenotipica e analisi funzionale di cellule immuni dalla gengiva murino.

Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

Qui presentiamo un protocollo per isolamento umano Dental Pulp Stem Cells e propagazione al fine di valutare l'espressione della proteina del prion durante il processo di differenziamento neuronale.

Isolamento, propagazione e l'espressione della proteina del Prion durante il differenziamento di cellule staminali polpa dentaria umana

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Il follicolo dentale contiene una popolazione epiteliale e cellule mesenchimali. La popolazione epiteliale è stata selezionata dalla popolazione eterogenea di cellule follicolari dentali fornendo un terreno di coltura distinto. Le cellule epiteliali sopravvissero e formarono colonie in un mezzo privo di siero.

Isolamento delle cellule epiteliali dal follicolo dentale umano

Questo articolo fornisce una guida passo passo per stabilire una coltura primaria di cellule staminali di polpa dentale utilizzando il metodo della coltura di espiantazione e la caratterizzazione di queste cellule in base alle linee guida ICSCRT. Le cellule isolate da questo protocollo possono essere considerate come cellule staminali mesenchimali per ulteriori applicazioni.

Coltura primaria di cellule staminali della polpa dentale

Questo protocollo enfatizza l'estrazione, la coltura e la conservazione di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale attraverso la digestione enzimatica. Inoltre, dimostra il loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti, evidenziando l'importanza della precisione e della coerenza nel processo.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani

L'isolamento delle MSCalteMFGE8 di BAMBI, uno dei tre principali sottogruppi che costituiscono UC-MSC umane eterogenee, è utile per comprendere appieno le caratteristiche e le funzioni di questo sottotipo per la sua futura applicazione per migliorare l'efficacia clinica in malattie specifiche. Qui, presentiamo un metodo per lo smistamento di BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Isolamento di cellule stromali mesenchimali umane derivate dal cordone ombelicalead altoMFGE8

Scopri come modificare geneticamente le cellule staminali del follicolo dentale umano mediante introduzione di microRNA senza rischi di integrazione genomica stabile. Questo protocollo sicuro migliora le proprietà terapeutiche per la medicina rigenerativa.

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

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