Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano
November 16th, 2018
Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come dove le cellule staminali del follicolo dentale umano potrebbero essere geneticamente progettate per migliorare le loro proprietà terapeutiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule staminali possono essere modificate con l'introduzione di microRNA senza il rischio di un'integrazione stabile del genoma. Iniziare la procedura per la digestione enzimatica dei due follicoli, prerifabbturando a temperatura ambiente, le cellule staminali del follicolo dentale umano o il mezzo di coltura hDFSC e la soluzione PBSPSG.
Scongelare un'aliquota ciascuna delle soluzioni stock collagenasi di tipo I e Dispasi II. Preparare una soluzione di digestione aggiungendo 500 microlitri della soluzione stock di collagenasi di tipo I e 500 microlitri della soluzione stock di Dispasi II a 4 millilitri di Basal Medium contenenti 1%di agente antibiotico. Per evitare la contaminazione del sito durante l'isolamento delle cellule staminali dentali umane, i tamponi di lavaggio e i mezzi di coltura utilizzati devono contenere agenti antibiotici.
Posizionare un follicolo dentale estratto in una piastra di Petri sterile. Aggiungere 10 millilitri di soluzione PBSPSG per lavare il tessuto estratto. Aspirare e scartare la soluzione e aggiungere una fresca soluzione PBSPSG per ripetere il lavaggio.
Usando un bisturi sterile tritare il follicolo estratto in pezzi se circa 1 per 1 millimetro. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione PBSPSG dalla piastra di Petri in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri, lavare la piastra di Petri con 10 millilitri di soluzione PBSPSG e trasferire la soluzione nello stesso tubo. Centrifugare il tubo conico a 353 x g a temperatura ambiente per dieci minuti.
Aggiungere 5 millilitri di soluzione di digestione al tessuto pallettizzato, mescolare delicatamente la soluzione e il tessuto, incubare la miscela a 37 gradi celsius e 5%CO2 in un'incubatrice di scuotimento per due ore. Dopo due ore, centrifugare la sospensione di cellule e tessuti digerita a 353 g per dieci minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pallet ottenuto in 6 millilitri di mezzo di coltura HDFSC.
Seedare la sospensione cellulare in un pallone da coltura cellulare di 25 centimetri quadrati e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo la raccolta cellulare e la caratterizzazione dell'HDFSC è come descritto nel protocollo di testo, i hDFSC di semi in una piastra di coltura cellulare da 24 po '. Incubare a 37 gradi celsius, 5%CO2 e 20%Ossigeno per 24 ore.
Il giorno seguente diluire 40 picomoli di microRNA in 66,7 microlitri di mezzo siero ridotto e vortice la soluzione. Diluire 0,67 microlitri a base di lipidi cationici, reagente di trasfezione in 66,7 microlitri di mezzo sierico ridotto, vortice la soluzione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti aggiungere il microRNA predilutato al reagente di trasfezione prediluto, mescolare la soluzione e incubare a temperatura ambiente per quindici minuti.
Quindi, aggiungere le complessità di trasfezione preparate, dropwise, direttamente al mezzo di coltura sulle cellule. Mescolare delicatamente dondolando la piastra di coltura cellulare di 24 pozzi avanti e indietro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore.
24 ore dopo la trasfezione, raccogliere il supernatante di campioni nei rispettivi tubi di centrifuga conica da 15 millilitri. Lavare le celle con 1 millilitro di PBS e trasferire il PBS nel rispettivo tubo di centrifuga. Aggiungere 500 microlitri di gocciolamenti ed EDTA alle cellule e incubare la piastra del pozzo 24 a 37 gradi celsius, per 3 minuti.
Interrompere la tripsininazione aggiungendo 1 millilitro di mezzo di coltura cellulare per le cellule e trasferendo la soluzione nel rispettivo tubo di centrifuga. Centrifugare le cellule a 300 x g e 4 gradi Celsius per dieci minuti. Da qui in poi tenere le cellule e i reagenti sul ghiaccio, salvo diversa indicazione.
Scartare il supernatante, rimescolare le cellule in 100 microlitri di tampone di colorazione e trasferire la soluzione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere 0,5 millilitri di colorante reattivo all'ammina a ciascun campione per distinguere tra cellule vive e morte. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare a 4 gradi celsius per dieci minuti.
Aggiungere 1 millilitro di PBS alle cellule e centrifugare a 300 g e 4 gradi celsius per dieci minuti Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di PBS, aggiungere 33 microlitri di paraformaldeide e mescolare le soluzioni, conservare i campioni a 4 gradi celsius protetti dalla luce fino alle misurazioni citometriche del flusso. Trasferire i campioni in tubi adatti alle misurazioni citometriche del flusso ed eseguire la citometria del flusso utilizzando la strategia di gating descritta nel protocollo di testo. Le cellule staminali del follicolo dentale umano isolato mostravano tutte le caratteristiche descritte per la definizione di cellule stromali mesenchimali, le cellule erano aderenti alla plastica e mostravano una morfologia simile alla fibra di vetro, in condizioni di coltura standard.
L'analisi citometrica del flusso ha rivelato che gli hDFSC esprimerono un pannello di alcuni antigeni di superficie, tra cui CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105. Mentre CD45 e CD117 erano assenti. I potenziali di differenziazione adipogenica, osteogenica e condrogenica delle cellule in specifiche condizioni di coltura in vitro sono stati confermati dall'immunostaining, una proteina legante gli acidi grassi per:Osteocalcina e Aggrecan.
La strategia di gating utilizzata per la quantificazione della citotossicità e dell'efficienza di assorbimento del microRNA etichettato Cy3 24 ore dopo la trasfezione, ha confermato l'assorbimento di microRNA nel 100% delle cellule vitali. Quantità comparabili di cellule morte in campioni trasfettati e non trasfettati indicano che il microRNA viene introdotto in modo efficiente senza effetti citotossici. Seguendo questa procedura, altri metodi come la transdifferenziazione possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la plasticità di Cytolab.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratte dal follicolo dentale umano. Il metodo consente la modifica delle cellule staminali mediante l'introduzione di microRNA senza i rischi associati all'integrazione stabile del genoma.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Medicina rigenerativa
- Biologia delle cellule staminali
Contesto
- Le cellule staminali del follicolo dentale umano (hDFSC) hanno potenziali applicazioni terapeutiche.
- L'ingegneria genetica può migliorare le proprietà di queste cellule staminali.
- Le strategie di modifica non virali sono alternative più sicure ai metodi tradizionali.
Obiettivo dello studio
- Esplorare l'ingegneria genetica delle hDFSC per ottenere risultati terapeutici migliori.
- Stabilire un protocollo per la modifica transitoria delle cellule staminali dentali.
Metodi utilizzati
- Digerzione enzimatica dei follicoli dentali.
- Preparazione della soluzione di digestione con Collagenasi tipo I e Dispase II.
- Utilizzo di agenti antibiotici nei buffer di lavaggio e nei mezzi di coltura per prevenire la contaminazione.
- Introduzione di microRNA per la modifica genetica transitoria.
Risultati principali
- È stata ottenuta una modifica transitoria di successo delle hDFSC.
- Il metodo ha dimostrato sicurezza evitando l'integrazione stabile del genoma.
- Sono state osservate proprietà terapeutiche migliorate delle cellule staminali.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce una base per migliorare le terapie con cellule staminali.
- L'ingegneria genetica transitoria può essere un approccio valido nella medicina rigenerativa.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables transient genetic modification of human dental follicle stem cells using microRNA without stable genome integration, addressing a key safety concern in stem cell-based therapies. The approach supports preclinical de-risking by allowing functional validation of therapeutic enhancements prior to transplantation. It provides a scalable, non-viral method to optimize stem cell efficacy for regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of microRNA-mediated pathways in stem cell behavior and differentiation potential.
- Operational Value: Provides a reliable method to modulate stem cell phenotype without genomic alteration, supporting hypothesis-driven target validation.
- Predictive Value: Facilitates assessment of therapeutic mechanism through transient phenotypic changes, improving confidence in lead candidate selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, transfection-ready stem cell populations for consistent compound or modulator screening.
- Operational Value: Delivers quantifiable microRNA uptake and viability readouts via flow cytometry, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Uses cationic lipid transfection compatible with multi-well plate formats for medium-throughput screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from isolated stem cells to functionally modified cells for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of microRNA effects on stem cell function without insertional mutagenesis concerns.
- Disease-Relevant System: Utilizes postnatal dental follicle as an accessible source of multipotent stem cells with high proliferation potential for tissue repair modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing a transient modification step after stem cell isolation and characterization, enabling functional optimization before downstream applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell fate and behavior through controlled microRNA introduction.
- Screening: Enables standardized preparation of stem cells for evaluating genetic or pharmacological modulators in multi-well formats.
- Analytics: Provides flow cytometry-based quantification of transfection efficiency and cytotoxicity, supporting objective comparison of conditions.
- Translational Research: Bridges stem cell isolation and preclinical validation by generating modified cells with enhanced therapeutic potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transfection platform applicable to multiple stem cell types and microRNA candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in stem cell therapeutics by enabling transient, reversible modulation of gene expression.
- Operational Value: Offers a safe, efficient, and reproducible non-viral transfection method with minimal cytotoxic effects.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by allowing preclinical assessment of mechanism without genomic integration hazards.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of stem cell candidates through functional validation prior to IND-enabling studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, enzymatic tissue dissociation, and transfection techniques.
- Needs access to shaking incubators, flow cytometers, and standard cell culture infrastructure.
- Demands standardization of transfection reagent ratios and incubation times across teams for reproducibility.
- Requires adaptation of microRNA dosage and transfection conditions for different stem cell sources or species.
- Limited to transient effects; not suitable for applications requiring stable genetic modification.
