Visualizzazione di varianti genetiche, gli obiettivi di brevi e mutazioni puntiformi nel contesto morfologico del tessuto con una determinazione del RNA In Situ di ibridazione

Questo metodo può affrontare questioni chiave di ricerca nelle neuroscienze, nell'oncologia e oltre, come l'espressione specifica del tipo di cellula e la mappatura spaziale delle varianti di splicing all'interno del cervello e dei microambienti tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può rilevare giunzioni esoniche, sequenze corte e mutazioni puntiformi nel contesto tissutale con sensibilità e specificità molto elevate in singole cellule. A dimostrare la procedura sarà Hell Pimentel, uno scienziato associato del nostro laboratorio.

Per preparare il tessuto, fissarlo immediatamente dopo la dissezione in formalina tamponata neutra al 10% a temperatura ambiente per 16-32 ore. Successivamente, il campione viene processato e incorporato in paraffina utilizzando procedure standard. Tagliare il tessuto incorporato in cinque sezioni più o meno un micron usando un microtomo.

Montare le sezioni su vetrini adesivi elettrostaticamente e asciugare all'aria a temperatura ambiente per tutta la notte. Un'ora prima di eseguire il saggio di ibridazione dell'RNA NC2, posizionare i vetrini di tessuto montati in una griglia per vetrini e cuocere in un forno ad aria circolante a 60 gradi Celsius. Prima di iniziare il test di ibridazione dell'RNA NC2, assicurarsi che il forno di ibridazione sia impostato a 40 gradi Celsius.

Bagnare accuratamente la carta umidificante, rimuovere l'acqua residua e posizionare il coperchio sul vassoio di controllo dell'umidità. Preparare 200 millilitri di reagente per il recupero del bersaglio 1X disponibile in commercio aggiungendo 20 millilitri di reagente per il recupero del bersaglio 10X a 180 millilitri di acqua. Posizionare due supporti per guide in una vaporiera.

Riempire un supporto per vetrini con 200 millilitri di reagente per il recupero del bersaglio 1X e l'altro con 200 millilitri di acqua. Usando la vaporiera, scaldare entrambe le soluzioni a ebollizione. Riscaldare il tampone di lavaggio 50X a 40 gradi Celsius per 10-20 minuti.

Quindi preparare tre litri di tampone di lavaggio 1X diluendo 60 millilitri di tampone di lavaggio 50X preriscaldato con 2,94 litri di acqua. In una cappa aspirante, preparare il 50% della soluzione di controcolorazione dell'ematossilina di Gill aggiungendo 100 millilitri di ematossilina di Gill a 100 millilitri di acqua. Preparare il reagente azzurrante aggiungendo 1,43 millilitri di idrossido di ammonio dal 20 al 30% a 250 millilitri di acqua.

Preriscaldare le sonde target a 40 gradi Celsius per 10 minuti prima dell'ibridazione della sonda. Portare i sette reagenti di amplificazione, da 0 a 6, a temperatura ambiente. Iniziare la dispariffinizzazione del campione rimuovendo le sezioni dal forno e immergendo i vetrini di tessuto montati nello xilene agitando per cinque minuti.

Depariffinizzare nuovamente in xilene fresco per cinque minuti. Disidratare in etanolo al 100% agitando per due minuti. E ripetere di nuovo in etanolo fresco al 100% per due minuti.

Asciugare i vetrini all'aria a 60 gradi Celsius in un forno ad aria circolante per cinque minuti fino a quando non sono completamente asciutti. Successivamente, incubare le sezioni con circa quattro gocce di perossido di idrogeno pronto all'uso a temperatura ambiente per 10 minuti per estinguere l'attività della perossidasi endogena. Decantare la soluzione dai vetrini e sciacquarli due volte con acqua.

Immergere brevemente le sezioni nell'acqua preriscaldata e quindi immergere le sezioni in 200 millilitri del reagente di recupero del bersaglio a 100 gradi Celsius nella vaporiera per 15-30 minuti. Rimuovere i vetrini dal recupero del bersaglio e sciacquare due volte in acqua. Immergere in etanolo al 100% per tre minuti.

Quindi asciugare i vetrini a 60 gradi Celsius in un forno ad aria circolante fino a completa asciugatura. Una volta che i vetrini sono asciutti, utilizzare una penna idrofobica per disegnare una barriera idrofobica di circa 0,75 x 0,75 pollici attorno alla sezione. Lasciare asciugare completamente la barriera a temperatura ambiente per un minuto.

Posizionare i vetrini in un supporto per vetrini e posizionare il supporto per vetrini nel vassoio preriscaldato a umidità controllata. Aggiungere circa quattro gocce di proteasi 3 a ciascun vetrino e incubare a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione per 15-30 minuti. Decantare la soluzione dai vetrini e sciacquarli due volte con acqua.

Per iniziare la procedura di ibridazione della sonda, aggiungere circa quattro gocce della soluzione di sonda pronta all'uso appropriata per coprire l'intera sezione. Ibridare le sonde a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione per due ore. Decantare la soluzione dai vetrini e lavare i vetrini in 200 millilitri di tampone di lavaggio 1X a temperatura ambiente agitando di tanto in tanto per due minuti.

Ripetere la procedura di lavaggio. Il passo successivo consiste nell'amplificare il segnale incubando le sezioni in una serie di reagenti amplificatori. Aggiungere circa quattro gocce di Amp 0 per coprire l'intera sezione su ogni vetrino e incubare a 40 gradi Celsius nel forno di ibridazione per 30 minuti.

Quindi decantare la soluzione e lavare i vetrini in 200 millilitri di tampone di lavaggio 1X a temperatura ambiente agitando di tanto in tanto per due minuti. Ripetere la procedura di lavaggio. Allo stesso modo, incubare le sezioni da Amp 1 ad Amp 6 alla temperatura e per il tempo indicati in questo schema.

Dopo che i vetrini sono stati trattati con la serie di reagenti di amplificazione, preparare una soluzione di lavoro per colorante Fast Red. Aggiungere il volume appropriato di colorante Fast Red-B e Fast Red-A in un tubo e mescolare bene. Decantare il liquido in eccesso dai vetrini e aggiungere la soluzione di lavoro del colorante Fast Red ai vetrini.

Incubare i vetrini in un vassoio con coperchio a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo 10 minuti, decantare la soluzione Fast Red e sciacquare due volte i vetrini immergendoli su e giù con acqua di rubinetto. Per controcolorare le sezioni di tessuto, immergere i vetrini nella soluzione di ematossilina al 50% di Gill a temperatura ambiente per due minuti.

Lavare i vetrini con acqua di rubinetto, ripetendo l'operazione più volte fino a quando i vetrini sono chiari mentre le sezioni rimangono violacee. Immergere i vetrini in acqua di ammoniaca allo 02% due o tre volte per l'azzurramento. Sostituire l'acqua di ammoniaca con acqua di rubinetto e lavare i vetrini da tre a cinque volte.

Asciugare i vetrini in un forno ad aria circolante a 60 gradi Celsius per 15 minuti fino a completa asciugatura. Posizionare una o due gocce di reagente di montaggio su un vetrino coprioggetti e posizionare il vetrino sopra il vetrino coprioggetti evitando l'intrappolamento di bolle d'aria. Asciugare i vetrini all'aria per almeno cinque minuti.

Infine, osservare i vetrini con un microscopio a campo chiaro standard. Le sonde a doppia giunzione dell'esone Z sono state progettate per determinare lo stato dell'EGFRvIII in due campioni di glioblastoma FFPE fissati in formalina o con paraffina fissata. Entrambe le sonde wild type hanno rilevato un segnale in entrambi i campioni, indicando che i due campioni esprimono EGFR wild type.

Tuttavia, la sonda mutante ha rilevato il segnale solo nel campione EGFRvIII positivo e non nel campione EGFRvIII negativo. Nel test sono state incluse sonde di controllo positive e negative. Quando è stato eseguito un saggio short target su cellule Jurkat, preparate come pellet di cellule FFPE utilizzando sonde antisenso o senso, mirando le sequenze in rosso, è stata osservata una robusta colorazione con sonde antisenso sia per CDR3-alfa che per CDR3-beta, mentre le sonde di senso hanno rilevato poco o nessun segnale.

dapB è stato utilizzato come controllo negativo. Il test è anche in grado di rilevare mutazioni puntiformi. In questo esempio, sono state progettate due sonde, una per rilevare la sequenza EGFR mutata L858R e un'altra per rilevare la sequenza wild type EGFR L858.

La sonda mutante ha rilevato un segnale nella linea cellulare H1975, che è eterozigote per la mutazione EGFR L858R, ma non ha rilevato il segnale nella linea cellulare H2229, che esprime solo EGFR L858 wild type. La sonda wild type ha rilevato il segnale in entrambe le linee cellulari. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di fissare correttamente i tessuti, eseguire sonde di controllo positivo e negativo e utilizzare il sistema di elaborazione dei vetrini nel forno di ibridazione.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'IHC con marcatori cellulari per rispondere a ulteriori domande come l'identificazione dell'espressione specifica del tipo di cellula di varianti di splicing o brevi sequenze target. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in neuroscienze, oncologia e oltre per esplorare eventi di splicing alternativi nel contesto tissutale, identificando mutazioni puntiformi mappate spazialmente e visualizzando sequenze altamente omologhe e brevi in situ. Non dimenticare che lavorare con formalina tamponata neutra e xilene può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale.