Name: Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri un saggio in vitro per rilevare l'attività della tRNA-isopentenil transferasi usando enzimi ricombinanti purificati. Questo metodo semplice e diretto facilita la caratterizzazione biochimica delle modifiche dell'RNA.

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Vorremmo ringraziare il Dr. David Engelke per sua guida e utili commenti su questo manoscritto. PJS - fondi di avvio laboratorio Ball State University; DAB - concedere 1R15AI130950-01.

Nota: Il protocollo è stato adattato da rif. 24.
1. ottenere RNA e degli enzimi di interesse
<ol><li>Uso in vitro trascritti RNAs internamente etichettati con 32P e His6-Mod5 ricombinante espressa in e purificato da e. coli, come descritto in precedenza24.<ol>
<li>Introdurre in vitro trascritto RNAs (sezione 3) usando T7 RNA polimerasi in presenza di ATP senza etichetta, UTP, CTP, GTP e 10 µ ci di gel-purificato, etanolo-precipitata α-ATP, risospesi in 1 x TE (10 mM Tris-HCl a pH 7.5, 0.1 mM EDTA) e conservati a-80 ° C 24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In alternativa, ottenere commercialmente disponibile fluorescente contrassegnati RNA di interesse. Produrre gli enzimi di interesse in qualsiasi sistema di espressione preferito. Attenzione: Variabili interne fluorescente nel RNA possono alterare la struttura RNA e riconoscimento dagli enzimi.</li>
</ol>2. preparare un 20% poliacrilammide denaturante Gel
Nota: Al fine di ottenere una risoluzione sufficiente di frammenti di RNA, è consigliato un gel di lastra verticale di lunghezza 40 cm. La larghezza del gel utilizzato è determinata dal numero di campioni da analizzare.
<ol><li>Pulire accuratamente le lastre di vetro. In primo luogo, lavare con acqua e sapone, sciacquare bene con acqua deionizzata e infine pulire con isopropanolo e salviette privo di lanugine.</li>
	<li>Montare le piastre e i distanziali.</li>
	<li>Mescolare i seguenti reagenti per rendere 100 mL di 20% di acrilammide, 7,5 M urea, 1 x TBE gel: 80 mL di urea gel concentrato (237,5 g/L di acrilammide, 12,5 g/L di metilene bisacrylamide, 7,5 M urea in acqua deionizzata), 10 mL di diluente gel urea (7.5 m urea in acqua deionizzata) e 10 mL di buffer di urea gel (0,89 M Tris-borato-20 mM EDTA tampone pH 8.3 e 7,5 M di urea). Nota: Il volume di soluzione di gel deve essere regolato secondo le dimensioni del gel.</li>
	<li>Aggiungere 40 µ l di N, N, N′, N′-Tetrametiletilendiammina (TEMED) e 800 µ l di preparati 10% ammonio persolfato (APS).</li>
	<li>Aspirare la soluzione di gel in una grossa siringa ed erogare tra lastre di vetro. Toccare il vetro con le dita mentre versando per evitare la formazione di bolle.</li>
	<li>Consentire il gel per solidificare per 30 min.</li>
	<li>Morsetto solidificata gel sul gel verticale apparato utilizzando clip legante.</li>
	<li>Riempire il buffer superiore e inferiore camere con 1 x TBE.</li>
	<li>Due ore prima di caricare il gel, pre-corsa il gel a 20 mA, per 2 h consentire il limite di buffer correre più veloce i oligonucleotides più piccoli - in caso contrario il più piccolo nucleotidi e oligonucleotidi tendono a comprimere nella parte anteriore del tampone.</li>
</ol>3. RNA Isopentenylation Assay
<ol><li>Preparare le reazioni in un volume finale di 17 µ l, contenente 58 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1,2 mM ATP, 5,8 mM MgCl2, 0,2 mM DMAPP, inibitore di U di RNAsi 10 (ad esempio, SuperRNaseIn), 40.000 CPM internamente 32P-identificato RNA, 5,3 µM Mod5 e 1,2 mM 2 - mercaptoetanolo.</li>
	<li>Incubare le reazioni a 37 ° C per 1 h.</li>
	<li>Etanolo-precipitato RNAs utilizzando 2.5 volumi (42,5 µ l) di etanolo al 100% e 1/10 volumi (1,7 µ l) di 3,5 M sodio acetato pH 5.5 e posto a-20 ° C per 1 h o durante la notte.</li>
	<li>Centrifugare i campioni di RNA per 20 min a 15.400 x g e a 4 ° C.</li>
	<li>Con attenzione rimuovere il surnatante e lavare la pallina del RNA con 500 µ l di etanolo al 70%.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a per 5 min 15.400 x g e a 4° C.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il pellet di RNA surnatante e asciugare all'aria per 15 minuti, o fino a quando tutti i etanolo evaporato.</li>
	<li>Risospendere il pellet di RNA in 10 µ l di urea 8 M.</li>
	<li>Aggiungere 150 U di RNAsi T1 e incubare a 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di 6x loading buffer (60% glicerolo, 0.1% xilene cianolo).</li>
	<li>Caricare 10 µ l di ciascun campione di RNA su un pre-esecuzione, poliacrilammide del 20%, gel di 7.5 M urea (vedere la sezione 2 del protocollo). Nota: RNA radioattivo dimensioni scale possono essere incluse come un marcatore di mobilità supplementari.</li>
	<li>Esegua il gel per 2 h a 25 mA.</li>
	<li>Arrestino il gel e rimuovere dall'apparecchio.</li>
	<li>Pausa di tenuta tra le due lastre e rimuovere una delle lastre di vetro, con il gel rimanente sulla piastra "inferiore". Nota: fare attenzione per non strappare il gel durante questo passaggio.</li>
	<li>Mettere uno strato di pellicola trasparente sopra il gel ed esporre su uno schermo al fosforo per 3 h. in alternativa, mettere gel su carta cromatografia ed asciugare con un gel asciuga prima dell'esposizione dello schermo al fosforo.</li>
	<li>Immagine a schermo al fosforo su un imager di fosforo.</li>
</ol>

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<li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li>
</ol>

Nessuno di divulgare.

Modifiche di RNA continuano ad essere mostrato ai giocano un ruolo sempre più importante e diversificata in funzione cellulare e organismica. Come tale, lo sviluppo di saggi per interrogare RNA modificando gli enzimi è fondamentale per comprendere meglio gli aspetti fondamentali della biologia. Questo protocollo descrive un'analisi ad alta risoluzione in vitro per caratterizzare l'attività di modifica di tRNA di Mod5.
Questo protocollo ha il vantaggio di fornire una lettura diretta e ...

Modifiche RNA almeno 163 posttranscriptional distinte sono state identificate, con queste modifiche che conferisce funzioni diverse e dipendente dal contesto di RNAs, direttamente che influenzano la struttura di RNA e che interessano interazioni di RNA con altri molecole1,2. L'apprezzamento per il numero e la varietà di RNA modifiche aumenta, è fondamentale per sviluppare le analisi che possono interrogare in modo affidabile sia le modifiche di RNA e gli enzimi che catalizzano loro.
Si verifica una delle prime modifiche di RNA di essere identificato a base 37 in tRNAs, adiacente al anti-codone3,di lato per 3'4. Un gruppo di isopentenyl viene trasferito da dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) nella posizione di N6 di adenosina 37 (ho6A37) 3,5 su un sottoinsieme di tRNAs sia citoplasmiche e mitocondriali. Ho6A37 migliora la fedeltà di traduzione ed efficienza aumentando affinità di tRNA per il ribosoma4,6 e ho6A37 è importante per la risposta allo stress in batteri7. Gli enzimi che eseguire questa modifica sono definiti transferasi isopentenyl tRNA e sono altamente conservati in batteri8,9, funghi10, vermi11, piante12e più alti eucarioti13 , compreso gli esseri umani14.
Mutazioni nel gene umano di tRNA isopentenyl transferasi, TRIT1, sono associate con la malattia umana. Ad esempio, una mutazione in TRIT1 è correlata con una grave malattia mitocondriale, probabilmente causata da un difetto nella sintesi proteica mitocondriale15,16. Inoltre, TRIT1 è stato descritto come un tumore soppressore gene17,18 ed è implicata in parecchi tipi di cancri, compreso il melanoma19, seno20, gastrico21e cancri polmonari22 ,23. Infine, TRIT1 e Mod5 transferasi isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) sono soggette a aggregazione proteine che formano il prione-come le fibre amiloidi24,25,26. Queste osservazioni implicano potenzialmente transferasi di isopentenyl tRNA nelle malattie neurodegenerative, anche se la prova diretta per questa non è ancora stata dimostrata.
Dato il ruolo che isopentenyl transferasi giocare nella traduzione e nella malattia, metodi che misurano direttamente i6un'attività della transferasi di isopentenyl sono importanti per una comprensione meccanicistica di questi enzimi normali e Stati di malattia. Un crescente numero di metodi è disponibile per individuare i modifiche di RNA A6, compreso in vitro isopentenylation saggi, l'ibridazione positiva in assenza di i6saggi un (PHA6), cromatografia su strato (TLC), aminoacido di sottile analisi di attività di accettazione e approcci di spettrometria di massa (rivisto in rif. 4).
Un'analisi di isopentenylation in vitro è stato descritto che utilizza 14C-DMAPP e tRNAs senza etichetta. In questo saggio, carbonio radioattivo viene trasferito al RNA dal 14C-DMAPP mediante la transferasi di isopentenyl. Mentre questo test è altamente sensibile, è spesso difficile determinare il residuo specifico che è modificato9,20,27. Saggi PHA6 contare su una pesante modifica6A interferire con l'ibridazione di una 32P-labeled sonda che abbracciano il residuo modificato. Come tale, l'ibridazione è maggiore in assenza di una i6una modificazione18,28,29. PHA6 le analisi sono altamente sensibili e in grado di analizzare il RNA totale Estratto da lisati cellulari. Inoltre, la capacità di progettare le sonde specifiche per il RNA di interesse dà tutto questo metodo obiettivo sostanziale. Tuttavia, PHA6 saggi sono limitati alla caratterizzazione delle modificazioni che si verificano sui residui all'interno della regione di destinazione della sonda e pertanto sono meno propensi a identificare nuovi modifica siti. Inoltre, come assenza di associazione è indicativo di modificazione, altre modifiche o mutazioni che influenzano il legame al RNA saranno confondere l'analisi dei dati.
Un altro approccio combina cromatografia di cellulosa di benzile DEAE cellulosa (BD) con attività di accettazione dell'aminoacido come una lettura di i6A modifiche nel tRNA30. Questo approccio di analisi direttamente la funzione di i6A modifiche, ma è un approccio indiretto per individuare i6A modificazione e manca di risoluzione per mappare le modifiche ad un residuo specifico nel RNA. Un approccio di TLC è stato utilizzato per rilevare il tRNA totale ho6A modifiche. In questo approccio, internamente 32P-labeled tRNAs sono digeriti a singoli nucleotidi e analisi TLC bidimensionale viene utilizzato per identificare isopentenylation. Questo approccio è altamente sensibile nella rilevazione totale ho6A in un dato campione di RNA ma sulla digestione, tutte le informazioni di sequenza sono perse; così, l'investigatore non ha modo di determinare quali residui sono stati modificati31.
Più recentemente, sono stati sviluppati metodi liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che confronta quantitativamente le modifiche di RNA totale tra specie, tipi di cellule e condizioni sperimentali32,33, 34. Una limitazione di questa metodologia è che è meno in grado di determinare l'identità e la posizione all'interno di RNA da cui i nucleosidi modificati è stato derivato34. Inoltre, le competenze e le attrezzature necessarie per eseguire questi esperimenti limitare la praticità di questo approccio.
Inoltre, diverse tecnologie di sequenziamento di nuova generazione sono stati sviluppati per mappare RNA modifiche transcriptome livello34. Immunoprecipitazione di RNA con anticorpi specifici per una particolare modifica (RIP-Seq) permettono al ricercatore di identificare tutte le sequenze che contengono una modifica specifica35,36. Inoltre, gli approcci basati su trascrittasi inversa come sequenza di mancata corrispondenza non casuale e Chem-Seq si basano su perturbazioni della reazione di trascrizione inversa al residui modificate37,38,39. Nonostante il vantaggio di queste tecniche per mappare tutto il RNA modifiche del trascrittoma, RIP-seq e Chem-Seq tecnologie sono limitati dalla mancanza di anticorpi affidabili o sostanze chimiche reattive disponibili per ogni modifica specifica, rispettivamente34. Inoltre, gli enzimi trascrittasi inversa necessari per eseguire Chem-Seq e tecniche di sequenziamento di mancata corrispondenza non casuale possono essere ostacolate da strutture stabili di RNA. La natura altamente modificata e strutturalmente stabile di tRNAs li rendono particolarmente difficile interrogare usando queste tecniche. Ad oggi, tecnologie basate su sequenziamento di nuova generazione ancora non sono state utilizzate per mappare i6un modifiche34.
Qui, descriviamo un approccio semplice e diretto per individuare i6A tRNA modifiche in vitro. Questo metodo utilizza l'incubazione di RNA con ricombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasi (Mod5), seguita da digestione RNasi T1 e analisi di elettroforesi del gel 1-dimensionale per mappare i6A modifiche. Questo approccio è diretto e richiede competenze poco specializzata per analizzare i dati. Inoltre, questo metodo è adattabile ad altri RNA modificando gli enzimi, compreso gli enzimi che modificano covalentemente il peso molecolare di RNA o di mobilità di un RNA attraverso un gel.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UreaGel Concentrate</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Come parte di un kit</td></tr><tr><td>UreaGel Diluente</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Come parte di un kit</td></tr><tr><td>UreaGel Buffer</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Come parte di un kit</td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-833</td><td>Come parte di un kit</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiammina (TMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34369-07-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>DMAPP</td><td>Caymen Chemical</td><td>1186-30-7</td><td></td></tr><tr><td>Super RNaseIN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Xilene cianolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature e forniture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lastre di vetro corte (20-40 cm L x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre di vetro lunghe (20-40 cm L x 40 cm L)</td><td>The Gel Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio gel verticale</td><td>The Gel Company</td><td>S2-3040</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso da 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-26</td><td></td></tr><tr><td>Clip per legante in acciaio inossidabile</td><td>Idea Scientific</td><td>1066</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoscreen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Involucro di plastica</td> <td>(negozio di alimentari locale)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un test in vitro per rilevare attività di trna-isopentenyl transferase

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6- isopentenyladenosine RNA modifiche sono funzionalmente diversi e altamente conservata tra procarioti ed eucarioti. Una delle più altamente conservato N6- isopentenyladenosine modifiche si verifica la posizione A37 in un sottoinsieme di tRNA. Questa modifica migliora l'efficienza della traduzione e fedeltà aumentando l'affinità del tRNA per il ribosoma. Mutazione di enzimi responsabili di questa modifica negli eucarioti sono associate a diversi Stati di malattia, compreso cancro e la disfunzione mitocondriale. Pertanto, comprendere la specificità di substrato e attività biochimiche di questi enzimi è importante per la comprensione della biologia eucariotica normale e patologica. Una vasta gamma di metodi è stata impiegata per caratterizzare i6A modificazioni. Qui è descritto un approccio diretto per la rilevazione di isopentenylation di Mod5. Questo metodo utilizza l'incubazione di RNA con una transferasi di isopentenyl ricombinante, seguita da digestione RNasi T1 e analisi di elettroforesi del gel 1-dimensionale per individuare i6A modifiche. Inoltre, il potenziale adattabilità di questo protocollo per la caratterizzazione di altri enzimi modificanti la RNA è discussa.

Mod5 è stato incubato con una tirosina tRNA o serina tRNA in presenza o assenza di DMAPP. A seguito della reazione di modificazione, i prodotti erano RNasi T1-digerito, che cliva l'estremità 3' del guanosine tutti lasciando un 3' guanosina monofosfati (GMP)24 (Figura 1). Completa digestione degli RNA produce un modello prevedibile di frammenti radioattivi (Figura 2A), che poi vengono risol...

Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione biochimica dell'enzima modificante la RNA lievito, Mod5 e discutere come questo protocollo potrebbe essere applicato ad altri enzimi modificanti la RNA.

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di caratterizzare biochimicamente l'attività tRNA-Isopentenil Transferasi in vitro. Questo metodo è utile per il rilevamento e la caratterizzazione in vitro dell'attività tRNA-isopentenil transferasi degli enzimi ricombinanti purificati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un saggio semplice e diretto usato per rilevare una modifica covalente dell'RNA.Sebbene questo metodo fornisca informazioni sull'attività tRNA-isopentenil transferasi, è potenzialmente adattabile per la caratterizzazione biochimica di enzimi di modifica a vasta gamma o RNA. Il primo passo di questa procedura è pulire accuratamente le lastre di vetro che verranno utilizzate per la fusione del gel. Lavare i piatti con acqua e sapone, risciacquare bene con acqua deionizzata, quindi pulire i piatti con isopropanolo e salviette senza pelucchi.Quindi, assemblare le piastre e i distanziale. Mescolare i seguenti reagenti per fare un 100 millilitro 20%acrilammide, 7,5 urea molare, 1 gel TBE 1x. 80 millilitri di concentrato di gel di urea, 10 millilitri di diluente di gel di urea e 10 millilitri di tampone di gel di urea.Aggiungere alla miscela 40 microlitri

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