Caratterizzazione funzionale di Carboxylesterases in casa resistente all'insetticida mosche, Musca Domestica

Questo metodo può aiutare le domande chiave nel campo della tossicologia degli insetti, come ad esempio, se tutti esprimono i geni di disintossicazione metabolica sono coinvolti nella resistenza agli insetticidi? Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di produrre scale più grandi di proteine, e caratterizzare la funzione di queste proteine nella metabolizzazione degli insetticidi in vitro. A dimostrare le procedure, sarà Xuechun Feng, uno studente laureato nel mio laboratorio.

La ricerca di dottorato di Xuechen è focalizzata sulla caratterizzazione della funzione della carbossilesterasi nella resistenza ai parassiti delle mosche domestiche, Musca domestica. Per iniziare, mescola un microlitro di DNA plasmatico in ingresso GFP con cinque microlitri di DNA lineare C-term disponibile in commercio in provette PCR da 250 microlitri. Quindi, aggiungere due microlitri di miscela di ricombinazione lambda disponibile in commercio a ciascuna delle provette PCR.

Mescolare delicatamente le provette e incubarle a 25 gradi Celsius per una notte. Seminare due millilitri di coltura cellulare di insetto SF9 in fase logaritmica in modo uniforme nei pozzetti di una piastra di coltura cellulare. Quindi lasciare che le celle si attacchino per almeno tre ore a temperatura ambiente, nella cappa.

Utilizzando un microscopio a fase invertita a 250x, controllare l'attacco della cella. Quindi, rimuovere il terreno di coltura cellulare e sostituirlo con due millilitri di terreno per insetti di Grace. Successivamente, preparare le soluzioni di miscela di trasfezione A e B secondo il protocollo di testo.

Quindi mescolare delicatamente le miscele di trasfezione A e B picchiettando le provette. Incubare la miscela a temperatura ambiente, nella cappa, per 35 minuti. Quindi, aggiungi la miscela goccia a goccia, sulle cellule seminate.

Sigillare i pozzetti con del nastro adesivo e incubare le cellule a 27 gradi Celsius, durante la notte. Sostituisci i due millilitri di terreno per insetti di Grace, con due millilitri di terreno di coltura completo. Quindi, aggiungere 100 micromoli di Ganciclovir a ciascun pozzetto.

Sigillare i pozzetti con del nastro adesivo e incubare le cellule a 27 gradi Celsius per 72 ore. 72 ore dopo l'infezione, raccogliere il terreno da ciascun pozzetto e trasferirlo in provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare le provette a 1500 volte G, per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Aggiungere un millilitro di terreno di coltura completo al pozzetto e utilizzare un microscopio con luce fluorescente per osservare i segni di infezione delle cellule nella fase di amplificazione del baculovirus P1. Trasferire il surnatante in nuove provette da centrifuga da 1,5 millilitri e conservarle a quattro gradi Celsius, in condizioni di oscurità. Successivamente, seminare due millilitri di coltura cellulare di insetti SF9 in fase logaritmica, in modo uniforme, nei pozzetti di una piastra di coltura cellulare.

Lasciare attaccare le celle per almeno tre ore a temperatura ambiente, nella cappa. Inoculare cinque microlitri di stock di virus P1 nei pozzetti seminati nelle cellule, quindi aggiungere 100 micromoli di Ganciclovir a ciascun pozzetto. Sigillare i pozzetti e incubare le celle per 72 ore a 27 gradi Celsius.

In primo luogo, coltivare cinque millilitri di cellule di insetto SF9 in fase logaritmica, con terreno di crescita completo, in fiasche T25 non trattate. Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione madre del virus P1 per infettare la coltura cellulare, per 48 ore, agitando delicatamente, a 27 gradi Celsius. Utilizzando l'acetonitrile, preparare diluizioni seriali di 100 millimoli di permetrina.

Quindi, seminare 200 microlitri di coltura cellulare infetta integrata con 300 microlitri di terreno di coltura completo, in una piastra a 24 pozzetti. Assicurarsi che la permetrina sia completamente disciolta nell'acetonitrile e distribuita uniformemente in ciascun pozzetto della piastra. Dopo aver aggiunto la permetrina, agitare delicatamente la piastra per mescolare completamente la permetrina nel terreno.

Successivamente, sigillare la piastra con del nastro adesivo e incubare la piastra a 27 gradi Celsius, per 48 ore, in condizioni di oscurità. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalla piastra senza disturbare lo strato cellulare inferiore attaccato. Aggiungere 200 microlitri di reagente MMT in ogni pozzetto.

Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per quattro ore, fino a quando non si formano precipitanti formazan viola scuro in ogni pozzetto. Aggiungere 500 microlitri di DMSO in ogni pozzetto, per sciogliere completamente i precipitanti. Quindi trasferire 200 microlitri della soluzione disciolta, in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.

La dissoluzione completa del precipitato in DMSO è fondamentale per l'accuratezza dei risultati. Dopo aver aggiunto il DMSO ai campioni nella piastra, i campioni verranno lavati utilizzando la pipetta, per diverse volte, fino a quando il precipitato non sarà stato completamente sciolto. Infine, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare i valori di assorbanza della piastra a 540 nanometri.

Nella fase P1, il tasso di infezione è basso. Nella fase P2, il rapporto di infezione era significativamente migliorato. Nella fase di infezione da P3, quasi tutte le cellule mostravano sintomi di distacco dalla piastra di coltura cellulare, aumento del diametro cellulare e cessazione della crescita cellulare.

Sulla base dei valori di assorbanza rilevati, le cellule che esprimono Md alfa E7 hanno mostrato una vitalità significativamente più elevata rispetto alle cellule CAT di controllo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante prevenire la contaminazione cellulare in tutte le fasi, strofinando la superficie di materiali, come bottiglie e tubi, con etanolo al 70% prima di condurre gli esperimenti sulle cellule. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la modellazione dell'omologia e l'analisi del buio, per rispondere a ulteriori domande, come le interazioni tra la proteina carbossilesterasi e il ligando della permetrina.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della tossicologia degli insetti, per esplorare la caratterizzazione funzionale dei geni e dei meccanismi di resistenza agli insetticidi degli insetti. Non dimenticare che lavorare con l'insetticida può essere molto dannoso e che durante l'esecuzione di queste procedure è necessario prendere sempre precauzioni, come guanti e camici da laboratorio.