Name: Isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di Chlamydomonas centrioli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Impara a isolare e purificare centrioli da Chlamydomonas reinhardtii per microscopia a super-risoluzione. Questo metodo consente il posizionamento di proteine in regioni specifiche e si applica anche a centrioli umani e di paramecio.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Pierre Gönczy e bioimmagini & ottica piattaforma (BIOP) alla École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Svizzera, dove sono state acquisite le immagini SIM dei centrioli. Nikolai Klena e Davide Gambarotto sono supportati dall'European Research Council (ERC) a partire Grant (StG) 715289 (accento) e Maeva Le Guennec, Paul Guichard e Virginie Hamel dalla PP00P3_157517 di fondazione di scienza nazionale svizzero (FNS). Susanne Borgers è supportato dall'Università di Ginevra.

<ol><li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+in+cells+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li>
<li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+and+only+once%3A+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li>
<li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
<li>Gönczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li>
<li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+organization+and+centriole+architecture%3A+their+sensitivity+to+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li>
<li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113101/">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li>
<li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+basal+bodies+in+paramecium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461(1968).</li>
<li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li>
<li>Li, S., Fernandez, J. -J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li>
<li>Guichard, P., Chrétien, D., Marco, S., Tassin, A. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li>
<li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li>
<li>Hirono, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113102/">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li>
<li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li>
<li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li>
<li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li>
<li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li>
<li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529(1974).</li>
<li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus%3A+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326(2014).</li>
<li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813(2017).</li>
<li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li>
<li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li>
<li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/pdf/3143215.pdf?seq=1#page_scan_tab_contents">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li>
<li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li>
<li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth.f.392">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>de la Rosa-Trevín, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+3D-SIM%2FSMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+%E2%88%BC4-5+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li>
<li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+lytic+enzymes+%28autolysins%29+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+%28hydroxy%29proline-specific+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li>
<li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Una delle sfide in biologia è di decifrare la precisa localizzazione delle proteine in un contesto architettonico. Il Centriolo è una struttura ideale per applicare questi metodi, come la sua architettura è stata studiata usando la tomografia di cryo-elettrone, rivelando interessanti caratteristiche ultrastrutturali lungo la sua lunghezza. Tuttavia, grazie alle sue dimensioni vicino al limite di risoluzione in microscopia ottica, è difficile da localizzare con precisione una proteina dall'immunofluorescenza una regione sub-strutturali del Centriolo usando microscopi convenzionali30.
La risoluzione in microscopia ottica è limitata dalla diffrazione della luce che dà, all'incirca, una risoluzione laterale massima di 200 nm in microscopia ottica24. Tuttavia, questo limite è stato aggirato da una delle innovazioni più importanti degli ultimi 20 anni in microscopia ottica: l'invenzione di metodi di Super-risoluzione. Questi approcci possono immagine oltre i limiti di diffrazione a diverse risoluzioni: 120 nm per SIM, circa 50 nm per svuotamento stimolato dell'emissione (STED) e 20 – 40 nm per localizzazione singola molecola microscopia (SMLM)24. Con questi nuovi sviluppi della microscopia di Super-risoluzione, il sub-regioni strutturali del Centriolo sono raggiungibili. Tuttavia, in pratica, è ancora difficile da determinare con precisione la localizzazione di una proteina ad un elemento strutturale per il motivo principale che i centrioli maturi esistano in solo 2 copie per cellula e hanno orientamenti casuali, che rende l'interpretazione di localizzazione difficile. Per questo motivo, un protocollo è stato istituito che permette ai ricercatori di immagine di Super-risoluzione di un gran numero di centrioli, aumentando la possibilità di osservare gli orientamenti non ambiguo. Cosa importante, come questo metodo si basa sull'uso di centrioli isolati, stiamo fornendo un metodo per purificare intatto c. reinhardtii centrioli contenenti centrioli maturi e procentrioles.
Infine, grazie alla gamma di orientamenti Centriolo che può essere imaged con questo protocollo, analisi di singola particella può essere applicata utilizzando software di microscopia elettronica. Questo determina la generazione di classi media di centrioli con un determinato orientamento. D'importanza, queste immagini 2D risultanti quindi utilizzabile per valutare la localizzazione di una proteina specifica lungo il Centriolo. Infatti, questo metodo può essere applicato alle immagini ad alta super-risoluzione doppio-colore, e un colore può essere utilizzato per rivelare lo scheletro Centriolo (ad es., tubulina), mentre l'altro colore può essere attribuito a una specifica proteina centriolari. Sottraendo le medie ottenute con un colore o due colori, diventa più facile registrare una proteina lungo il Centriolo (prossimale, centrale o distale). Si noti che i due canali devono essere allineati con precisione per evitare eventuali interpretazioni fuorvianti. Inoltre, medie di viste dall'alto verranno aiuterà a decifrare se una proteina si localizza all'interno del lume centriolari, lungo la parete dei microtubuli, o fuori il Centriolo.
Questo metodo ha il vantaggio di accertare la localizzazione delle proteine specifiche che potrebbero essere difficili da localizzare altrimenti a causa di etichettatura eterogenei. Si noti che altri metodi per mappare le proteine all'interno i centrioli sono state descritte in SIM/SMLM 3D correlativo con, per esempio, valutare gli orientamenti specifici dei centrioli determinando il profilo ellittico di un marcatore formando un toro intorno il Centriolo da formazione immagine SIM. Utilizzando questo parametro, è possibile localizzare la proteina con una precisione di 4 – 5 nm30. Si noti inoltre che il metodo descritto qui utilizza centrioli isolati con procentrioles intatto, un segno che l'architettura Centriolo è probabilmente in gran parte conservato. Tuttavia, non possiamo escludere che alcune caratteristiche architettoniche sono disturbati durante la purificazione, come ad esempio il diametro Centriolo varia con la concentrazione di cationi bivalenti come amplificato con l'isolamento del centrosoma umano5.
Una delle fasi critiche del protocollo presentato qui è ottenere sufficientemente concentrate centrioli isolati in diversi orientamenti suscettibili di Fluo-SPA. A tale scopo, in primo luogo garantire la purezza e l'efficienza della procedura di isolamento Centriolo. Una concentrazione bassa di centrioli isolati impedirà il corretto imaging e ulteriore elaborazione delle immagini. Per questo scopo, stiamo fornendo un metodo per arricchire il numero dei centrioli al campo di vista. A seconda del numero dei centrioli in frazione utilizzata, deve essere regolato il volume caricato nel concentratore, con un volume massimo di 250 µ l.
D'importanza, questo metodo è stato sviluppato per una parete cellulare meno cellule cw15-C. reinhardtii . In questo ceppo, la fragilità della parete cellulare consente un'adeguata lisi delle cellule e, quindi, la liberazione del suo contenuto. Questo protocollo non è efficiente per il selvaggio-tipo c. reinhardtii cellule, come la parete cellulare impedisce una corretta lisi. Strategie alternative quali sonicazione o una pre-incubazione delle cellule con autolysin, un enzima che può degradare la parete cellulare31, avrebbe dovuto essere messo in atto per alterare la parete cellulare prima di applicare il protocollo di isolamento presentato qui.
Questo set-up può essere utilizzato con diversi tipi di microscopi, che vanno da convenzionali microscopi confocali a microscopi di Super-risoluzione dedicata a resa elevata. Notare che quando si fa SMLM, un buffer speciale è richiesto per l'imaging corretta e, pertanto, deve essere utilizzata una camera adattata per un coprioggetto di 12mm con il buffer in cima il vetrino coprioggetti. La formazione immagine successiva verrà eseguita con microscopi rovesciati. Se il set-up del microscopio non consente un coprioggetto di 12mm, il protocollo presentato qui può essere applicato alle lamelle di 18 mm utilizzando un tubo da 30 mL rotondo-fondo e un adattatore modificate e concentratore. È anche importante nota che la qualità della ricostruzione finale in SMLM dipenderà la qualità della colorazione e dell'anticorpo primario utilizzato, nonché il metodo di fissazione.
In sintesi, stiamo fornendo un metodo che può essere applicato all'immagine centrioli numerosi seguiti da Fluo-SPA che genererà medie dei centrioli in diversi orientamenti, contribuendo così a localizzare centriolari proteina con precisione. D'importanza, questo metodo può essere applicato più generalmente centrioli isolati da altre specie, per altri organelli o alle grandi assemblee macromolecolari. Infine, l'approccio di preparazione del campione presentato qui, combinato con il recente sviluppo di un algoritmo per analisi di singola particella di fluorescente SMLM dati32, potrebbe aprire ulteriore miglioramento nella cartografia molecolare di grandi dimensioni macromolecolare assembly.

Il Centriolo è un organulo evolutivamente conservato che si trova al centro del centrosoma in cellule animali e può agire come un corpo basale (denominato centrioli qui di seguito) per ciglia modello o flagelli in molti eucarioti1,2. Come tale, centrioli sono fondamentali per i processi biologici fondamentali delle cellule che vanno dall'assemblaggio mandrino alla segnalazione delle cellule. Di conseguenza, difetti di assemblaggio Centriolo o funzione sono stati associati con diverse patologie umane, tra cui ciliopatie e cancri3.
Centrioli sono possono, simmetrico, microtubule tripletto basato su strutture cilindriche che sono, in genere, ~ 450 nm lungo e ~ 250 nm ampia4,5,6,7. Microscopia elettronica convenzionale e la tomografia cryo-elettrone di centrioli da diverse specie hanno rivelato che i centrioli sono polarizzate lungo il loro asse con tre distinte regioni: una regione prossimale, un nucleo centrale e una regione distale5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. importante, ciascuna di queste regioni Visualizza particolari caratteristiche strutturali. In primo luogo, il lume della regione prossimale nm-lungo 100 contiene la struttura di cartwheel collegata per la tripletta di microtubule attraverso l' elemento capocchia di spillo12. In secondo luogo, la regione centrale di 300 – 400 nm lunga contiene fibrosa densità nelle caratteristiche strutturali e lumen lungo la faccia interna dei microtubuli: il linker a forma di Y, la coda C-tubulo e tubulo A9di stub. Infine, la regione distale di 50 – 100 nm esibisce appendici Sub-distale e distale che circondano la parte distale del Centriolo5,13.
Gli ultimi due decenni sono stati contrassegnati dalla scoperta di un numero crescente di proteine centriolari, portando a una stima attuale di circa 100 proteine distinte, essendo parte del Centriolo14,15,16, 17. Nonostante questi progressi, la localizzazione precisa di queste proteine all'interno il Centriolo resta sfuggente, specialmente all'interno di sub-regioni strutturali. È importante assegnare una precisa localizzazione regioni strutturali del Centriolo è cruciale per una migliore comprensione della loro funzione. A questo proposito, c. reinhardtii centrioli sono stati strumentali in entrambi gli aspetti di primo delimitando le diverse caratteristiche strutturali lungo il cilindro9,18,19, che poi ha permesso ricercatori di correlare la localizzazione di un sottoinsieme delle proteine usando microscopia fluorescente ad una regione sub-strutturale. Questo include, per esempio, le proteine Bld12p e Bld10p, che si localizza nella regione prossimale e nella struttura del cartwheel in particolare20,21,22,23. L'elenco delle proteine localizzata sottostruttura include anche POB15 e POC16, due nuove proteine identificate mediante spettrometria di massa che decorano la regione di nucleo centrale interno di c. reinhardtii centrioli17.
Questo documento fornisce una descrizione completa del metodo sviluppato per isolare e immagine c. reinhardtii centrioli per microscopia di Super-risoluzione successiva e una media di singola particella. Per raggiungere questo obiettivo, è importante delineare le limitazioni tecniche che devono essere superati. In primo luogo, purificazione Centriolo può influenzare l'architettura generale, con la struttura del cartwheel spesso essere perdita durante le varie fasi di isolamento9. In secondo luogo, le dimensioni del Centriolo sono molto vicini al limite di diffrazione in microscopia ottica. Infatti, la risoluzione laterale che può essere ottenuta in microscopia confocale è circa 200 nm24, simile al diametro del Centriolo e la risoluzione nel z-asse è circa 2 – 3 volte inferiore, che conduce a un volume anisotropo. In terzo luogo, l'eterogeneità di orientamento di etichettatura e Centriolo anticorpo potrebbe limitare l'interpretazione necessario per localizzare una proteina in una specifica sub-regione centriolari. Infine, centrioli esistono solo due copie per cellula, rendendo difficile per acquisire un gran numero di immagini e trovare un orientamento Centriolo inequivocabili. Per ovviare a questi problemi tecnici, abbiamo sviluppato un metodo che si basa sull'applicazione di microscopia di Super-risoluzione su grandi numeri di centrioli isolati che adottano vari orientamenti. In primo luogo descriveremo un protocollo per purificare c. reinhardtii centrioli che consente la purificazione dei centrioli strutturalmente intatti e procentrioles contenenti il cartwheel. Quindi, descriveremo un protocollo dettagliato per concentrare i centrioli sulle lamelle per imaging di convenzionale o microscopia fluorescente super-risoluzione. Questo importante passo consente di aumentare il numero dei centrioli imaged in diverse posizioni. Infine, descriviamo una procedura per eseguire la singola particella in media sui dati acquisiti su microscopi fluorescenti che facilita la rilevazione di centrioli in diversi orientamenti. Complessivamente, questo metodo può essere applicato a centrioli immagine da varie specie o altri grandi assiemi macromolecolari.

<table><tbody><tr><td>Tubulina monoclonale anti-apha di topo (clone DM1A)</td><td>Abcam</td><td>ab7291&nbsp;</td><td>diluizione 1:300</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti da 12 mm</td><td>Roth</td><td>YX03.1</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti da 18 mm</td><td>Roth</td><td>LH23.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fluka</td><td>60355</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fluka</td><td>60230</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Biosolve Chimie SARL</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>Carlo Erba Reagenti</td><td>524520</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A-4514</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>63140-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>filtro steritop</td><td>Millipore</td><td></td><td></td>SCGPT05RE</tr><tr><td>saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>TUBI</td><td>Sigma</td><td>P6757-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ACROS ORGANICS 197530010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A1694,0250</td><td></td></tr><tr><td>Provette a fondo tondo (Kimble) 15 mL</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-34</td><td></td></tr><tr><td>Provette a fondo tondo (Kimble) 30 mL</td><td>Fisherscientific</td><td>09-500-37</td><td></td></tr><tr><td>coperchio rack per la colorazione del vetro</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>scatola da laboratorio per la trasmissione del polistirene cristallino</td><td>FISHERS</td><td>11712944</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10735086001</tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>capra anti-topo accoppiato ad Alexa 488&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>A11029</td><td>diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio accoppiato ad Alexa 568</td><td>invitrogen</td><td>A11036</td><td>diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>mezzo di montaggio</td><td>abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>Tubo, polipropilene a parete sottile</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina 1 mg/mL</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Mab monoclonale di modifica anti-poliglutamilazione di topo (GT335)</td><td>Adipogen</td><td>AG-20B-0020</td><td>diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>terreno di montaggio del glicerolo con DAPI e DABCO</td><td>Abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 50 mL</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810R centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5811000622</td><td></td></tr><tr><td>Beckman JS-13.1 rotore a secchiello oscillante</td><td>Beckman Coulter</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>rotore Beckman SW 32Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 con modalità Hyvolution</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OSRAM L18W/954 LUMILUX&nbsp;</td><td>Luxe Daylight/ OSRAM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1001325</tr><tr>Diluizione degli<td>anticorpi</td><td></td><td></td> CrSAS-6/Bld12 <td>1:300 (Hamel el al., 2014)</td></tr><tr><td>Scipion</td><td>http://scipion.i2pc.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di chlamydomonas centrioli

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioli sono grandi assiemi macromolecolari importante per la corretta esecuzione dei processi biologici delle cellule fondamentali quali la divisione cellulare, della motilità cellulare o segnalazione delle cellule. Le alghe verdi Chlamydomonas reinhardtii ha dimostrato di essere un modello perspicace nello studio di architettura Centriolo, funzione e composizione proteica. Nonostante i grandi progressi verso concetti relativi all'architettura centriolari, una delle attuali sfide consiste nel determinare la localizzazione precisa dei componenti centriolari all'interno di regioni strutturali del Centriolo al fine di meglio comprendere il loro ruolo nel biogenesi Centriolo. Una limitazione importante si trova nella risoluzione di microscopia di fluorescenza, che complica l'interpretazione di localizzazione della proteina in questo organello con dimensioni vicino al limite di diffrazione. Per affrontare questa domanda, stiamo fornendo un metodo per purificare e l'immagine di un gran numero di c. reinhardtii centrioli con orientamenti diversi usando la microscopia di Super-risoluzione. Questa tecnica permette un'ulteriore elaborazione dei dati attraverso fluorescente singola particella in media (Fluo-SPA) a causa del gran numero di centrioli acquisito. Fluo-SPA genera medie di macchiato c. reinhardtii centrioli in diversi orientamenti, facilitando così la localizzazione delle proteine distinte nelle sub-regioni centriolari. D'importanza, questo metodo può essere applicato a centrioli immagine da altre specie o altri grandi assiemi macromolecolari.

C. reinhardtii Centriolo isolamento: Per isolare i centrioli, cw15- c. reinhardtii cellule erano cresciute in coltura liquida per diversi giorni sotto la luce e successivamente pellettate mediante centrifugazione a 600 x g per 10 min. Pelleted cellule erano lavate 1x con PBS e sedimento in un deflagellation prima del buffer deflagellation eseguendo una scossa di pH utilizzando acido acetico 0,5 M per un pH finale di 4.5-4.7 per 2 min(Figura 1). Un'aggiunta di 1 N KOH è stata utilizzata per riportare il pH a 7.0. Per separare i flagelli distaccati da corpi cellulari, cellule deflagellated sono stati prima centrifugate per rimuovere la maggior parte dei flagelli. Il pellet è stato poi lavati 2 volte con PBS e risospesi in 30 mL di PBS prima di essere caricate lentamente su un cuscino di saccarosio al 25% (Figura 1B). Il tubo era filato a 600 x g per 15 min a 4 ° C per rimuovere la maggior parte dei flagelli indipendente. Dopo la centrifugazione, i corpi cellulari erano diffuse il cuscino di saccarosio (Figura 1C) e recuperati rimuovendo i circa 30 mL di surnatante (finché la freccia rossa in Figura 1C). La risultante 20 mL di cellule lavate erano quindi risospeso in 20 mL di PBS freddo e centrifugato a 600 x g per 10 min. Successivamente, il surnatante è stato scartato, e le cellule erano completamente risospesi in 10 mL di PBS. Le cellule sono state trasferite in un flacone da 250 mL e il buffer di Lisi è stato aggiunto alle cellule sedimento in una sola volta. Dnasi è stato aggiunto per la lisi e incubata per 1 h a 4 ° C. Dopo una fase di centrifugazione per rimuovere i detriti cellulari (Vedi la pallina bianca in Figura 1D), il surnatante è stato raccolto e accuratamente caricato su un cuscino di saccarosio al 60% di 2 mL prima della centrifugazione a 10.000 x g per 30 min a 4 ° C. Si noti che per 100 mL di Lisi, 8 provette da 15 mL sono stati utilizzati per eseguire questo passaggio, corrispondente a 12,5 mL di tampone di lisi caricati su 2 mL di saccarosio per tubo. Dopo la centrifugazione, la maggior parte del surnatante è stato rimosso fino a 1 mL sopra il cuscino. I 1 mL di surnatante rimanenti era quindi raccolti con il cuscino di 2 mL e poi mescolato e riuniti per ottenere un volume finale di 24 mL. La piscina è stato poi caricata su un 40%, 50%, 70%-saccarosio gradienti e filata a 68.320 x g per 1 h e 15 min a 4 ° C. Infine, sono stati raccolti i centrioli isolati praticando un foro nella parte inferiore del tubo di centrifugazione mediante un ago e le gocce sono stati raccolti in frazioni di 12 x 500 µ l. Dovuto l'alta densità del saccarosio diverso, la goccia formato molto lentamente all'inizio (70% di saccarosio) e quindi più rapidamente (40% di saccarosio).
Immunofluorescenza di centrioli isolati Per valutare la qualità della procedura di isolamento, 10 µ l di ciascuna frazione di gradiente raccolti è stato poi centrifugato su un vetrino coprioggetti utilizzando un adattatore per supporto vetrino coprioggetti (Figura 2A-2D). Cosa importante, per rimuovere in modo sicuro il vetrino coprioggetto, è stato progettato un dispositivo personalizzato agganciato (Figura 2B). Successivamente, le lamelle sono state analizzate dall'immunofluorescenza. Anticorpi CrSAS-6(Bld12p) sono stati utilizzati in questo studio per indicare la presenza della struttura del cartwheel e α-tubulina (DMA1) per evidenziare la parete centriolari. Contando il numero di centrioli che erano positive per CrSAS-6 e di α-tubulina al campo di vista e quindi calcolando il numero totale di centrioli per frazioni, è stato possibile determinare che le frazioni sono state arricchite per isolato centrioli ( Figura 2F-2 H). È interessante notare che, 6 frazioni sono state arricchite per centrioli (Figura 2F e 2G, frazioni #1 – 6), con un picco per frazione #3, mentre le frazioni Ultima erano non, che indica che la purificazione lavorato. Si noti che in questo particolare esperimento, 95% dei centrioli totale erano positive per CrSAS-6 e α-tubulina in frazione #3. Questo indica che più isolate centrioli mantenuto loro capriole. Se nessun arricchimento dei centrioli è osservato nelle prime frazioni, la procedura di isolamento non ha funzionato e dovrebbe essere ripetuta. Si noti che alcuni pezzi flagellari possono essere osservate principalmente nelle frazioni privo di centrioli.
Successivamente, per calcolare il numero totale di centrioli per µ l, il numero di Centriolo al campo di vista dovrebbe essere moltiplicato per il rapporto come illustrato nella Figura 2H. Il numero risultante dovrebbe poi essere diviso per il volume della frazione utilizzata per l'immunofluorescenza per ottenere il numero di centrioli per µ l. In questa procedura di isolamento particolare, la frazione più arricchita conteneva circa 37 centrioli per un'area di 0,00846 mm2 (con un campo visivo di 92x92 µm2). La superficie della sezione del tubo era 7,5 mm di raggio con una superficie totale di 176 mm2. Il rapporto corrispondente era quindi 176/0.00846 = 20,803.8, quindi un totale di 769.740 centrioli (37 x 20, 803.8) in 10 µ l. Di conseguenza, il numero dei centrioli in 1 µ l era 76.974.
Concentrazione di centrioli isolati sulle lamelle: Aumentando il numero dei centrioli per campo aumenta la probabilità di rilevazione Centriolo inequivocabile orientamento, come pure aumentando la possibilità di rilevare simili orientamenti che possono essere utilizzati per ulteriori procedure di calcolo della media delle particelle. Come centrioli da frazioni concentrate sono ancora sparse sul vetrino coprioggetto, abbiamo sviluppato un accessorio di centrifugazione per concentrare centrioli al centro del vetrino coprioggetti (Figura 3A) denominato un concentratore. Si noti che un file. STL con le misure precise per la stampa 3D è dotato di questo manoscritto.
In primo luogo, una lamella di 12 mm è stato montato sul concentratore (Figura 3B). L'adattatore è stato posizionato sopra il vetrino coprioggetto e il tubo rotondo-fondo è stato invertito e posizionato sopra l'adattatore montato e concentratore. Il tubo rotondo-fondo era quindi delicatamente invertito, permettendo il caricamento del campione (protocollo passo 4.2). I centrioli sono stati poi centrifugati a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C. Dopo di che, i centrioli sono stati sottoposti a immunofluorescenza e macchiati per CrSAS-6/Bld12p e α-tubulina (Figura 3-3E). Cosa importante, senza concentratore, circa 30 centrioli sono stati veduti al campo di vista (Figura 3C), mentre 183 centrioli sono stati veduti a campo visivo quando il concentratore è stato usato (Figura 3D-3F). Si noti che i centrioli coperto solo un disco di 4 mm di diametro al centro del vetrino coprioggetti. Questo risultato dimostra che il passaggio di concentrazione funziona e permette un arricchimento 6 volte di centrioli in un'area definita di lamelle, così facilitando la loro rilevazione e imaging.
Singola particella fluorescente con una media di isolato C. reinhardtii centrioli: Qui, usando la microscopia SIM che può raggiungere una risoluzione di circa 120 nm, centrioli macchiati per monoglutamylated tubulina (GT335, Figura 4), una modifica di tubulina presente in centriolari microtubuli, erano imaged24. C. reinhardtii centrioli sono circa 500 nm lunga, sempre in coppia e spesso trovato con associati, appena duplicato probasal corpi (denominati procentrioles in appresso) e striati fibre associate ai microtubuli19. Pertanto, questa assemblea finale era circa 1 micron di grandi dimensioni. Per questo motivo e per i centrioli nella loro interezza di immagine, si consiglia di acquisire un Z-stack sui centrioli isolati.
Qui, dopo l'acquisizione, un'immagine finale è stata generata eseguendo una proiezione di massima intensità usando ImageJ28 (proiezione di intensità di progetto immagine/pile/Z/max, Figura 4B). Da tali immagini, un'analisi di singola particella utilizzando software di microscopia di cryo-elettrone è stata effettuata per rendere le classi di centrioli con orientamenti simili, e quindi in media è stata effettuata. A tale scopo, il colore dell'immagine in primo luogo è stato invertito in modo da visualizzare meglio gli oggetti (Figura 4C). Centrioli sono state raccolte manualmente in una casella centrata sopra ogni particella utilizzando il liberamente disponibile di software di Scipion29 che integra diversi programmi software microscopia elettronica come Xmipp3 (Figura 4D). Si noti che la dimensione della scatola deve essere definito dall'utente. , Scatole di 50 x 50 pixel per una dimensione di pixel di 31,84 nm sono stati usati. Successivamente, tutte le particelle sono state estratte (Figura 4E) e allineate utilizzando Xmipp3 (Figura 4F). Successivamente, è stata applicata una maschera circolare di 12 pixel nel raggio per isolare ciascun Centriolo dalla centriolari-coppia (Figura 4G). Le particelle sono stati poi classificate, utilizzando Xmipp3, per generare diverse medie. Solo classe omogenea medie erano tenute, che significa che le particelle che divergono dalle medie di classe sono stati esclusi manualmente. Questo passaggio è stato ripetuto al fine di generare una media di quasi perfetto per ogni orientamento scelto. Dopo cinque iterazioni, sono state generate due classi delle medie: una vista dall'alto da 63 oggetti (Figura 4H) e un lato Mostra da 98 particelle (Figura 4io) di monoglutamylated centrioli. Le dimensioni dell'oggetto sono state determinate misurando la distanza tra i picchi del profilo trama intensità lungo il segnale di monoglutamylation.
D'importanza, la lunghezza della media classe vista laterale è di 260 nm con un diametro di 250 nm, paragonabile al segnale misurato monoglutamylated tubulina che è stato indicato per localizzare a un'area di 286 ± 33 nm di lunghezza all'interno del nucleo del Centriolo17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Figura 1 : Purificazione di C. reinhardtii centrioli. (A) si tratta di una rappresentazione schematica di ogni passo che porta all'isolamento di c. reinhardtii centrioli. Include passaggi rappresentativi del protocollo (B) prima e (C) dopo la centrifugazione su gradiente di saccarosio al 25%. La freccia rossa nel pannello C indica il volume minimo per mantenere dopo la centrifugazione. (D), questo pannello mostra il pellet bianco delle cellule lisate dopo centrifugazione. La freccia nera indica il pellet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Figura 2 : Set-up di centrifugazione per eseguire immunofluorescenza su isolato centrioli. (A), 10 µ l di ciascuna frazione raccolti è diluito prima in 100 µ l di 10 mM tubi K (pH 7,2). (B) si tratta di una rappresentazione schematica dei dispositivi di centrifugazione, che comprende un tubo rotondo-fondo da 15 mL, una lamella di 12 mm, un adattatore per il vetrino coprioggetto e un dispositivo agganciato su misura per recuperare il coprioggetto dopo centrifugazione. Pannelli C e D mostrano disegni che spiega come recuperare il coprioggetto dopo la centrifugazione. (C) posto l'attrezzo a gancio nel foro presente nel bordo scanalato dell'adattatore e (D) tirare delicatamente. (E) Queste sono immagini di camera umida necessarie per eseguire imaging di immunofluorescenza. La freccia indica il coprioggetto di 12 mm. (F) questi sono immagini rappresentative confocale a 63 X (zoom 2) del gradiente frazioni #1-8, raccolti durante la procedura di purificazione e macchiato per CrSAS-6 (rosso) e α-tubulina (verde). Gli inserti corrispondono alla regione indicata da una casella bianca le viste di ingrandimento inferiore. Barra della scala = 10 µm. (G) si tratta di un grafico che rappresenta il numero di centrioli positivi per CrSAS-6 e di α-tubulina al campo di vista in ogni frazione. Si noti l'arricchimento in frazioni #1-6. Il numero medio di centrioli per ogni campo in ogni frazione: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17.0, #4 = 23,3 ± 11,4, #5 = 14,3 ± 2.1, #6 = 13,7 ± 9.3, #7 = 2,7 ± 1.2, #8 = 1,0 ± 0,0, #9 = 1,0 ± 0,0, #10 = ± 0.0 0.0, #11 = ± 0,3 0,6, #12 = ± 0.0 0.0. Per ogni frazione, 3 campi casuali erano imaged. Si noti che, quando si contano la frazione più arricchita #3, abbiamo trovato che il 95% dei centrioli sono positivi per CrSAS-6 e α-tubulina (n = 205 centrioli). (H), A rapporto tra il numero dei centrioli presenti in zona misurata le micrografie viene utilizzato per calcolare il numero totale di centrioli presente nella zona del tubo. Il numero di Centriolo per µ l può essere calcolato da 10 frazioni µ l originariamente centrifugato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Figura 3 : Isolati centrioli sono centrifugate utilizzando concentratori. (A), questo pannello mostra i dispositivi di centrifugazione necessari a concentrarsi centrioli su vetrini coprioggetti prima dell'immunofluorescenza, tra cui un tubo rotondo-fondo da 15 mL, un concentratore, un coprioggetto di 12 mm e un apparato di supporto adattatore. (B), questo pannello mostra i passaggi per montare il dispositivo di centrifugazione. Pannelli C-E mostrano immagini confocal di centrioli macchiati per CrSAS-6 (rosso) e α-tubulina (verde) (C) senza o (D-E) con il concentratore. Gli inserti corrispondono alla regione indicata da una casella bianca le viste di ingrandimento inferiore. La barra della scala è di 10 µm. nota che i centrioli sono arricchite nel mezzo il coprioggetto (la linea tratteggiata rappresenta il confine dell'area concentrata). (F) questo grafico rappresenta il numero di centrioli al campo visivo senza e con il concentratore. Sono stati analizzati cinque casuale campi di vista. È il numero medio di centrioli, senza concentratore, 29,8 ± 2.9 e con il concentratore, 182,6 ± 11.5, P &lt; 0,0001. La significatività statistica è stata valutata da un spaiati t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Figura 4 : Con una media di singola particella sull'isolato su C. reinhardtii centrioli. (A), questo pannello spettacoli Z stack immagini di centrioli macchiato con GT335 e acquisiti utilizzando un microscopio SIM. (B) questi pannelli mostrano una proiezione di Z di intensità massima delle immagini impilate. Barra della scala = 1 µm. (C), questi pannelli mostrano un'immagine rappresentativa con un contrasto invertito. L'inserto rappresenta uno zoom-in per visualizzare i centrioli meglio. (D), questi pannelli Visualizza particella picking. L'inserto indica come le particelle sono stati raccolti. (E) questi sono esempi di 5 estratte particelle. (F), questo pannello mostra le particelle dopo l'allineamento. (G), questo pannello mostra le particelle dopo l'applicazione di una maschera. Io e pannelli H Visualizza due classe medie: (H), un top view (63 particelle) e (mi) una vista laterale (98 particelle). Le doppie frecce indicano le dimensioni del segnale GT335. Barra della scala = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
File supplementari 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Abbiamo sviluppato una strategia per purificare e un gran numero di centrioli in diversi orientamenti suscettibili per microscopia di Super-risoluzione e con una media di singola particella di immagine.

Isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di Chlamydomonas centrioli

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo centriolo, come localizzare le proteine in una regione specifica del centriolo. Il vantaggio principale di queste tecniche che forniamo i mezzi per concentrare il centriolo per ottenerli in più orientamenti. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia centriola di Chlamydomonas, può anche essere applicato ad altri sistemi, come centrioli umani isolati e paramecio.A dimostrare la procedura saranno il dottorando Nikolai Klena, un'altra dottoranda Maeva Le Guennec, e il postdoc nel laboratorio Davide Gambarotto. Per iniziare questa procedura, preparare innanzitutto tutti i media e le impostazioni cultura delle celle C.Reinhardtii come delineato nel protocollo di testo. Trasferire le cellule preparate in tubi conici da 50 millilitri e centrifugarle a 600 volte g per 10 minuti.Lavare il pellet una volta con 50 millilitri di 1x PBS e ruotare nuovamente le cellule a 600 volte g per 10 minuti. Utilizzare una pipetta per rimorsi il pellet in 100 millilitri di tampone di deflagellazione a temperatura ambiente. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e aggiungere lentamente 0,5 acido acetico molare ad un pH finale da 4,5 a 4,7.Lasciare incubare questa miscela a temperatura ambiente per due minuti. Dopo questo aggiungere lentamente gocce di un normale idrossido di potassio per ripristinare il pH a 7,0, trasferire le cellule in tubi da 50 millilitri e centrifugarle a 600 volte g per 10 minuti, per rimuovere eventuali flagelli staccati. Scartare il supernatante e conservare il pellet sul ghiaccio fino a quando non è pronto per il lavaggio.Quando è pronto, lavare il pellet due volte utilizzando 50 millilitri di 1x PBS a quattro gradi Celsius per lavaggio. Ruotare il pellet lavato a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Resuspend il pellet in 30 millilitri di 1x PBS.Quindi, caricare lentamente la sospensione su un cuscino da 20 millilitri del 25% di saccarosio, senza miscelazione. Ruotare a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere la flagella rimanente e diffondere le cellule nel saccarosio. Utilizzando un aspiratore, aspirare con cura il supernatante mantenendo solo i 20 millilitri più in basso.Lavare il saccarosio rimanente aggiungendo 20 millilitri di PBS freddo 1x. Centrifuga a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Resuspend il pellet in 10 millilitri di 1x PBS a quattro gradi Celsius, assicurandosi che non ci siano grumi nella soluzione.Trasferire il pellet rimescolato in una nuova bottiglia da 250 millilitri, aggiungere il tampone di lisi, integrato con 5.000 unità di DNasi, alla bottiglia contenente le celle. Incubare a quattro gradi Celsius per un'ora, mescolando ogni 15 minuti invertendo accuratamente la bottiglia. Trasferire le cellule liti in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 600 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Utilizzando una pipetta, raccogliere il supernatante e caricarlo in un tubo a fondo rotondo da 30 millilitri su ghiaccio contenente due millilitri di cuscino di saccarosio al 60%. Centrifuga questo a 10.000 volte g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, aspirare il supernatante fino a un millilitro sopra il cuscino di saccarosio.Si noti l'interfaccia gialla tra l'un millilitro del supernatante rimanente e i due millilitri di cuscino di saccarosio. Utilizzando una punta P1000 tagliata, mescolare delicatamente il supernatante rimanente con il saccarosio. Mettere in comune tutti i cuscini di saccarosio e conservarli sul ghiaccio.Preparare quindi un gradiente di saccarosio dal 40% al 70% in un tubo di polipropilene a parete sottile da 38,5 millilitri, come indicato nel protocollo di testo. Caricare lentamente le interfacce in pool nella sfumatura. Bilanciare i tubi con il tampone K-PIPES da 10 millimolari e centrifugare a 68, 320 volte g e quattro gradi Celsius per 75 minuti.Dopo questo, utilizzare un ago di 0,8 millimetri per fare un foro nella parte inferiore del tubo, assicurandosi di non disturbare i diversi strati di saccarosio. Utilizzare questo foro per raccogliere 12 frazioni di microliter a quattro gradi Celsius. Utilizzando una punta P200 tagliata, preparare un'aliquota aggiuntiva di 10 microliter per ogni frazione da utilizzare durante l'immunofluorescenza.Quindi, congelare le frazioni in azoto liquido. Per iniziare, posizionare un coverslip sterile di 12 millimetri sull'estremità inferiore incassata del concentratore, assicurandosi di mantenere il lato rivestito di PDL verso il basso. Posizionare l'adattatore direttamente sopra, per limitare il copripasto.Quindi, invertire il tubo di fondo rotondo e posizionarlo sopra il concentratore, il coverslip e l'adattatore. Usando le pinzette, spingere delicatamente l'insieme fino a raggiungere il fondo del tubo, quindi invertire il tubo. Aggiungere 10 millimolare di tampone K-PIPES fino a raggiungere la parte superiore del concentratore.Assicurarsi che non vi siano bolle nel cilindro centrale del concentratore. Aggiungere delicatamente 100 microlitri di tampone K-PIPES da 10 millimolare a una delle aliquote della frazione centriolare arricchita e mescolare accuratamente utilizzando una pipetta P200. Successivamente, rimuovere 100 microlitri di tampone K-PIPES dal centro cavo del concentratore e aggiungere 100 microlitri della miscela di frazione tampone, assicurandosi che il contenuto rimanga al centro cavo del concentratore.Gira a 10.000 volte g per 10 minuti in una centrifuga che viene pre-raffreddata a quattro gradi Celsius. Successivamente, utilizzare una pinzetta per rimuovere il concentratore. Inserire un dispositivo agganciato a mano nel foro presente nel bordo fessurato dell'adattatore e sollevare delicatamente per recuperare il copripavo.Una volta raggiunta la parte superiore del tubo, utilizzare un dito guantato per intrappolare il bordo dell'adattatore e utilizzare una pinzetta per rimuovere il coverslip, tenendo presente quale lato del copripacchi contiene centriole. Quindi, eseguire la fissazione e la colorazione dell'immunofluorescenza dei centrioli concentrati. Per iniziare, incubare i copricapo con i centrioli nella scatola del laboratorio di trasmissione in polistirolo cristallino preparata riempita con metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius per 5 minuti.Utilizzando una pinzetta, trasferire le coverlips in una scatola di laboratorio trasparente riempita con 50 millilitri di 1x PBS. Lasciare lavare le diapositive nel PBS per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, pipettare 60 microlitri di anticorpi primari si mescolano su un pezzo di involucro di tenuta di laboratorio in una camera umidificata.Posare con cura i copripavimenti sopra la miscela di anticorpi con i centrioli direttamente rivolti verso la goccia. Lasciare incubare i copripasci per 45 minuti. Successivamente, rimuovere i copripavimenti e lavarli in una scatola contenente PBS per cinque minuti.Incubare i copripavimenti lavati per 45 minuti, con anticorpi secondari in PBS 1%BSA e 0,05%Tween-20. Rimuovere i copripavimenti e lavarli per cinque minuti in una scatola contenente PBS. Utilizzando un normale mezzo di montaggio anti-dissolvenza, montare il coverslip su uno scivolo.Quindi, immagini i centrioli isolati su un microscopio confocale con un obiettivo di olio 63X con un N.A. di 1,4, mentre applichi la deconvoluzione. Impostare la posizione superiore e inferiore della pila Z sopra e sotto il segnale centriolo, rispettivamente, e acquisire una grande pila di immagini che comprende il segnale centriolo totale. Proiettare lo stack ed eseguire una media a particella singola come descritto nel protocollo di testo.L'immunofluorescenza rappresentativa rivela che sei frazioni sono arricchite per centriole isolate, con un picco per la frazione numero tre, mentre le ultime due frazioni non lo sono, indicando che la purificazione ha successo. Solo circa 30 centriole sono viste per campo visivo senza il concentratore, mentre 183 sono viste con il concentratore. Ciò dimostra che il passaggio concentratore ha successo e consente un arricchimento di sei volte dei centrioli in una regione definita, semplificandone il rilevamento e l'immagine.La microscopia a super risoluzione viene quindi utilizzata per l'immagine di centrioli macchiati per tubulina monoglutamilata e il software viene utilizzato per generare una media quasi perfetta per ogni orientamento scelto. Dopo cinque iterazioni, sono state generate due classi di medie di centriole monoglutamilate: una vista dall'alto da 63 oggetti e una vista laterale da 98 particelle. La lunghezza della media della classe di vista laterale è di 260 nanometri con un diametro di 250 nanometri, paragonabile al segnale di tubulina monoglutamilato misurato che si vede localizzare all'interno del nucleo del centriolo.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il centriolo isolato sul ghiaccio e congelarlo dopo l'isolamento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la microscopia crioeletnica e la spettrometria di massa al fine di rispondere a ulteriori domande, come l'architettura nativa del centriolo o la composizione proteica centriola.

isolation-fluorescence-imaging-for-single-particle-reconstruction

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo articolo descrive un metodo standard per ottenere un modello tridimensionale (3D) ricostruzione delle macromolecole biologiche mediante microscopia elettronica a colorazione negativa (EM). In questo protocollo, viene spiegato come ottenere la struttura 3D del complesso exosome Saccharomyces cerevisiae a media risoluzione con il metodo casuale conica ricostruzione tilt (RCT).

Singola particella Microscopia Elettronica ricostruzione del complesso Exosome Utilizzo del metodo casuale Tilt conico

Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Viene descritto un metodo basato su proteine fluorescenti su cellule vive per illuminare i vacuoli cellulari (inclusioni) contenenti clamidia. Questa strategia consente una determinazione rapida e automatizzata dell'infettività della clamidia nei campioni e può essere utilizzata per studiare quantitativamente le dinamiche di crescita delle inclusioni.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per visualizzare e Quantificazione<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuolo crescita dinamica in cellule viventi

Qui, viene sviluppato un nuovo test di fluorescenza quantitativa per misurare i cambiamenti nel livello di una proteina specificamente nei centrosomi normalizzando l'intensità di fluorescenza di quella proteina a quella di uno standard interno appropriato.

Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Vengono descritti i protocolli per studiare la dinamica degli stromuli dei cloroplasti, i tubuli pieni di stroma che si estendono dalla superficie dei cloroplasti.

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Questo protocollo spiega come preparare e montare campioni batterici per l'imaging tridimensionale dal vivo e come ricostruire la forma tridimensionale di E. coli da queste immagini.

Immagini tridimensionali di cellule batteriche per rappresentazioni cellulari accurate e localizzazione precisa delle proteine

L'imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l'integrazione dell'imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l'architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.

Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm

Qui, viene presentato un protocollo per estrarre otticamente e catalogare le firme di fluorescenza cellulare innata (cioè l'autofluorescenza cellulare) da ogni singola cellula viva distribuita in uno spazio tridimensionale. Questo metodo è adatto per studiare la firma di fluorescenza innata di diversi sistemi biologici a una risoluzione unicellulare, comprese le cellule di batteri, funghi, lieviti, piante e animali.

Ricostruzione delle firme di fluorescenza innata unicellulare mediante microscopia confocale

Presentiamo un protocollo per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l'imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico

Questo flusso di lavoro consente la produzione di lamelle mirate a strutture biologiche marcate in fluorescenza che sono piccole (&lt;1 μm di estensione assiale) e rare (1 copia per cellula) utilizzando una piattaforma di imaging criogenica tri-coincidente. Questa piattaforma integra la microscopia a fluorescenza, la fresatura a fascio ionico focalizzato e la microscopia elettronica a scansione in un'unica posizione focale e consente la microscopia a fluorescenza simultanea durante la fresatura.

Flusso di lavoro con un microscopio criogenico a fluorescenza coincidente, a fascio di elettroni e ioni per la fresatura mirata delle cellule

Impara a isolare e purificare centrioli da Chlamydomonas reinhardtii per microscopia a super-risoluzione. Questo metodo consente il posizionamento di proteine in regioni specifiche e si applica anche a centrioli umani e di paramecio.

Isolamento e formazione immagine di fluorescenza per la ricostruzione di singola particella di Chlamydomonas centrioli

Esplora altri video