Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti^{- / -} Mice

Durante l'infezione da virus Zika, le cellule T possono infiltrarsi negli organi immunoprivileged per l'eliminazione del virus, ma possono anche contribuire all'immunopatogenesi, come la sindrome di Guillain-Barre o la lesione dei testi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che facilita il rilevamento basato su tetrameri di cellule T specifiche dell'antigene negli organi immunoprivileged, sia durante l'infezione da virus Zika che dopo l'immunizzazione del vaccino. In questo modello, l'infezione da virus Zika è iniziata nei topi knockout del recettore alfa / beta dell'interferone, consentendo il tracciamento delle cellule T specifiche del virus Zika nel cervello, nei testi e nella milza.

Utilizzando un approccio di colorazione tetramero, è possibile indagare solo le caratteristiche dell'organo immunoprivileged che si infiltra nelle cellule T specifiche del virus Zika per esplorare i contributi delle cellule T alle cellule immunoprotezione e immunopatogeniche. Per l'infezione da virus Zika, consegnare uno per 10 alle quattro unità di formazione del focus del virus Zika in 100 microlitri di PBS tramite inoculazione retro-orbitale in topi knockout del recettore alfa/beta di sei-otto settimane. Quindi, monitorare il peso e i segni clinici degli animali infetti ogni giorno per 15 giorni.

Sette giorni dopo l'inoculazione, fissare l'animale infetto in posizione supina su una schiuma chirurgica e utilizzare un bisturi sterile per fare un'incisione cutanea lungo la linea mediana dell'addome. Usa le forbici per aprire i muscoli addominali ed estrarre delicatamente il fegato. Quindi, rimuovere la milza e sciacquare il tessuto tre volte in PBS per rimuovere il sangue.

Dopo l'ultimo lavaggio, posizionare la milza su 1,5 millilitri di mezzo RPMI ghiacciato sul ghiaccio fino a quando tutte le milza non sono state raccolte. Per generare una sospensione a una cella, posizionare le milza in un filtro sterile a celle a rete da 40 micrometri sopra un tubo da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di mezzo RPMI ghiacciato integrato con siero bovino fetale al 10%, o FBS, al colino. Quindi, utilizzare lo stantuffo di una siringa da cinque millilitri per macerare il tessuto attraverso il filtro, utilizzando un mezzo fresco per sciacquare le cellule rilasciate attraverso la rete.

Trasferire la sospensione a una cella in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione e rimescolare il pellet in cinque millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi. Dopo cinque o sei minuti a temperatura ambiente, interrompere lalisi con 10 millilitri di RPMI ghiacciato più FBS per una seconda centrifugazione e rimescolare il pellet in 10 millilitri di mezzo completo per il conteggio. Sette giorni dopo l'inoculazione, immobilizzare un topo maschio eutanasiato, infetto nella posizione incline su un tagliere e fissare il cuoio capelluto con forcep dritte uno per due denti.

Usa le forbici dell'iride per fare un'incisione della linea mediana sul cuoio capelluto, esponendo il cranio e usa una pinzetta affilata per bloccare i due lati delle orbite con pinzette affilate, fissando il cervello. Posizionare una punta di forbici affilate all'iride nel forame magnum, tagliate lateralmente nel cranio su ciascun lato. Tagliato con cura dalla stessa cavità lungo la linea mediana, verso il naso, mantenendo le punte della forbice il più superficiali possibile per evitare di ferire il cervello.

Sollevare il cervello con le forcep e utilizzare forbici affilate per l'iride per sezionare attentamente le fibre nervose cranici. Quindi, usa le forcep per trasferire il cervello in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI ghiacciato più FBS. Per isolare i teste, sollevare la pelle addominale con le forcep e utilizzare le forbici dell'iride per fare un'incisione longitudinale attraverso il tegumento e la parete addominale ed esporre la parte più bassa dell'addome.

Spingere i testicoli fino all'incisione e utilizzare una pinzetta per tirare delicatamente lo strato di grasso, per esporre un testicolo globulare su entrambi i lati. Utilizzare le forbici dell'iride per sezionare attentamente lo strato di grasso e l'epididimo e trasferire i tester su un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI ghiacciato più FBS. Per generare una sospensione a una cella da uno dei tessuti raccolti, posizionare l'organo su un colino cellulare sterile con una rete da 100 micron sopra un tubo da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di RPMI ghiacciato più FBS al colino.

Utilizzando lo stantuffo da una siringa da cinque millilitri, schiacciare il tessuto e lavare il filtro con mezzo fresco fino a quando l'organo non è stato completamente macinato attraverso la rete. Trasferire la sospensione a cella singola in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione e rimorsi il pellet in cinque millilitri di mezzo gradiente di densità del 30%. Sovrapporre con cura la soluzione cellulare su due millilitri di mezzo gradiente di densità del 70% in un nuovo tubo da 15 millilitri e separare le celle per centrifugazione del gradiente di densità.

Quindi, trasferire le cellule dall'interfase tra i due gradienti di densità a un nuovo tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di RPMI freddo più FBS per un'altra centrifugazione e rimescolare il pellet in 10 millilitri di RPMI /FBS ghiacciato per il conteggio. Per analizzare le cellule per citometria a flusso, diluire le cellule a cinque per 10 fino alle sei cellule per 100 microlitri nella concentrazione tampone FACS e incubare i campioni di cellule con 10 microlitri di anticorpo bloccante CD16/CD32 anti-topo per campione. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 20 microlitri di cellule al numero appropriato di pozzi di una piastra a fondo tondo da 96 porsi secondo il protocollo sperimentale di colorazione citometrica del flusso e aggiungere 20 microlitri del mix tetramet proteina E a ciascun pozzo per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente al buio.

Alla fine dell'incubazione, aggiungere gli anticorpi della superficie cellulare di interesse per le cellule per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce. Successivamente, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone FACS per lavaggio e rimorsi accuratamente le cellule in ogni pozzo con 200 microlitri di tampone FACS fresco. Quindi, conservare i campioni a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce, fino alla loro analisi su un citometro a flusso.

Sintomi patologici e segni come la mieloparalisi e la paraparesi motoria sono osservati nel recettore alfa /beta dell'interferone 1 topo knockout sette giorni dopo l'inoculazione con il virus Zika. Le variazioni di peso nel recettore alfa/beta dell'interferone infetto 1 animale knockout sono state monitorate per 15 giorni, con perdita di peso osservata per la prima volta quattro giorni dopo l'infezione e il recupero del peso a partire dal settimo giorno dopo l'infezione. Immagini rappresentative di cervelli murini infetti rivelano evidente edema e iperemia sette giorni dopo l'inoculazione con il virus Zika.

Le immagini rappresentative dei tester murini infettati da Zika dimostrano una graduale contrazione dal settimo giorno ai 30 giorni dopo l'infezione. L'analisi istopologica delle sezioni cerebrali e testicoli infettate da Zika illustra anche l'effetto dei cambiamenti patologici distruttivi rispetto ai controlli non infetti. Come previsto dalle analisi macro e istopatologiche, elevati carichi virali vengono rilevati anche nel cervello e tester di topi infetti da virus Zika immunosottenendo.

Ciò è accompagnato da una robusta infiltrazione di cellule T positiva al CD3 nell'infezione cerebrale post-Zika. I linfociti T cd3 positivi al virus Zika, positivi al CD8, vengono rilevati sia nei topi infetti da virus Zika che immunizzati dal vaccino dalla colorazione dei tetrameri delle proteine E. Le cellule T CD8-positive specifiche del tetramero E-protein possono anche essere rilevate nel cervello e testa sette giorni dopo l'inoculazione con il virus Zika.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nello studio della caratterizzazione delle cellule T specifiche degli agenti patogeni negli organi immunoprevalenti durante le infezioni naturali nei modelli animali. Questo metodo può anche essere applicato ad altri organi immuno-prevalenti, come placenta o occhio, così come sia all'infezione virale che al cancro. Seguendo questa procedura, i tetrameri MHC-I possono essere utilizzati per il rilevamento immunoistochimico o immunofluorescente di cellule T specifiche dell'agente patogeno per accedere alla distribuzione di cellule T infiltranti cerebrali o tester.