Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore
August 23rd, 2018
Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l'infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione dei sottogruppi di cellule immunitarie all'interno del cuore sia durante gli stati stazionari che durante gli stati di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per un'accurata immunofenotipizzazione di popolazioni di cellule immunitarie cardiache, compresi sottogruppi molto rari. Questo protocollo è relativamente semplice.
Tuttavia, le iniezioni della vena caudale possono essere difficili, quindi è importante praticare questa tecnica fino a quando non ci si sente a proprio agio prima di utilizzare animali da esperimento. Per etichettare i leucociti circolanti, caricare 200 microlitri di anticorpo anti-CD45 coniugato con fluorofori di topo appena preparato in PBS in una siringa da insulina calibro 28,5 e preriscaldare otto topi di 12 settimane su una coperta d'acqua circolante impostata a 35-41 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Quando la vena caudale si è dilatata, trattenere il primo animale in posizione sternale in un dispositivo di contenzione appropriato.
Se le vene della coda non sono sufficientemente dilatate, immergere la coda in acqua a 36-40 gradi Celsius per uno o due minuti. Quando le vene della coda sono pronte, tamponare l'area di iniezione con una garza imbevuta di etanolo al 70% e immobilizzare la base della coda con l'indice e il medio e la regione medio-distale della coda con il pollice e l'anulare. Tenendo l'ago con il lato smussato rivolto verso l'alto e parallelo alla vena, inserire l'ago in una vena caudale dilatata e iniettare per via endovenosa l'intero volume di anticorpi.
Quindi lasciare che l'anticorpo circoli per cinque minuti prima dell'eutanasia umana. Per raccogliere il cuore, spruzzare il topo con etanolo al 70% e sollevare la pelle dell'addome per aprire l'addome lungo la linea mediana ventrale dai fianchi fino allo sterno. Aprire il peritoneo e muovere il fegato per esporre il diaframma.
Tagliare il diaframma e le costole su entrambi i lati della linea mediana, facendo attenzione a non perforare i polmoni e il cuore. Staccare le costole per esporre il cuore prima di incidere gli atri sinistro e destro. Afferrando delicatamente la base del cuore con una pinza, inserire un ago calibro 21 attaccato a una siringa da 60 millilitri nel ventricolo sinistro vicino all'apice e perfondere il cuore con 15-20 millilitri di PBS freddo.
Una corretta perfusione del cuore è essenziale per evitare contaminanti intravascolari. Pertanto fare attenzione a sezionare e perfondere il cuore rapidamente dopo l'eutanasia per evitare contaminazioni dovute alla coagulazione del sangue. Dopo aver perfuso il ventricolo destro come appena dimostrato, si devono osservare polmoni bianchi e fegato pallido.
Tenendo la base del cuore con la pinza, tirare delicatamente il cuore verso l'alto e tagliare le principali arterie e vene polmonari, l'aorta e il sacco pericardico per staccare il tessuto cardiaco. Tenendo delicatamente il cuore tra il pollice e l'indice, pulire accuratamente il cuore con un tovagliolo di carta pulito e privo di lanugine e utilizzare la pinza per rimuovere gli atri e i resti di eventuali arterie e vene principali o altri contaminanti. Mettere il cuore pulito in un piatto di plastica da cinque centimetri e aggiungere 50 microlitri di PBS freddo.
Usando le forbici da dissezione curve, tritare il cuore fino a quando non ci sono pezzi visibili e il tessuto ha una consistenza liscia e densa. Utilizzare una pinza curva per trasferire il tessuto in provette da microcentrifuga da due millilitri contenenti 800 microlitri di DMEM freddo. Integrare con collagenasi, DNasi e ialuronidasi e incubare per 45-60 minuti a 37 gradi Celsius e 50 giri/min.
Al termine della digestione prelevare campioni a vortice per 20 secondi e posizionarli immediatamente su ghiaccio. Il campione deve essere sempre conservato a quattro gradi Celsius, se non diversamente specificato, poiché alcuni antigeni di superficie possono essere internalizzati se lasciati a temperatura ambiente. Quindi pre-bagnare il filtro cellulare da 140 microlitri in una provetta conica da 50 millilitri per campione con un millilitro di HBB freddo.
Utilizzando una pipetta da un millilitro, pipettare i campioni fino a quando le sospensioni tissutali non sono omogenee e non ostruire la punta della pipetta e aggiungere i campioni omogeneizzati ai filtri. Lavare lentamente i campioni attraverso i filtri con 12-14 millilitri di HBB freddo per campione e trasferire i campioni filtrati in una provetta conica da 15 millilitri etichettata su ghiaccio. Una buona digestione è dimostrata dall'assenza di residui cardiaci nel filtro.
Raccogliere i campioni mediante centrifugazione e rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio a ciascun campione. Risospendere i campioni con un breve vortice, seguito da un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi interrompere l'emolisi con cinque-otto millilitri di HBSS freddo. Raccogliere i campioni mediante centrifugazione e risospendere i pellet in un millilitro di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o tampone FACS e trasferirli in singole provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri per un'altra centrifugazione. Per analizzare i campioni mediante citometria a flusso, risospendere i pellet in 50 microlitri di anticorpo anti-CD16/CD32 e un bloccante dei monociti per ridurre il legame anticorpale aspecifico per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.
Senza lavaggio, aggiungere 50 microlitri di miscela master di anticorpi a ciascun campione con miscelazione per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con 600 microlitri di tampone FACS per provetta e risospendere i pellet in 300 microlitri di tampone FACS fresco o paraformaldeide all'1%. Quindi analizzare i leucociti cardiaci mediante citometria a flusso secondo i protocolli standard di analisi del flusso.
L'analisi della sospensione cardiaca a singola cellula mediante citometria a flusso richiede il pre-gating con CD45 per differenziare le cellule immunitarie dalle cellule non immunitarie del cuore, seguito da un gating a singola cellula e da un gating di esclusione di piccole dimensioni. I macrofagi, identificati dalla loro espressione di CD64, sono la principale popolazione di cellule immunitarie del cuore, rappresentando dal 60 al 70% di tutte le cellule immunitarie. Le cellule dendritiche cardiache convenzionali sono cellule CD64-negative che esprimono alti livelli di MHC di classe II e CD11c.
Queste cellule possono essere ulteriormente suddivise in base alla loro espressione di CD103 o CD11b e rappresentano una sottopopolazione cardiaca molto più piccola rispetto ai macrofagi. L'uso della citometria a flusso di una sospensione di una singola cellula di miocardio consente lo studio di piccole sottopopolazioni leucocitarie all'interno del cuore. Ad esempio, utilizzando l'analisi della citometria a flusso per confrontare le cellule immunitarie del miocardio di topi wild type rispetto a topi carenti di Batf3, la mancanza di cellule dendritiche CD103-positive può essere confermata all'interno degli animali knockout.
Inoltre, questa analisi ha rivelato una mancanza di alterazione significativa della composizione di altre popolazioni cardiache negli animali carenti di Batf3, dimostrando il grado di sensibilità che può essere raggiunto utilizzando questo metodo combinato di digestione enzimatica e meccanica per ottenere una sospensione a singola cellula. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere sempre in considerazione la vitalità dell'isolato cellulare. Pertanto, si consiglia di ottimizzare il tempo e la concentrazione enzimatica della digestione in base alle condizioni sperimentali.
Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula, i saggi funzionali e l'isolamento delle microsfere magnetiche per rispondere a ulteriori domande sulle funzioni delle cellule isolate.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficiente per isolare, identificare e quantificare le cellule immunitarie residenti nel miocardio dei topi durante lo stato stazionario o l'infiammazione. Il metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione dei sottogruppi di cellule immunitarie all'interno del cuore sia durante gli stati stazionari che di malattia.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Cardiologia
- Citometria a flusso
Contesto
- Il cuore contiene varie popolazioni di cellule immunitarie.
- Comprendere queste popolazioni è cruciale per la salute cardiaca.
- L'immunofenotipizzazione accurata è necessaria per studiare i rari sottogruppi immunitari.
- Le iniezioni nella vena caudale sono un metodo comune per etichettare i leucociti circolanti.
Obiettivo dello studio
- Isolare e quantificare le cellule immunitarie nel miocardio.
- Analizzare i sottogruppi di cellule immunitarie durante diversi stati fisiologici.
- Migliorare le tecniche per studiare le risposte immunitarie cardiache.
Metodi utilizzati
- Digerione enzimatica e meccanica per creare una sospensione di cellule singole.
- Citometria a flusso per analizzare le popolazioni di cellule immunitarie.
- Iniezioni nella vena caudale di anticorpo anti-CD45 coniugato a fluoroforo.
- Preriscaldamento dei topi per facilitare l'accesso alla vena caudale.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule immunitarie dal miocardio del topo.
- Identificazione di vari sottogruppi di cellule immunitarie.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica sia in stati stazionari che infiammatori.
- Evidenziazione dell'importanza della pratica per iniezioni nella vena caudale di successo.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per studiare le cellule immunitarie cardiache.
- Migliora la comprensione delle risposte immunitarie nel cuore.
- La tecnica è accessibile per i ricercatori con una formazione adeguata.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate profiling of cardiac immune cell subsets enables mechanistic de-risking in cardiovascular target validation by clarifying inflammatory pathways and immune-mediated mechanisms of action. This method supports predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible immunophenotyping data that informs go/no-go decisions in early discovery. The approach addresses a critical gap in studying rare but functionally significant immune populations during steady-state conditions, enhancing translational relevance for immuno-cardiology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying immune cell composition and functional compartmentalization in the myocardium.
- Operational Value: Provides a reliable method to distinguish true tissue-resident immune signals from intravascular contamination, improving data integrity.
- Strategic Value: Supports target de-risking through precise identification of macrophage and dendritic cell subsets implicated in cardiac inflammation and fibrosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a standardized single-cell suspension suitable for high-dimensional flow cytometry panels, enabling consistent immunophenotyping across experiments.
- Operational Value: Combines enzymatic and mechanical digestion with vascular labeling to achieve high viability and purity, reducing assay variability.
- Strategic Value: Establishes a reproducible workflow for immune cell isolation that can be adapted across disease models and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates longitudinal immune monitoring from steady state to inflammatory conditions, supporting biomarker discovery and mechanistic insight.
- Operational Value: Outputs are compatible with downstream applications such as FACS sorting, magnetic bead separation, and single-cell RNA sequencing for functional validation.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted advancement by confirming target engagement and immune modulation in relevant preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing immune profiling data that informs mechanism of action and safety assessment in cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of key immune subsets like CD64+ macrophages and CD11c+ MHC-IIhi dendritic cells in the heart.
- Screening: Delivers quantitative, flow-cytometry-ready single-cell suspensions that allow comparison of immune composition across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Generates multi-parametric immune phenotypes (e.g., CD103+ vs CD11b+ dendritic cell ratios) that help de-risk targets by revealing subset-specific responses.
- Translational Research: Connects immune cell dynamics to disease progression, supporting biomarker alignment in models of cardiac inflammation and remodeling.
- Enterprise Reuse: The core isolation and labeling strategy is adaptable to other organs and disease areas, promoting cross-platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling confident identification of rare immune subsets that drive cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Standardizes immune cell isolation through defined enzymatic digestion, vascular labeling, and flow cytometry gating strategies.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by providing immune-mediated mechanism data that informs combination therapy and patient stratification strategies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making through reproducible quantification of immune cell changes in preclinical efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, tail vein injection techniques, and aseptic tissue dissection to ensure sample quality.
- Dependent on access to flow cytometry equipment, fluorescence-conjugated antibodies, and enzymatic reagents (collagenase, hyaluronidase, DNAse).
- Necessitates standardization of perfusion, digestion, and lysis timing across operators to minimize variability in immune cell yield and viability.
- Requires optimization of enzyme concentration and incubation time based on heart size, age, and disease state to preserve epitope integrity.
- Limited by the need for immediate processing post-excision to prevent surface antigen internalization and maintain staining fidelity.
