Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore
23 agosto 2018
Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l'infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla composizione dei sottogruppi di cellule immunitarie all'interno del cuore sia durante gli stati stazionari che durante gli stati di malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per un'accurata immunofenotipizzazione di popolazioni di cellule immunitarie cardiache, compresi sottogruppi molto rari. Questo protocollo è relativamente semplice.
Tuttavia, le iniezioni della vena caudale possono essere difficili, quindi è importante praticare questa tecnica fino a quando non ci si sente a proprio agio prima di utilizzare animali da esperimento. Per etichettare i leucociti circolanti, caricare 200 microlitri di anticorpo anti-CD45 coniugato con fluorofori di topo appena preparato in PBS in una siringa da insulina calibro 28,5 e preriscaldare otto topi di 12 settimane su una coperta d'acqua circolante impostata a 35-41 gradi Celsius per cinque-dieci minuti. Quando la vena caudale si è dilatata, trattenere il primo animale in posizione sternale in un dispositivo di contenzione appropriato.
Se le vene della coda non sono sufficientemente dilatate, immergere la coda in acqua a 36-40 gradi Celsius per uno o due minuti. Quando le vene della coda sono pronte, tamponare l'area di iniezione con una garza imbevuta di etanolo al 70% e immobilizzare la base della coda con l'indice e il medio e la regione medio-distale della coda con il pollice e l'anulare. Tenendo l'ago con il lato smussato rivolto verso l'alto e parallelo alla vena, inserire l'ago in una vena caudale dilatata e iniettare per via endovenosa l'intero volume di anticorpi.
Quindi lasciare che l'anticorpo circoli per cinque minuti prima dell'eutanasia umana. Per raccogliere il cuore, spruzzare il topo con etanolo al 70% e sollevare la pelle dell'addome per aprire l'addome lungo la linea mediana ventrale dai fianchi fino allo sterno. Aprire il peritoneo e muovere il fegato per esporre il diaframma.
Tagliare il diaframma e le costole su entrambi i lati della linea mediana, facendo attenzione a non perforare i polmoni e il cuore. Staccare le costole per esporre il cuore prima di incidere gli atri sinistro e destro. Afferrando delicatamente la base del cuore con una pinza, inserire un ago calibro 21 attaccato a una siringa da 60 millilitri nel ventricolo sinistro vicino all'apice e perfondere il cuore con 15-20 millilitri di PBS freddo.
Una corretta perfusione del cuore è essenziale per evitare contaminanti intravascolari. Pertanto fare attenzione a sezionare e perfondere il cuore rapidamente dopo l'eutanasia per evitare contaminazioni dovute alla coagulazione del sangue. Dopo aver perfuso il ventricolo destro come appena dimostrato, si devono osservare polmoni bianchi e fegato pallido.
Tenendo la base del cuore con la pinza, tirare delicatamente il cuore verso l'alto e tagliare le principali arterie e vene polmonari, l'aorta e il sacco pericardico per staccare il tessuto cardiaco. Tenendo delicatamente il cuore tra il pollice e l'indice, pulire accuratamente il cuore con un tovagliolo di carta pulito e privo di lanugine e utilizzare la pinza per rimuovere gli atri e i resti di eventuali arterie e vene principali o altri contaminanti. Mettere il cuore pulito in un piatto di plastica da cinque centimetri e aggiungere 50 microlitri di PBS freddo.
Usando le forbici da dissezione curve, tritare il cuore fino a quando non ci sono pezzi visibili e il tessuto ha una consistenza liscia e densa. Utilizzare una pinza curva per trasferire il tessuto in provette da microcentrifuga da due millilitri contenenti 800 microlitri di DMEM freddo. Integrare con collagenasi, DNasi e ialuronidasi e incubare per 45-60 minuti a 37 gradi Celsius e 50 giri/min.
Al termine della digestione prelevare campioni a vortice per 20 secondi e posizionarli immediatamente su ghiaccio. Il campione deve essere sempre conservato a quattro gradi Celsius, se non diversamente specificato, poiché alcuni antigeni di superficie possono essere internalizzati se lasciati a temperatura ambiente. Quindi pre-bagnare il filtro cellulare da 140 microlitri in una provetta conica da 50 millilitri per campione con un millilitro di HBB freddo.
Utilizzando una pipetta da un millilitro, pipettare i campioni fino a quando le sospensioni tissutali non sono omogenee e non ostruire la punta della pipetta e aggiungere i campioni omogeneizzati ai filtri. Lavare lentamente i campioni attraverso i filtri con 12-14 millilitri di HBB freddo per campione e trasferire i campioni filtrati in una provetta conica da 15 millilitri etichettata su ghiaccio. Una buona digestione è dimostrata dall'assenza di residui cardiaci nel filtro.
Raccogliere i campioni mediante centrifugazione e rimuovere il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone di lisi di potassio cloruro di ammonio a ciascun campione. Risospendere i campioni con un breve vortice, seguito da un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.
Quindi interrompere l'emolisi con cinque-otto millilitri di HBSS freddo. Raccogliere i campioni mediante centrifugazione e risospendere i pellet in un millilitro di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o tampone FACS e trasferirli in singole provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri per un'altra centrifugazione. Per analizzare i campioni mediante citometria a flusso, risospendere i pellet in 50 microlitri di anticorpo anti-CD16/CD32 e un bloccante dei monociti per ridurre il legame anticorpale aspecifico per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.
Senza lavaggio, aggiungere 50 microlitri di miscela master di anticorpi a ciascun campione con miscelazione per un'incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con 600 microlitri di tampone FACS per provetta e risospendere i pellet in 300 microlitri di tampone FACS fresco o paraformaldeide all'1%. Quindi analizzare i leucociti cardiaci mediante citometria a flusso secondo i protocolli standard di analisi del flusso.
L'analisi della sospensione cardiaca a singola cellula mediante citometria a flusso richiede il pre-gating con CD45 per differenziare le cellule immunitarie dalle cellule non immunitarie del cuore, seguito da un gating a singola cellula e da un gating di esclusione di piccole dimensioni. I macrofagi, identificati dalla loro espressione di CD64, sono la principale popolazione di cellule immunitarie del cuore, rappresentando dal 60 al 70% di tutte le cellule immunitarie. Le cellule dendritiche cardiache convenzionali sono cellule CD64-negative che esprimono alti livelli di MHC di classe II e CD11c.
Queste cellule possono essere ulteriormente suddivise in base alla loro espressione di CD103 o CD11b e rappresentano una sottopopolazione cardiaca molto più piccola rispetto ai macrofagi. L'uso della citometria a flusso di una sospensione di una singola cellula di miocardio consente lo studio di piccole sottopopolazioni leucocitarie all'interno del cuore. Ad esempio, utilizzando l'analisi della citometria a flusso per confrontare le cellule immunitarie del miocardio di topi wild type rispetto a topi carenti di Batf3, la mancanza di cellule dendritiche CD103-positive può essere confermata all'interno degli animali knockout.
Inoltre, questa analisi ha rivelato una mancanza di alterazione significativa della composizione di altre popolazioni cardiache negli animali carenti di Batf3, dimostrando il grado di sensibilità che può essere raggiunto utilizzando questo metodo combinato di digestione enzimatica e meccanica per ottenere una sospensione a singola cellula. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere sempre in considerazione la vitalità dell'isolato cellulare. Pertanto, si consiglia di ottimizzare il tempo e la concentrazione enzimatica della digestione in base alle condizioni sperimentali.
Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula, i saggi funzionali e l'isolamento delle microsfere magnetiche per rispondere a ulteriori domande sulle funzioni delle cellule isolate.
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Panoramica
Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficiente per isolare, identificare e quantificare le cellule immunitarie presenti nel miocardio di topi in condizioni di stato stazionario o durante infiammazione. Il metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla composizione dei sottogruppi di cellule immunitarie all'interno del cuore sia in condizioni di stato stazionario sia in condizioni patologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Cardiologia
- Citometria a flusso
Sfondo
- Il cuore contiene diverse popolazioni di cellule immunitarie.
- Comprendere queste popolazioni è fondamentale per la salute cardiaca.
- Un'immunofenotipizzazione accurata è necessaria per lo studio di sottopopolazioni immunitarie rare.
- Le iniezioni in vena caudale sono un metodo comune per etichettare i leucociti circolanti.
Scopo dello studio
- Isolare e quantificare le cellule immunitarie nel miocardio.
- Analizzare i sottogruppi di cellule immunitarie durante diversi stati fisiologici.
- Migliorare le tecniche per lo studio delle risposte immunitarie cardiache.
Metodi Utilizzati
- Digestione enzimatica e meccanica per ottenere una sospensione di singole cellule.
- Citometria a flusso per l'analisi delle popolazioni di cellule immunitarie.
- Iniezioni nella vena della coda con anticorpo anti-CD45 coniugato a un fluorocromo.
- Precaldo dei topi per facilitare l'accesso alla vena della coda.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule immunitarie dal miocardio del topo.
- Identificazione di diversi sottogruppi di cellule immunitarie.
- Dimostrazione dell'efficacia della tecnica sia in condizioni di stato stazionario che in stati infiammatori.
- Evidenziazione dell'importanza della pratica per iniezioni di successo nella vena della coda.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per lo studio delle cellule immunitarie cardiache.
- Migliora la comprensione delle risposte immunitarie nel cuore.
- La tecnica è accessibile ai ricercatori con un'adeguata formazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il profilo accurato dei sottogruppi di cellule immunitarie cardiache consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione di bersagli cardiovascolari, chiarificando le vie infiammatorie e i meccanismi d'azione mediati dal sistema immunitario. Questo metodo supporta la previsione affidabile nei modelli preclinici fornendo dati quantitativi e riproducibili di immunofenotipizzazione che guidano le decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della scoperta. L'approccio colma un'importante lacuna nello studio di popolazioni immunitarie rare ma funzionalmente significative in condizioni di stato stazionario, aumentando la rilevanza traslazionale per i programmi di immunocardio logia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando la composizione delle cellule immunitarie e la compartimentalizzazione funzionale nel miocardio.
- Valore operativo: Fornisce un metodo affidabile per distinguere i veri segnali immunitari residenti nel tessuto dalla contaminazione intravascolare, migliorando l'integrità dei dati.
- Valore strategico: Supporta la riduzione del rischio degli obiettivi terapeutici mediante l'identificazione precisa di sottopopolazioni di macrofagi e cellule dendritiche coinvolte nell'infiammazione e nella fibrosi cardiaca.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera una sospensione standardizzata di singole cellule adatta a pannelli di citometria a flusso ad alta dimensione, consentendo un'immunofenotipizzazione coerente tra esperimenti.
- Valore operativo: Combina digestione enzimatica e meccanica con etichettatura vascolare per ottenere elevata vitalità e purezza, riducendo la variabilità del saggio.
- Valore strategico: Stabilisce un flusso di lavoro riproducibile per l'isolamento di cellule immunitarie, adattabile a diversi modelli di malattia e campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita il monitoraggio longitudinale dell'immunità dallo stato stazionario a condizioni infiammatorie, sostenendo la scoperta di biomarcatori e approfondimenti meccanicistici.
- Valore operativo: I risultati sono compatibili con applicazioni successive come il sorting mediante FACS, la separazione con microsferette magnetiche e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per la validazione funzionale.
- Valore strategico: Consente un avanzamento basato sulla valutazione del rischio confermando l'interazione con il bersaglio e la modulazione immunitaria in modelli preclinici pertinenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, fornendo dati di profilazione immunitaria che informano sul meccanismo d'azione e sulla valutazione della sicurezza nello sviluppo di farmaci cardiovascolari.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la quantificazione di importanti sottoinsiemi immunitari come i macrofagi CD64+ e le cellule dendritiche CD11c+ MHC-IIhi nel cuore.
- Screening: Fornisce sospensioni monocellulari quantitative pronte per la citometria a flusso, che permettono il confronto della composizione immunitaria in diverse condizioni genetiche o farmacologiche.
- Analisi: Genera fenotipi immunitari multiparametrici (ad esempio, rapporti tra cellule dendritiche CD103+ e CD11b+) che aiutano a ridurre i rischi associati ai target rivelando risposte specifiche per sottoinsieme.
- Ricerca traslazionale: Collega la dinamica delle cellule immunitarie al decorso della malattia, favorendo l'allineamento dei biomarcatori in modelli di infiammazione e rimodellamento cardiaco.
- Riutilizzo aziendale: La strategia fondamentale di isolamento e marcatura è adattabile ad altri organi e aree patologiche, promuovendo una standardizzazione interspecifica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica consentendo l'identificazione affidabile di rari sottogruppi immunitari che guidano la patofisiologia cardiaca.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento delle cellule immunitarie mediante digestione enzimatica definita, marcatura vascolare e strategie di gating in citometria a flusso.
- Valore strategico: Migliora la priorizzazione del portafoglio fornendo dati sui meccanismi mediati dal sistema immunitario che informano le strategie di terapia combinata e di stratificazione dei pazienti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni adeguatamente ponderate rispetto ai rischi, grazie alla quantificazione riproducibile delle variazioni delle cellule immunitarie negli studi preclinici di efficacia e sicurezza.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di topi, nelle tecniche di iniezione endovenosa caudale e nella dissezione asettica dei tessuti per garantire la qualità del campione.
- È subordinato all'accesso a strumentazione per la citometria a flusso, ad anticorpi coniugati a fluorocromi e a reagenti enzimatici (collagenasi, ialuronidasi, DNAasi).
- Necessita della standardizzazione dei tempi di perfusione, digestione e lisi tra diversi operatori per ridurre al minimo la variabilità nel rendimento e nella vitalità delle cellule immunitarie.
- Richiede l'ottimizzazione della concentrazione enzimatica e del tempo di incubazione in base alle dimensioni del cuore, all'età e allo stato patologico per preservare l'integrità degli epitopi.
- È limitato dalla necessità di un'elaborazione immediata dopo l'escissione per prevenire l'internalizzazione degli antigeni di superficie e mantenere la fedeltà della colorazione.
