Name: Trattamento mirato e selettivo dei Teratomas di derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando radiazione esterna del fascio in un modello di piccoli animali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Scopri come trattare i teratomi derivati da cellule staminali pluripotenti con radioterapia a fascio esterno nel modello murino. Questo metodo consente di colpire selettivamente il tumore minimizzando i danni ai tessuti circostanti.

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Gli autori vorrei ringraziare la nazionale istituti di salute R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) e 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); e l'Istituto cardiovascolare di Stanford (ASL) per il loro sostegno.

Questo esperimento sugli animali è stato approvato ed eseguito sotto l'Institutional Review Board e il pannello di amministrazione su Laboratory Animal Care presso la Stanford University.
1. cella cultura di iPSCs
<ol><li>Crescere umano iPSCs derivate riprogrammando lentivirali su piastre da 6 pozzetti rivestite con matrice della membrana basale (ad es., matrigel, indicato come matrice hereon).</li>
	<li>Cambio quotidiano di media di iPSCs con terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) incubando a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Una volta che le cellule raggiungono la confluenza di 80 – 90% (circa ogni 4 giorni), aggiungere 1 mL di enzima ricombinante cella-dissociazione (Vedi Tabella materiali) al pozzetto ed incubare a 37 ° C per 5 min.</li>
	<li>Dopo 5 min, dissociare le cellule dal pozzo di pipettaggio, trasferirli in una provetta da 15 mL e centrifugare a 300 x g.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) arricchita con inibitore di Y27632 ad una diluizione di 1:1,000.</li>
	<li>Eseguire un conteggio delle cellule delle cellule dissociate e replate le celle rivestite con matrice piastre da 6 pozzetti ad una densità di 2 x 105 a 4 x 105.</li>
</ol>2. trasduzione di iPSCs con un Gene Reporter Double-fusione
<ol><li>Passaggio iPSCs in piastre da 6 pozzetti secondo routine e aggiungere il terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) contenente bromuro di hexadimethrine µ g/mL 6. Nota: Il formato della Colonia ideale è di 200 – 400 cellule/Colonia per produrre la massima efficienza di trasduzione.</li>
	<li>Concentrarsi self-inattivazione dei lentivirus che trasportano firefly luciferase e verde proteina fluorescente (FLuc-eGFP) guidata da ubiquitina umana promotor-C mediante centrifugazione di sedimento con un rotore SW-29 a 50.000 x g per 2 ore a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere il concentrato virale iPSCs in una piastra a 6 pozzetti ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 e incubare per una notte a 37 ° C 5% CO2. Nota: La molteplicità di infezione è stata determinata l'espressione della proteina monomerica fluorescenza analizzata da una cella di fluorescenza-attivato l'ordinamento di scansione (FACS).</li>
	<li>Il giorno seguente, rimuovere il virus mediante centrifugazione delle piastre 6 pozzetti iPSC a 300 x g per 6 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cambiare il supporto quotidiano con terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) e passaggio secondo il protocollo. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per determinare l'efficienza di trasduzione approssimativo per eGFP.</li>
	<li>Un'efficienza del 30 – 40% è sufficiente per l'ordinamento di FACS. Procedere al FACS di hiPSCs che esprimono eGFP se almeno 30 – 40% delle cellule esprimono eGFP.</li>
	<li>Per confermare il FLuc attività ex vivo, le cellule che esprimono GFP filtrate FACS ad una densità di 5.000 cellule per pozzetto della piastra.</li>
	<li>Incubare le cellule trasdotte e non trasdotte cellule (che serviranno come controllo negativo) con il reporter di bioluminescenza sonda D-luciferina (100 μmol/L) per 6 h. misurare la bioluminescenza con una micropiastra spettrofluorimetro.</li>
</ol>3. trapianto degli sportelli unici in versante dorsale per la formazione di Teratoma in topi immunodeficienti
<ol><li>Aggiungere 1 mL di miscela enzima ricombinante cella-dissociazione per piastra 6 pozzetti contenenti umano iPSCs trasformata con un gene reporter di doppio-fusione (FLuc-GFP) nella cultura (cfr. sezione 2) e incubare per 5 min.</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, disperdere le cellule mediante pipetta aspirazione ed espressione. Aggiungere un volume equivalente di terreno di coltura e poi Centrifugare a 250 x g per 4 min.</li>
	<li>Al termine della centrifugazione, aspirare il supernatante, risospendere il pellet cellulare in 30 µ l di matrice e posizionarlo sul ghiaccio per preservare la sua redditività prima dell'iniezione. Confermare un raccolto di 1 x 106 celle utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Se utilizzando double-fusione reporter-gene-transfettati, sospendere le cellule di FACS double-positive (dalla sezione 2) in 30 µ l di matrice.</li>
	<li>Indurre l'anestesia in topi nudi athymic di 8-10 settimane con 2% isoflurance 1L/min di ossigeno e quindi utilizzare manutenzione 2% isoflurane con 1L/min di ossigeno.</li>
	<li>Utilizzando una siringa di 28,5 G, iniettare la miscela di cellula/matrice (Vedi Tabella materiali) sospensione nello spazio sottocutaneo al fianco, con l'obiettivo per un'iniezione di totale 5 x 10 da3 a 5 x 106 cellule (circa 100 ul per iniezione).</li>
	<li>Prendere in considerazione un sito di iniezione più caudale se intendono mantenere topi per periodo prolungato e anticipando la crescita del tumore di grandi dimensioni.</li>
	<li>Sono ammessi animali anestetizzati per recuperare su un pad riscaldato fino al deambulatorio (tipicamente < 1h) con monitoraggio della frequenza respiratoria, il colore della pelle delle dita dei piedi fino al deambulatorio.</li>
</ol>4. bioluminescenza (BLI) di Imaging delle cellule trapiantate per valutare la sopravvivenza delle cellule e la crescita di Teratoma
<ol><li>Timepoints desiderato dopo l'inoculazione, eseguire un'iniezione intraperitoneale (IP) di 375 mg/kg della sonda del reporter D-luciferina in topi.</li>
	<li>10 min dopo un'iniezione di IP, immagine la bioluminescenza segnale negli animali anestetizzati (eseguite come descritto nel passo 3.5) per 30 min utilizzando windows acquisizione 1min a intervalli di 5 min. Nota: Acquisizioni di immagine settimanale sono raccomandati. L'anestesia è effettuata durante la formazione immagine fornendo inalato isoflurano tramite un cono di naso.</li>
	<li>Per l'analisi dei dati, disegnare una regione di interesse (ROI) sopra il segnale BLI e, quindi, normalizzare per il tempo di acquisizione quantificare le emissioni in unità di massime fotoni al secondo per centimetro quadrato per steradiante (/sr fotoni/s/cm2).</li>
</ol>5. teratoma irradiazione utilizzando un irradiatore preclinici di immagine-guida (Figura 1)
<ol><li>Anestetizzare un mouse nella finestra di atterramento utilizzando 2% isoflurane in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 L/min. Dopo che il mouse è completamente anestetizzato, trasferirlo al letto di un irradiatore pre-clinica guidata da immagini (Vedi Tabella materiali). Mantenere l'anestesia da 2% isoflurane continuamente tramite un cono di naso.</li>
	<li>Acquisire immagini micro-CT come un insieme di 400 immagini di proiezione oltre 360° utilizzando un 40 kVp, fascio di raggi x 2 mA e ricostruire quelle in immagini volumetriche con una dimensione di pixel isotropo di 0,2 mm.</li>
	<li>Pianificare un trattamento di radiazione usando le immagini di micro-CT usando il pacchetto di software di RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) ed eseguire il trattamento. Nota: Il piano di trattamento utilizzato è costituito da fasci di raggi x due 225 kVp, orientati a passare attraverso il teratoma superficiale destinazione mentre costeggiando la superficie del resto del mouse e con parsimonia i visceri sottostanti. I tempi di esposizione per le travi vengono regolati in base il trimestrale dei dati di calibrazione di sistema affinché la dose al centro del tumore bersaglio era 6 Gy.</li>
	<li>Ripetere il processo di trattamento per tre giorni consecutivi di consegnare un totale di 18 Gy al tumore di destinazione.</li>
	<li>Mantenere standard di post-trattamento cura degli animali.</li>
</ol>

<ol><li>Sallam, K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+biology%3A+insights+from+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).</li>
<li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLOS Medicine. 6 (2), e1000029(2009).</li>
<li>Kuriyan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+Loss+after+Intravitreal+Injection+of+Autologous+%26%2334%3BStem+Cells%26%2334%3B+for+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous &#34;Stem Cells&#34; for AMD.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).</li>
<li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+%26%2334%3BStem-Cell+Tourism%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &#34;Stem-Cell Tourism&#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).</li>
<li>Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. <a target="_blank" href="https://www.stembook.org/node/723">StemBook</a>. , The Stem Cell Research Community. (2012).</li>
<li>Scott, C. T., Magnus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wrongful+termination%3A+lessons+from+the+Geron+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).</li>
<li>Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geron+trial+resumes%2C+but+standards+for+stem+cell+trials+remain+elusive%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive.</a> Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).</li>
<li>Coghlan, A. <a target="_blank" href="http://connection.ebscohost.com/c/articles/108773320/unexpected-mutations-put-stem-cell-trial-hold">Unexpected mutations put stem cell trial on hold.</a> New Scientist. 227 (3033), 9(2015).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).</li>
<li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cell+number+on+teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells.</a> Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).</li>
<li>Tano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+method+for+detecting+undifferentiated+human+pluripotent+stem+cells+as+impurities+in+cell+therapy+products+using+a+highly+efficient+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system.</a> PLoS One. 9 (10), e110496(2014).</li>
<li>Kuroda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vitro+methods+for+detection+of+residual+undifferentiated+cells+in+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37342(2012).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+embryonic+stem+cell+misbehavior+and+suicide+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).</li>
<li>Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+Mutations%2C+Ganciclovir+Resistance%2C+and+Teratoma+Formation+in+Human+iPSCs+Expressing+an+HSVtk+Suicide+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284(2016).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+susceptibility+to+DNA+damage+of+pluripotent+stem+cells+facilitates+pharmacologic+purging+of+teratoma+risk%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).</li>
<li>Choo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+against+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+by+a+cytotoxic+antibody+recognizing+podocalyxin-like+protein-1%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1.</a> Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).</li>
<li>Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+safety+in+external+beam+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">Patient safety in external beam radiation therapy.</a> American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+micro-computed+tomography-based+image-guided+conformal+radiotherapy+system+for+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+%E2%80%A2+Biology+%E2%80%A2+Physics%22%5BJournal%5D)">Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals.</a> International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).</li>
<li>Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subacute+neuropathological+effects+of+microplanar+beams+of+x-rays+from+a+synchrotron+wiggler%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).</li>
<li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Report%3A+External+Beam+Radiation+Therapy+for+the+Treatment+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Teratomas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas.</a> Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).</li>
<li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+%26%2334%3BStem-Cell+Tourism%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &#34;Stem-Cell Tourism&#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).</li>
<li>Swijnenburg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+stem+cells+reveals+patterns+of+survival+and+immune+rejection+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+de+novo+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation.</a> Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).</li>
<li>Priddle, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+human+embryonic+stem+cells+transplanted+in+vivo+in+murine+and+chick+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models.</a> Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).</li>
<li>Dale, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-rate+effects+in+targeted+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Dose-rate effects in targeted radiotherapy.</a> Physics in Medicine & Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I dati preclinici e casi aneddotici da vittime del "turismo delle cellule staminali" confermano che il rischio di sviluppare i teratomas è un grave inconveniente associato PSC trattamenti23. Sviluppo di approcci attenti per prevenire e trattare il rischio neoplastico associato a terapie con cellule staminali è, pertanto, un passo importante nel facilitare la traduzione clinica delle terapie rigenerative delle cellule staminali. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo di targeting terapeuti...

Lo sviluppo di terapie con cellule staminali per la rigenerazione tissutale ha rilevato un numero di barriere in parecchi decenni passati, che ostacola gli sforzi per la distribuzione efficiente di clinica. Questi ostacoli sono conservazione scadente delle cellule ai luoghi di consegna, l'immunogenicità delle cellule staminali e il potenziale neoplastico a forma i teratomas1. Carcinogenicità è di particolare interesse clinico in quanto può potenzialmente danneggiare cellule staminali trapianto destinatari2. Conti di formazione del tumore a causa di iniezioni di cellule staminali non regolamentata sono già stati segnalati in molteplici contesti clinici3,4,5. Il potenziale per la formazione di teratoma è il più frequentemente citati preoccupazione clinica nello sviluppo delle cellule staminali (PSC) pluripotenti e ha provocato ritardi e cancellazioni di più alto profilo sulle cellule staminali embrionali (ESC) e indotta da cellule staminali pluripotenti (iPSC) prove6,7,8,9. Così, c'è una necessità urgente per una ricerca traslazionale dedicata verso fornendo trattamento appropriato, dovrebbero sorgere questi tumori iatrogenici.
Ad oggi, la maggior parte delle strategie per controllare il comportamento scorretto di cellule staminali si sono concentrati sulla riduzione del numero degli sportelli unici con potenziale cancerogeno2,10. Purtroppo, solo un piccolo numero di cellule residue (ad es.., 1 x 104 a 1 x 105 celle11) è necessario per la formazione di teratoma, che è molto di sotto del limite di rilevazione citata da saggi attualmente disponibili12, 13. altre limitazioni di utilizzo di questi metodi preseparazione includono bassa efficienza e costi elevati, dipendenza dalle sospensioni unicellulari che potrebbe non essere appropriato per più recenti approcci di ingegneria dei tessuti e il danno potenziale della cella sopravvivenza e l'attecchimento.
Pochi studi hanno affrontato le opzioni di trattamento seguendo la formazione di teratoma. Forse la strategia più ben studiata è l'incorporazione di geni di "suicidio" in cellule staminali14,15. Questo metodo consiste nel manipolare geneticamente le cellule staminali per incorporare un gene d'attivazione apoptosi inducibile che può essere attivato da postinjection di stimolazione farmacologica, fornendo così un approccio di salvataggio se iniettato le cellule producono i teratomas. Questo approccio, tuttavia, soffre di notevoli inconvenienti, tra cui gli effetti delle modificazioni genetiche di sportelli unici e il potenziale per uno sviluppo graduale di farmaco resistenza16fuori bersaglio. Un simile approccio utilizza piccole molecole per indurre la morte selettiva delle cellule degli sportelli unici via l'inibizione di anti-apoptotici vie17. Altri gruppi hanno preso di mira la morte delle cellule degli sportelli unici usando gli anticorpi contro marcatori di pluripotenza superficie, come Podocalixina-come proteina-1 (PODXL)18. I tempi di consegna della piccolo-molecola o anticorpo si trova ad avere un impatto significativo sul potenziale terapeutico degli sportelli unici, se consegnato troppo presto e può alcuna efficacia terapeutica, se consegnato troppo tardi. Inoltre, non sono stati studiati gli effetti sistemici di piccole molecole e gli anticorpi usati in questo modo.
Un approccio alternativo per il trattamento di questi tumori si basa sull'utilizzo di radioterapia esterna del fascio (EBRT). Radioterapia esterna è una delle modalità primaria attualmente impiegata nel trattamento di tumori solidi19. Innovazioni nella radioterapia esterna, compreso lo sviluppo del fascio di protoni e radiosurgery di stereotactic, hanno permesso l'ottimizzazione avanzata delle strutture patologiche, evitando danni al tessuto normale, rendendo conformal EBRT ideale per affrontare il teratoma formazione in strutture anatomicamente sensibili20. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale delle cellule staminali, che sono entrambi irto di ulteriore sicurezza clinica e l'efficacia riguarda15. Infine, gli avanzamenti in micro-irradiatori hanno permesso l'applicazione di EBRT in roditori21.
In questo articolo, dimostriamo come creare un modello di piccoli animali di formazione di teratoma iniettando iPSCs umane in topi. Abbiamo quindi illustrato come applicare EBRT per sradicare selettivamente questi tumori in vivo con minimo danno al tessuto circostante. Questo approccio fornisce una terapia mirata per i teratomas PSC-derivati, evitando gli effetti fuori bersaglio della consegna sistemica di molecole biologiche e peptidi e la manipolazione genetica degli sportelli unici. Ai fini d'investigazione, offriamo un passaggio facoltativo per trasdurre cellule staminali con geni reporter di monitorare la risposta del tumore alla radioterapia via bioluminescenza imaging (BLI).

<table><tbody><tr><td>Linea di controllo delle cellule staminali pluripotenti indotte</td><td>Stanford University</td><td>Nguyen Lab</td><td>Coltura cellulare di iPSC</td></tr><tr><td>Corning matrigel matrice di membrana basale 354234</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40234</td><td>Coltura cellulare di iPSC</td></tr><tr><td>Essential 8 terreno di coltura</td><td>ATCC-The global bioresource center</td><td>30-2203</td><td>Coltura cellulare di iPSC</td></tr><tr><td>Tryple E</td><td>Gibco</td><td>12605-036</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>dell'inibitore 2 HCL (inibitore ROCK) di iPSC Y27632 Fisher</td> <td>Scientific</td><td>S104950MG</td><td>Coltura cellulare di iPSC</td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>Cyagen</td><td>P170721-1001cjn</td><td>Trasduzione di iPSC con gene reporter a doppia fusione</td></tr><tr><td>Reagente per infezione/trasfezione di polirbrene</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>Trasduzione di iPSC con gene</td></tr> <tr><td>reporter a doppia fusioneGene reporter fluc-eGFP guidato dal promotore dell'ubiquitina</td><td>Stanford University</td><td>Sam Gambhir lab</td><td>Trasduzione di iPSC con gene reporter a doppia fusione</td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td>Trasduzione di iPSC con gene reporter a doppia fusione e</td></tr><tr><td>citometro a flusso BLI (BD FACSARIA III)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FACSAria</td><td>Trasduzione di iPSC con spettrofluorimetro per micropiastre geniche reporter a doppia fusione</td></tr><tr><td>(Glomax Navigator System)</td><td>Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA</td><td>GM2000</td><td>Trasduzione di iPSC con gene reporter a doppia fusione</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>BLI</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>irradiazione CDS019936</td><td></td></tr><tr><td>X-Rad SmART irradiatore guidato da immagini&nbsp;</td><td>Precision X-ray Inc., North Branford, CT</td><td>X-Rad SmART</td><td>irradiazione</td></tr><tr><td>RT_Image pacchetto software</td><td>Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)</td><td>RT_Image v0.2&beta;</td><td>irradiamento</td></tr></tbody></table>

trattamento mirato e selettivo dei teratomas di derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando radiazione esterna del fascio in un modello di piccoli animali

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Il crescente numero di vittime del "turismo delle cellule staminali," il trapianto non regolamentato delle cellule staminali in tutto il mondo, ha sollevato preoccupazioni circa la sicurezza del trapianto di cellule staminali. Sebbene il trapianto di differenziato piuttosto che cellule indifferenziate è pratica comune, i teratomas possono ancora derivano dalla presenza di cellule staminali indifferenziate residuale al momento del trapianto o da mutazioni spontanee in differenziato cellule. Perché terapie con cellule staminali sono spesso trasportate in siti anatomicamente sensibili, anche i piccoli tumori possono essere clinicamente devastanti, con conseguente cecità, paralisi, cognitive anomalie e disfunzioni cardiovascolari. L'accesso chirurgico a questi siti potrebbe essere ridotte, lasciando i pazienti con poche opzioni terapeutiche. Controllo comportamento scorretto della cellula formativa è, quindi, critico per la traduzione clinica della terapia cellulare.
Radiazione esterna del fascio offre un mezzo efficace di erogare la terapia mirata a diminuire l'onere di teratoma, riducendo al minimo lesioni di organi circostanti. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale di cellule staminali, che sono associati con clinici supplementari di sicurezza ed efficacia. Qui, descriviamo un protocollo per creare i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti in topi e applicare la radioterapia esterna del fascio per ablazione selettivamente questi tumori in vivo.

Topi iniettati in genere dimostrerà la formazione di teratoma crescita dopo 4 – 8 settimane come confermato da BLI imaging (Figura 2). I tumori si ridurranno drasticamente quando irradiati con una dose cumulativa di 18 Gy dato un mese dopo la consegna delle cellule, provocando una diminuzione significativa nel segnale di luciferasi (Figura 2). D'importanza, tessuti normali prelevati 5 mm dal sito irradiato non sembrano avere alcu...

Ricerca sulle strategie di trattamento per i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti è importante per la traduzione clinica della terapia cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per, in primo luogo, generare teratomi derivati da cellule staminali in topi e, quindi, a selettivamente bersaglio e curare questi tumori in vivo usando un irradiatore di piccoli animali.

Trattamento mirato e selettivo dei Teratomas di derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando radiazione esterna del fascio in un modello di piccoli animali

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare selettivamente i teratomi derivati dalle cellule staminali nei topi per la valutazione dell'efficacia in vivo della radioterapia con fascio esterno di piccole dimensioni. Il principale vantaggio della radioterapia esterna con fascio di radiazioni è che è una terapia mirata per i teramtomi associati alle cellule staminali che evita gli effetti avversi off-targets delle terapie fornite sistemicamente. I progressi nella radioterapia con fascio esterno hanno permesso il targeting specifico di piccoli teratomi evitando danni ai tessuti normali, rendendo questa terapia ideale per il trattamento di teratomi sensibili alle radiazioni.Questo metodo non solo può fornire informazioni sull'ottimizzazione delle strategie per le terapie cellulari, ma ha anche il potenziale per diventare clinicamente applicabile nelle terapie umane. Inizia prendendo una piastra da sei pomp po' contenente iPSC. Per indurre la formazione di tetratoma negli animali immunodifesa aggiungere un millilitro di miscela enzimatica di dissociazione cellulare ricombinante per pozzo della piastra a 6 pozzetti contenente cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo trasdotto con un gene reporter a doppia fusione per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione disperdere le cellule pipettando e fermare la reazione enzimatica aggiungendo un volume uguale di mezzo di coltura cellulare ad ogni pozzo. Tirare le sospensioni a cella singola in un tubo conico da 15 millilitri per il conteggio. Al termine della centrifugazione, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 30 microlitri della soluzione a matrice Matrigel e posizionare il tubo sul ghiaccio.Se si utilizzano cellule trasfette da reportage a doppia fusione, queste cellule a doppio effetto positivo dovrebbero essere sospese anche in 30 microlitri di matrice. Successivamente, caricare ogni popolazione cellulare in una siringa da un millilitro dotata di ago calibro 28,5 e confermare la mancanza di risposta al dito del piedino in ogni topo ricevente nudo atimico di otto-10 settimane anestetizzato. Quindi, iniettare per via sottocutanea una miscela di matrice cellulare nel fianco dorsale di ogni animale ricevente.Nel momento sperimentale appropriato dopo l'inoculazione iniettare 375 milligrammi per chilogrammo di deluciferon intraperitonealmente in ciascun ricevente. Dopo 10 minuti immagine il segnale di bioluminescenza in ogni sonda reporter anestetizzata iniettato animale per 30 minuti utilizzando finestre di acquisizione di un minuto a intervalli di cinque minuti, secondo i protocolli standard di imaging a bioluminescenza. Per l'irradiazione del teratoma, nel momento sperimentale appropriato, posizionare innanzitutto un animale ricevente anestetizzato sul letto di un irradiatore preclinico guidato dall'immagine e acquisire una serie di 400 immagini di tomografia micro-calcolata di proiezione di oltre 360 gradi utilizzando un kilovoltage di picco di 40 picchi, un fascio di raggi X da 2 milliamp e ricostruire l'immagine in immagini volumetriche con una dimensione pixel isotropica di 0,2 millimetri.È fondamentale ricostruire le immagini volumetriche dei teratomi. Queste immagini aiuteranno a pianificare i trattamenti radioterapici solo per la consegna specifica della terapia ai teratomi, riducendo al minimo qualsiasi radiazione off-target dei tessuti circostanti. Quindi utilizzare le immagini micro-CT e il pacchetto software di immagine RT per pianificare un protocollo di trattamento delle radiazioni.Somministrare il trattamento per tre giorni consecutivi per fornire un totale di 18 grigi al tumore bersaglio. I topi iniettati in genere dimostrano la formazione di crescita del teratoma da quattro a cinque settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali come confermato dall'imaging della bioluminescenza. Quando irradiati con una fa cumulativa di 18 grigi un mese dopo il parto cellulare, i tumori si ridurranno drasticamente con conseguente significativa diminuzione coincidente del segnale luciferasi.È importante sottolineare che, come dimostrano queste immagini, le normali biopsie tissutali raccolte da cinque millilitri dal sito irradiato non sembrano subire danni significativi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come creare teratomi derivati dalle cellule staminali in vivo e trattarli in modo efficace e sicuro con radiazioni del fascio esterno. Questo semplice approccio richiede l'acquisizione di immagini CT ad alta risoluzione di un soggetto dopo di che potrebbe essere prescritta una serie di terapie con fascio di radiazioni per irradiare i tumori bersaglio, evitando al contempo il tessuto adiacente.Non dimenticare che lavorare con le radiazioni può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come l'uso degli scudi appropriati, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) hanno il potenziale per trattare una miriade di diverse malattie. L'utilità di queste cellule risiede nel fatto che essi possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo. Qui si descrive il saggio teratoma, che viene utilizzato per dimostrare l'pluripotence di hPSCs.

Generation teratoma nella Capsule Testicolo

Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere l'utilizzo di un modello di glioblastoma ortotopico per gli studi di chemio-radioterapia. Questo articolo passare attraverso l'elaborazione delle cellule, l'impianto, e la radioterapia del mouse utilizzando un modello intracranica.

La radioterapia combinata in un modello di tumore ortotopico cervello di topo

Questo video descrive la tecnica della radioimmunoterapia premirata o PRIT, in cui vengono somministrati immunoconiugati seguiti da radioligandi per il trattamento dei tumori. Questa radioimmunoterapia riduce le dosi di radiazioni ai tessuti sani e utilizza radionuclidi con emivite molto basse incompatibili con vettori basati su anticorpi.

Radioimmunoterapia premirata: un metodo per la somministrazione mirata di radionuclidi terapeutici ai tumori

Abbiamo sviluppato nuovi nanovesicles multifunzionali intrinseche chiamati porphysomes, che hanno struttura-dipendente fluorescenza auto-estinzione e le proprietà fototermiche uniche, fungendo così gli agenti di terapia fototermica come potenti. Abbiamo formulato porphysomes utilizzando estrusione ad alta pressione e studiato l'efficacia della terapia photothermal in un modello di tumore xenotrapianto.

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablazione del tumore Utilizzando Porphysomes, intrinseca multifunzionale nanovesicles

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

Le cellule staminali sono promettenti vettori terapeutici per curare i tumori cerebrali a causa del loro tropismo tumorale intrinseco. La consegna delle cellule staminali intranasali non invasive bypassa la barriera del cervello e dimostra un forte potenziale per la traduzione clinica. Questo articolo riassume i principi fondamentali della consegna delle cellule staminali intranasali in un modello di topo di glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

In passato, piccolo animale irradiazione solitamente è stato effettuato senza la possibilità di indirizzare un volume del tumore ben delineati. L'obiettivo era quello di imitare il trattamento del glioblastoma umano in ratti. Utilizza una piattaforma piccola irradiazione degli animali, abbiamo effettuato MRI-guida 3D conformal irradiazione con PET-base sub-volume d'amplificazione in un ambiente preclinico.

PET e MRI guidate irradiazione di un modello del ratto di Glioblastoma utilizzando un Micro-irradiatore

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare iniezione ultrasuono-guida del neuroblastoma (NB) e cellule (ES) il sarcoma di Ewing (stabilito linee cellulari e cellule tumorali derivate dal paziente) biologicamente rilevanti siti per creare modelli preclinici affidabili per il cancro ricerca.

L'utilizzo degli ultrasuoni guidati l'impianto cellulare diretto del tessuto per l'istituzione degli xenotrapianti del tumore metastatico biologicamente rilevanti

Questo protocollo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un trans- ciclottene (TCO)-anticorpo e un radioligand tetrazine Lu-etichettati (Tz) 177per pretargeted radioimmunotherapy (PRIT) modifica. Inoltre, vi si descrive l'uso di questi due costrutti di biodistribuzione in vivo e studi longitudinali terapia in un modello murino di cancro colorettale.

Pretargeted Radioimmunotherapy basato sulla reazione di Diels-Alder domanda inversa Electron

Qui presentiamo un protocollo per eseguire la radioterapia preclinica basata sulla tomografia ad emissione di positroni in un modello di glioblastoma di ratto utilizzando algoritmi sviluppati internamente per ottimizzare l'accuratezza e l'efficienza.

Radioterapia con pittura a dose basata sulla tomografia a emissione di positroni in un modello di ratto glioblastoma utilizzando la piattaforma di ricerca sulle radiazioni dei piccoli animali

Il glioblastoma è una forma devastante di cancro cerebrale primario e la terapia termica interstiziale laser sta emergendo come una promettente alternativa alla resezione chirurgica convenzionale per il glioblastoma inoperabile. Questo protocollo descrive un modello murino preclinico ottimizzato che può essere utilizzato per studiare gli effetti del trattamento o trattamenti adiuvanti e combinatori.

Un modello murino immunocompetente per la terapia termica interstiziale laser del glioblastoma

Scopri come trattare i teratomi derivati da cellule staminali pluripotenti con radioterapia a fascio esterno nel modello murino. Questo metodo consente di colpire selettivamente il tumore minimizzando i danni ai tessuti circostanti.

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Trattamento mirato e selettivo dei Teratomas di derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando radiazione esterna del fascio in un modello di piccoli animali

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