Name: Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri un protocollo per studiare l'attivazione, la proliferazione e la differenziazione Th1 delle cellule T CD4 naïve in vivo utilizzando cellule dendritiche derivate dal midollo osseo di topo.

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Ringraziamo il Dr. Simon Bartlett per l'editing di inglese. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), il programma di Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; con il co-finanziamento del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Il CNIC è supportato dal Ministero dell'economia, industria e competitività (MEIC) e la Fondazione Pro CNIC, è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF è fondata da Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG da ISCIII, BHF di Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G dal ISCIII Miguel Servet programma e imas12.

Procedure sperimentali sono state approvate dalla Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) e la Comunidad Autónoma de Madrid conformemente agli orientamenti spagnoli ed europei. I topi sono stati allevati in condizioni di agente patogeno specifico libera (SPF) e sono stati eutanasizzati per inalazione di anidride carbonica (CO2).
1. isolamento delle cellule del midollo osseo del topo da tibie e femori
Nota: Il ceppo di topo C57BL/6 Congenici trasporta l'indicatore differenziale del leucocita Ptprcuna, generalmente riconosciuto come CD45.1 o Ly5.1, considerando che il selvaggio-tipo C57BL ceppi Ptprcb dell'allele, conosciuto come CD45.2 o Ly5.2. Varianti CD45.1 e CD45.2 possono essere distinti da citometria a flusso facendo uso degli anticorpi. Topi CD45.1, CD45.2 e CD45.1/CD45.2 possono essere utilizzati come fonti di cellule o come destinatari per trasferimento adottivo, permettendo l'analisi delle popolazioni distinte delle cellule tramite flusso cytometry. Utilizzare preferenzialmente età- e sesso-abbinato maschi o femminili topi sotto 12 settimane di età.
<ol><li>
Preparazione dei femori e tibie
	<ol>
<li>Eutanasia topi utilizzando il protocollo approvato dal Comitato istituzionale cura degli animali.</li>
		<li>Disinfettare le zampe spruzzando la superficie animale con etanolo al 70%.</li>
		<li>Utilizzare bisturi, pinze e forbici sterili. Con un bisturi, fare un taglio nella pelle e rimuovere la pelle dalla parte distale del mouse compreso la pelle che copre l'estremità posteriore. Sbucciare la pelle intorno al muscolo del polpaccio inferiore e rimuovere la pelle dalle gambe completamente (Figura 2A, 2B).</li>
		<li>Separare il muscolo quadricipite dal femore usando un bisturi. Disarticulate l'articolazione dell'anca senza rompere la testa del femore. Rimuovere i muscoli dalla tibia usando un bisturi (Figura 2, 2D). Separare il femore dalla tibia senza rompere l'estremità dell'osso.</li>
		<li>Mantenere le ossa in una piastra Petri contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina nel mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x ghiacciata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolamento delle cellule Nota: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti sotto una cappa di cultura e con materiale sterile per evitare la contaminazione.<ol>
<li>In una piastra Petri sterile, con cura di tagliare le estremità prossimale e distale di ogni osso con un bisturi.</li>
		<li>Lavare le ossa ripetutamente con un volume totale di 10 mL di caldo terreno RPMI completo (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% di penicillina/streptomicina, 20 mM HEPES, 55 µM 2-mercaptoetanolo, piruvato di sodio di 1 mM e 2 mM L-Glutammina). Lavare le ossa da entrambe le estremità con un ago 25 G collegato ad una siringa da 1 mL.</li>
		<li>Trasferire il effluate in una provetta conica 50 mL con 70 µm in nylon web filtro. Attentamente sloggiare conglomerati delle cellule e detriti di agitazione delicata e pipettaggio.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 10 min a temperatura ambiente (TA).</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi di globulo rosso freddo (0,15 M NH4Cl + 1mm KHCO3 + 0,1 mM EDTA, pH regolato a 7,2 con 1 N HCl, 0,4 µm sterile filtrato e conservato a 4 ° C). Mantenere in ghiaccio per 5 minuti con il manuale di agitazione.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di tampone di freddo (1 x 2 mM EDTA, tamponato fosfato salino (PBS) + 2% albumina di siero bovino (BSA)) per inattivare e lavare il buffer di lisi di globuli rossi.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare le cellule con 25 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo. Mix 50 µ l di sospensione cellulare 1:1 con trypan blu. Determinare il numero di cellule in una camera di conteggio al microscopio. Calcolare il numero di cellulare utilizzando la formula: cellule/mL = [(non macchiato delle cellule totali/4) x 2 x 10.000]12. Nota: Questo metodo rese 40 x 106 a 60 x 106 osseo cellule di midollo per 8 non infetti al mouse di C57BL/6 settimana-vecchio 12.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC differenziazione, maturazione e caricamento di antigene
<ol><li>
Raccolta delle cellule di BM
	<ol>
<li>Seme della cultura completa sulle piastre di superficie 6 pozzetti ultra-low-allegato a 106 cellule per mL di terreno, in genere in 5 mL per pozzetto. Macrofagi differenziati attribuirà alle piastre di coltura. Dopo 12 h, trasferire il surnatante, contenente principalmente i monociti, per pulire le piastre da 6 pozzetti, scartando i vecchi 6 pozzetti con i macrofagi aderiti.</li>
		<li>Per promuovere la differenziazione cellulare, coltura le cellule non-aderenti a 5 x 105 cellule / mL in genere 5ml per pozzetto di terreno RPMI completo contenente 20 ng/mL ottenuto commercialmente ricombinante GM-CSF murino a 37 ° C e 5% di anidride carbonica (CO2) e osservare quotidianamente.</li>
		<li>Ogni 3 giorni, rotazione verso il basso le cellule sospese e raccogliere le celle aderenti con 5 mM EDTA in PBS e rotazione verso il basso. Combinare e risospendere a 5 x 105 cellule/mL in mezzo fresco che contiene 20 ng/mL rm-GM-CSF.</li>
		<li>Il giorno 8, raccogliere le cellule aderenti e distaccate come sopra e risospendere a 5 x 105 cellule/mL in media da 20 ng/mL GM-CSF e 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) per 24 h in un non-coltura del tessuto-trattati sterile di Petri, per indurre alta MHC-II , Espressione di CD80 e CD86.</li>
		<li>Differenziazione di controllo DC mediante citometria a flusso come indicato al punto 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di maturazione e differenziazione di citometria a flusso.
	<ol>
<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
		<li>Recettori Fc blocco incubando il pellet cellulare sedimento nel stampo del ricevitore del mouse Fc (purificato anti anticorpo IgG CD16/CD322b ) per 15 min a 4 ° C secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Per ogni sonda, risospendere le 250.000 cellule a 300 µ l di tampone di citometria a flusso (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) a 4 ° C.</li>
		<li>Trasferire 30 µ l di soluzione di cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e aggiungere 30 µ l di anticorpo-contenente buffer per ogni bene seguendo le indicazioni del produttore. Incubare le cellule con anticorpi per 20 min a 4 ° C. Nota: In genere impiegati marcatori per DCs, monociti e macrofagi sono CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 e CD86 (Figura 3).</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere in 200 µ l di tampone di citometria a flusso freddo contenente un marcatore per escludere le cellule morte (ad es., ioduro di propidio, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o un colorante ammina-reattivo ) del produttore concentrazione consigliata13.</li>
		<li>Monitorare la differenziazione delle cellule trasferire i campioni ai tubi di flusso cytometry ed effettuando l'analisi di citometria a flusso escluse le cellule morte nei giorni 0, 3, 6 e 9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carico DC antigene.
	<ol>
<li>Il giorno 8, centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in media di 200 µ l (RPMI + 10% FBS senza antibiotici). Ripetere questo passaggio due volte.</li>
		<li>Incubare il DCs con 10 µ g/mL OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) a 1 x 107 DCs in 1 mL di terreno (RMPI + 1% FBS) in un tubo di plastica per almeno 30 min a 37 ° C. Uso non caricati OVAp DCs come una condizione di controllo negativo.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in terreno RPMI completo di 200 µ l. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in media di 200 µ l (RPMI + 10% FBS) a 2 x 106 cellule/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. isolamento di cellule T CD4 ingenuo da Paolo topi
Nota: Questo metodo produce circa 100 x 106 spleenocytes a 8 non infetti al mouse di C57BL/6 settimana-vecchio 12. Possono essere utilizzate sia maschi che femmine. Cellule T CD4 possono essere isolate dalla milza o linfonodi; Cellule T CD4 rappresentano circa il 25% e il 50% delle cellule in questi organi, rispettivamente. Effettuare le seguenti operazioni in condizioni di sterilità.
<ol><li>Isolare i linfonodi inguinali, ascellari, brachiali, cervicali e mesenterici e la milza da topi transgenici Paolo (Figura 4) e trasferirli in una capsula di Petri contenente 10 mL di terreno RPMI completo di plastica.</li>
	<li>Sciacquare il filtro cella con 2 mL di terreno RPMI completo e rimuoverlo dal tubo 50 mL. Trasferimento di linfonodi e milza per un colino di cella di 70 µm collocato in una provetta da 50 mL. Omogeneizzare mediante un pistone della siringa (Figura 5) e aggiungere il terreno fino a 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 250 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet in 15 mL di terreno RPMI completo. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
	<li>Per sospensione di cellule di milza, risospendere il pellet cellulare e lisare cellule rosse del sangue, come indicato nel passaggio 1.2.5.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 250 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare le cellule con 25 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 minuti a TA.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 5 mL di terreno. Mescolare 50 µ l di sospensione cellulare 1:1 con Trypan blue. Determinare il numero di cellulare utilizzando una camera di conteggio al microscopio. Calcolare il numero di cellulare utilizzando la formula: cellule/mL = [(non macchiato delle cellule totali/4) x 2 x 10.000]12.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.2.2.</li>
	<li>Seguendo le istruzioni del produttore, incubare le cellule con diluizioni 1: 800 di anticorpi biotinilati CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 e DX5 per 30 min in ghiaccio per poi selezione negativa delle cellule T CD4.</li>
	<li>Seguendo le istruzioni del produttore e sulla base del numero delle cellule e la capacità dei branelli, calcolare la quantità necessaria di microperle magnetiche rivestite con streptavidina e isolare le cellule T CD4 + utilizzando un separatore magnetico delle cellule e l'appropriato colonne di separazione.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo e tenerli sul ghiaccio mentre il conteggio di cellule vive, come descritto al punto 3.7.</li>
	<li>Estrarre 2 x 105 celle e verificare la purezza delle cellule raccolte utilizzando anti-CD4, CD3, B220 e CD8 anticorpi fluorescenti in un citometro a flusso con diluizioni di anticorpo produttore-consigliare.</li>
	<li>Per macchiare le cellule di T di CD4/Paolo isolato naif, risospendere le cellule in 500 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) 10-6 . Preparare 500 µ l tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) raddoppiare la concentrazione consigliata dal produttore finale di colorante tracciante vitale delle cellule. Mescolare entrambe le soluzioni aggiungendo lentamente la soluzione di tracciante cellulare alla sospensione di cellule. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Lavare le cellule con 5 mL di terreno RPMI completo e centrifugare a 250 x g per 5 min a 4 ° C. Ripetere questo passaggio due volte. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno RPMI completo a 1 x 107cellule/mL.</li>
</ol>4. in Vivo l'attivazione, proliferazione e analisi di differenziazione Th1
Nota: L'estere di succinimidyl diacetato di cellula vitale tracciante colorante carboxyfluorescein (CFSE) e altri coloranti a base di estere succinimidyl, che sono eccitati ed emettono fluorescenza a diverse lunghezze d'onda, sono ampiamente utilizzati per valutare la proliferazione dei linfociti di flusso citometria a causa della loro intensità alta fluorescenza, lunga durata, bassa variabilità e bassa tossicità14.
<ol><li>Passivamente trasferimento per via endovenosa (i.v.) 1 x 106 dal vivo e vitale delle cellule tracciante colorante-macchiato ingenuo CD4/Paolo T cellule in 100 µ l di PBS per topo. Le cellule di T con etichettate possono essere trasferite passivamente dalla vena caudale o retro-orbitale iniezione15; in entrambi i casi, le cellule saranno sede di organi linfoidi (Figura 6A).</li>
	<li>Sfida i topi destinatari un giorno più tardi trasferendo passivamente 100.000 LPS-maturato caricato OVAp DCs per via sottocutanea (s.c.) in footpads (Figura 6B).</li>
	<li>Raccogliere poplitea linfonodi da topi destinatari ed elaborarli fino all'ottenimento delle sospensioni di cellule singole seguendo la stessa procedura come descritta in precedenza in 3.1 e 3.2. Fare questo post-immunizzazione giorno 2 per misurare l'attivazione delle cellule T CD4/Paolo ed il giorno 5 per misurare la proliferazione e la differenziazione Th1.</li>
	<li>Per analizzare l'attivazione delle cellule T il giorno 2, macchia le cellule con anticorpi fluorescenti di CD4, CD69 e CD25 (facoltativamente CD45.1 e CD45.2) e determinare la percentuale di C69+CD25+ T cellule nella popolazione CD4. Analizzare mediante citometria a flusso (Figura 7).</li>
	<li>Per controllare la proliferazione delle cellule T il giorno 5, macchia le celle utilizzando appropriati anticorpi fluorescenti CD4 e facoltativamente CD45.1 e CD45.2. Analizzare il decadimento del segnale vitale delle cellule tracciante colorante nella popolazione CD4 da citometria a flusso (Figura 8). Diversi parametri possono essere determinati in questi studi, come il numero di divisioni cellulari subito dalle cellule etichettate con il colorante tracciante vitali delle cellule, la percentuale di divisione delle cellule in ogni picco di fluorescenza e la percentuale di divisione delle cellule nella cella totale popolazione.</li>
	<li>Per determinare la differenziazione Th1 giorno 5, 400.000 cellule piastra per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in 200 µ l di terreno RPMI completo contenente 1 µM ionomicina e 10 ng/mL phorbol 12 miristato 13 acetato (PMA) per 6 h a 37 ° C nell'incubatore. Per l'ultimo 4 h, aggiungere 3 – 10 µ g/mL brefeldina A per bloccare la secrezione di citochina al mezzo.</li>
	<li>Centrifugare le piastre per 5 min a 250 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante di inversione rapida della piastra 96 pozzetti.</li>
	<li>Ripetere il punto 2.2.2.</li>
	<li>Macchia le membrane cellulari mediante incubazione per 15 min a 4 ° C in 30 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) contenente al CD4 e, facoltativamente, a CD45.1 e CD45.2 alle diluizioni consigliate dal produttore. Lavare le cellule con l'aggiunta di 150 µ l di tampone (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) e centrifugare le piastre per 5 min a 250 x g a 4 ° C ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Fissare le cellule aggiungendo 100 µ l di paraformaldehyde/1% 2% saccarosio per 20 min a RT. centrifuga le piastre per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Permeabilize le cellule aggiungendo 50 µ l di tampone di permeabilizzazione intracellulare (1x PBS + 0.1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponine) ed incubare per 30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 150 µ l di PBS e centrifugare per 5 minuti a 1.000 x g a RT. scartare il surnatante.</li>
	<li>Macchia di citochine intracellulari aggiungendo 30 µ l di fluorophore-coniugato anti anticorpo IFNγ nel buffer (PBS + 0.1% saponine) e incubare per 30 minuti a TA.</li>
	<li>Lavare le cellule con l'aggiunta di 150 µ l di tampone (PBS + 0.1% saponine). Centrifugare le piastre per 5 min a 1.000 x g a RT e scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
	<li>Analizzare le popolazioni delle cellule mediante citometria a flusso (Figura 8).</li>
</ol>

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<li>Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Questo protocollo consente la caratterizzazione della capacità del DCs BM-derivato di modulare l'attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T CD4 Naive. Inoltre, può anche essere utilizzato per valutare la suscettibilità delle cellule T CD4 + a modulazione da DCs BM-derivato. Con questo protocollo, le modifiche a questi eventi possono essere misurato in vivo.
Secondo l'ipotesi in esame, diverse combinazioni di cellule T e DC possono essere usati. Ad esempio, si posso...

Le cellule T CD4 + e cellule (APCs) come DCs presentanti l'antigene sono necessari mediatori di immunità agli agenti patogeni microbici1,2. Negli organi linfoidi periferici, le cellule T CD4 sono attivate al momento della rilevazione di antigeni specifici presentati da APC3,4,5. Linfociti T CD4 attivati proliferano e si differenziano in cellule effettrici specifiche distinte del Th che sono necessari per lo sviluppo di una corretta risposta immunitaria adattativa6,7. Controllo di questi processi è fondamentale per la produzione di un'adeguata difesa adattiva che uccide l'agente patogeno senza produrre tessuto nocivo danni8. Cellule del Th sono definite secondo l'espressione o la produzione di molecole di superficie, fattori di trascrizione e le citochine effettrici e svolgono funzioni essenziali e precisione in risposta ad agenti patogeni1. Cellule del sottoinsieme delle cellule Th1 esprimono il fattore di trascrizione T-scommessa e la citochina interferone γ (IFNγ) e partecipano nella difesa ospite contro patogeni intracellulari1. Quantificazione dell'attivazione di cellule T CD4 Naive, proliferazione e differenziazione Th1 è un strumento utile per valutare il ruolo T cellule nella risposta immunitaria.
Questa protocollo consente in vivo analisi della capacità di in vitro -generato DCs BM-derivato di modulare l'attivazione, proliferazione e differenziazione Th1 delle cellule T CD4 Naive. Il protocollo serve anche a valutare la capacità delle cellule T CD4 Naive per essere attivato, indotti a proliferare e Th1 differenziato (Figura 1). Questo protocollo versatile elude l'incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate in puramente in vivo protocolli. Gli effetti di diverse molecole e trattamenti su controller di dominio possono essere studiati utilizzando BM da topi geneticamente modificati5 o trattamento o manipolare geneticamente isolata BM cellule9. Allo stesso modo, le risposte delle cellule T possono essere esplorate di ottenimento delle cellule di T per trasferimento adottivo da fonti diverse o dopo diverse manipolazioni3,8,10.
I principali vantaggi di questo protocollo sono duplici. L'attivazione delle cellule t, la proliferazione e la differenziazione Th1 sono analizzati con un approccio di citometria a flusso; e questo è combinato con studi in vivo , così evitare le alterazioni che possono verificarsi in vitro e compresi tipi cellulari e altri fattori solo trovati in organi intatti11.
L'uso di coloranti vitali è una tecnica ampiamente utilizzata per tenere traccia di proliferazione delle cellule, evitando l'uso di radioattività. La misurazione di proliferazione con questi reagenti si basa sulla diluizione della tintura dopo la divisione cellulare. Inoltre, questi coloranti possono essere rilevati a più lunghezze d'onda e facilmente sono analizzati tramite flusso cytometry in combinazione con più anticorpi fluorescenti o marcatori. Evidenziamo l'utilità del presente protocollo, mostrando come l'attivazione delle cellule T, la proliferazione e la differenziazione Th1 possono essere analizzati tramite flusso cytometry.

<table><tbody><tr><td>Etanolo</td><td>VWR Chemicals</td><td>20,824,365</td> 5 <td>L</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumenti per la scienza fine (FST)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Strumenti per la scienza fine (FST)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti per la scienza fine (FST)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Strumenti per le scienze fini (FST)</td><td>10020-00</td><td>Scatola da 100 lame</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterili</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 25</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubi conici</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubi conici</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro a nastro in nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per lisi del sangue rosso</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 Ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES)</td><td>Cambrex</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanolo</td><td>Merck</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Granulocita murino ricombinante Fattore stimolante le colonie di macrofagi (GM-CSF)</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>lipopolisaccaride (LPS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr> piastra <tr><td>a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 anti-topo Anticorpo CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo Anticorpo CD64</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo Anticorpo CD115</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo Anticorpo CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo Anticorpo MHCII</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo Anticorpo CD86</td><td>BioLegend</td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo Anticorpo CD80</td><td>BioLegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria a flusso</td><td>Zelian</td><td>300800-1</td><td>PS 12X75 5mL</td></tr><tr><td>OTII Peptide</td> <td>di ovoalbuminaInvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD8&alfa biotinilato di topo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo IgM biotinilato di topo</td><td>BioLegend</td><td>406503</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo B220 biotinilato di topo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CD19 biotinilato di topo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo MHCII (I-Ab) biotinilato di topo</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo biotinilato CD11b</td><td>anticorpo Tonbo Biosciences</td><td>30-0112-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo biotinilato CD11c anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>117303</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo biotinilato CD44 anti-topo</td><td>BioLegend</td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo biotinilato Anticorpo CD25</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo biotinilato DX5 anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>microsfere magnetiche rivestite di streptavidina</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Separatore di cellule magnetiche</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>QuadroMACS Separatore</td></tr><tr><td>Colonne di separazione</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo CD4 anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo CD3 anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo CD8 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Violet Tracer</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo CD25 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 anti-topo CD69 anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCY5.5 anti-topo CD45.1 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo CD45.1 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PECY7 anti-topo CD45.1 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo CD45.2 anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12 Myristate 13 Acetato (PMA)</td><td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td><td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di permeabilizzazione intracellulare</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo IFNg anticorpo</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (anti-topo CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6. Topi SJL CD45.1</td><td>Il</td><td>laboratorio Jackson 002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&commercio; Analizzatore cellulare</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di topo in vivo di attivazione delle cellule t naïve cd4 di misura, la proliferazione e la differenziazione th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantificazione dell'attivazione di cellule T CD4 Naive, la proliferazione e la differenziazione di T helper 1 (Th1) cellule è un modo utile per valutare il ruolo svolto dalle cellule di T in una risposta immunitaria. Questo protocollo descrive la differenziazione in vitro di progenitori del midollo osseo (BM) per ottenere granulocita macrofago distimolazione factor (GM-CSF) derivato-cellule dendritiche (DCs). Il protocollo descrive anche il trasferimento adottivo del peptide di ovoalbumina (OVAp)-caricato di GM-CSF-derivati DCs e cellule T CD4 Naive da topi transgenici Paolo al fine di analizzare l'attivazione in vivo , la proliferazione e la differenziazione Th1 della trasferite le cellule T CD4. Questo protocollo elude la limitazione di puramente in vivo metodi imposti dalla incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate. Inoltre, questo protocollo permette studi in un ambiente in vivo , evitando così alterazioni di fattori funzionali che possono verificarsi in vitro e compreso l'influenza di tipi cellulari e di altri fattori trovati solo negli organi intatti. Il protocollo è uno strumento utile per la generazione di cambiamenti nel sistema DCs e cellule di T che modificare le risposte immunitarie, potenzialmente fornire risultati importanti per capire l'origine o lo sviluppo di numerose patologie immuni.

La figura 1 illustra i passaggi descritti in questo protocollo. La figura 2 illustra l'isolamento e la coltura delle cellule BM del topo. L'aggiunta di GM-CSF e LPS a queste culture permette la generazione in vitro e maturazione della DCs. Figura 3 illustra l'analisi di citometria a flusso della differenziazione e maturazione della DCs. OVAp-caricato GM-CSF BM-derivato DCs ottenuti e isolato...

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione in vivo dell'ingenuo T CD4 delle cellule (cellule T) attivazione, proliferazione e differenziazione Th1, indotta da GM-CSF midollo osseo (BM)-derivato le cellule dendritiche (DCs). Inoltre, questo protocollo descrive isolamento BM e T-cell, generazione di DC e DC e T-cell trasferimento adottivo.

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia sull'attivazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule T1, nonché sulla stimolazione dell'immunità adattativa delle cellule che presentano l'antigene. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio di un ambiente in vivo e contemporaneamente la manipolazione cellulare in vitro. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di isolamento degli organi e delle ossa e di trasferimento adottivo sono difficili da padroneggiare solo attraverso le istruzioni testuali.Per l'isolamento delle cellule del midollo osseo, disinfettare gli arti posteriori di un topo adulto con etanolo al 70% e utilizzare le forbici per praticare un'incisione cutanea laterale sugli arti posteriori. Inserire le forbici nella parte mediale delle zampe e tagliare la pelle con le forbici fino all'inizio degli arti posteriori. Quindi usa una pinza per separare la pelle dalle gambe.Usando le forbici, separa il muscolo dal femore e dalla tibia e usa le forbici per disarticolare l'articolazione dell'anca, rompendo la testa del femore. Quindi separare la femura dalla tibia senza rompere le estremità ossee e posizionare le ossa in una capsula di Petri di mezzo completo su ghiaccio. Quando tutte le ossa sono state raccolte, tagliare con cura le estremità prossimale e distale di ciascun osso con un bisturi e utilizzare una siringa da 1 milliletro dotata di un ago da 25 calibri per lavare ripetutamente le ossa con un volume totale di 10 millilitri di terreno RPMI completo caldo.Quando tutte le ossa sono state lavate, trasferire l'intero contenuto della piastra in una provetta conica da 50 millilitri dotata di un filtro a nastro di nylon con pori da 70 micrometri e rimuovere accuratamente eventuali detriti e conglomerati cellulari mescolando delicatamente e pipettando. Raccogliere le cellule del midollo osseo mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in un milliletro di tampone per lisi dei globuli rossi a quattro gradi Celsius con pipettaggio e incubare la miscela su ghiaccio per cinque minuti.Al termine dell'incubazione, interrompere la lisi con 10 millilitri di PVS e risospendere il pellet in 25 millilitri di terreno completo per una seconda centrifugazione. Quindi risospendere le cellule in 5 millilitri di terreno completo fresco per il conteggio e centrifugare nuovamente le cellule. Per l'isolamento secondario delle cellule del tessuto linfoide, raccogliere i linfonodi inguinali, ascellari, brachiali, cervicali e mesentarici e la milza da topi transgenici OT-II e trasferire i tessuti linfoidi secondari in una capsula di Petri di plastica contenente 10 millilitri di terreno RPMI completo.Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, trasferire i linfonodi e la milza in un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e utilizzare uno stantuffo a siringa per omogeneizzare i tessuti. Lavare il colino con un massimo di 15 millilitri di terreno e centrifugare le cellule. Quindi isolare le cellule T CD4-positive mediante smistamento con biglie magnetiche, secondo i protocolli standard.Per l'attivazione in vivo delle cellule T CD4-positive OT-II naive, etichettare le cellule T isolate da biglie magnetiche con colorante tracciante di cellule vitali, secondo i protocolli standard, e risospendere le cellule marcate a una concentrazione di 10-6 cellule per 100 microlitri di PBS. Quindi trasferire adottivamente 100 microlitri di cellule per animale attraverso la vena caudale. Pre-riscaldare i topi prima dell'iniezione per assicurarsi che le vene della coda siano sufficientemente dilatate da consentire l'erogazione dell'intero volume cellulare.Dopo 24 ore, somministrare da 10 al quinto OVA maturato con LPS e caricate con peptidi mediante iniezione sottocutanea nel cuscinetto del piede di ciascun animale iniettato con cellule T. Due e cinque giorni dopo la sfida adottiva, prelevare i linfonodi popliziali dagli animali riceventi per il trattamento dei tessuti e l'isolamento delle cellule T, come dimostrato. Per analizzare l'attivazione delle cellule T, colorare le cellule isolate il secondo giorno con anticorpi fluorescenti contro CD4, CD69 e CD25 per determinare la percentuale di cellule T CD64-positive e CD25-positive all'interno della popolazione CD4-positiva ricevente mediante citometria a flusso.Per valutare la proliferazione delle cellule T, colorare le cellule isolate al quinto giorno con gli anticorpi fluorescenti appropriati contro CD4 e analizzare il decadimento del segnale del colorante tracciante delle cellule vitali nella popolazione di cellule T CD4-positive del donatore mediante citometria a flusso. Per valutare la differenziazione Th1, piastra quattro volte 10 al quinto giorno con cinque cellule T isolate per pozzetto in 200 microlitri di terreno completo, integrato con ionomicina e PMA per pozzetto, in una piastra a 96 pozzetti. Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per sei ore, aggiungendo Brefeldin A a ciascun pozzetto per bloccare la secrezione di citochine durante le ultime quattro ore della stimolazione.Al termine dell'incubazione, centrifugare la piastra e scartare il surnatante mediante rapida inversione. Colorare le cellule con anticorpi anti-CD4, quindi fissare in 100 microlitri il 2% di paraformaldeide e l'1% di saccarosio per 20 minuti a temperatura ambiente. Permeabilizzare le cellule con 50 microlitri di tampone di permeabilizzazione per 30 minuti a 4 gradi Celsius, seguito da un lavaggio di centrifugazione con 150 microlitri di PBS per pozzetto.Successivamente, colorare le citochine intracellulari di interesse, secondo i protocolli standard per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi di centrifugazione con 150 microlitri di PBS integrati con l'1% di saponina per pozzetto. Quindi, analizzare le cellule mediante citometria a flusso. L'analisi citofluorimetrica di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo GM-CSF dopo stimolazione con LPS, rivela una sovraregolazione dei marcatori di maturazione, come MHCII, CD80 e CD86.Le cellule T OT-II CD4 positive naive si attivano dopo il trasferimento adottivo agli animali riceventi grazie alla loro sovraregolazione dei marcatori di attivazione delle cellule T, all'espressione superficiale e ai cicli multipli di divisione cellulare. Dopo l'attivazione, le cellule T OT-II CD-positive proliferanti dimostrano un fenotipo Th1, come dimostrato dalla loro espressione intracellulare di interferone gamma. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in otto ore se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di preparare tutti i reagenti e i materiali il giorno prima dell'esperimento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in immunologia per studiare le cellule dendritiche e le cellule T nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il midollo osseo dai femori e dalla tibia dei topi e come trasferire le cellule T e le cellule dendritiche agli animali riceventi.Non dimenticare che lavorare con strumenti affilati come aghi, bisturi o forbici può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di un'adeguata protezione per le dita durante l'esecuzione di queste procedure.

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Immunologia e Infezioni

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Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

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Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

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Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

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Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo (Video) | JoVE Journal

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

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