Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia sull'attivazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule T1, nonché sulla stimolazione dell'immunità adattativa delle cellule che presentano l'antigene. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio di un ambiente in vivo e contemporaneamente la manipolazione cellulare in vitro. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di isolamento degli organi e delle ossa e di trasferimento adottivo sono difficili da padroneggiare solo attraverso le istruzioni testuali.

Per l'isolamento delle cellule del midollo osseo, disinfettare gli arti posteriori di un topo adulto con etanolo al 70% e utilizzare le forbici per praticare un'incisione cutanea laterale sugli arti posteriori. Inserire le forbici nella parte mediale delle zampe e tagliare la pelle con le forbici fino all'inizio degli arti posteriori. Quindi usa una pinza per separare la pelle dalle gambe.

Usando le forbici, separa il muscolo dal femore e dalla tibia e usa le forbici per disarticolare l'articolazione dell'anca, rompendo la testa del femore. Quindi separare la femura dalla tibia senza rompere le estremità ossee e posizionare le ossa in una capsula di Petri di mezzo completo su ghiaccio. Quando tutte le ossa sono state raccolte, tagliare con cura le estremità prossimale e distale di ciascun osso con un bisturi e utilizzare una siringa da 1 milliletro dotata di un ago da 25 calibri per lavare ripetutamente le ossa con un volume totale di 10 millilitri di terreno RPMI completo caldo.

Quando tutte le ossa sono state lavate, trasferire l'intero contenuto della piastra in una provetta conica da 50 millilitri dotata di un filtro a nastro di nylon con pori da 70 micrometri e rimuovere accuratamente eventuali detriti e conglomerati cellulari mescolando delicatamente e pipettando. Raccogliere le cellule del midollo osseo mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in un milliletro di tampone per lisi dei globuli rossi a quattro gradi Celsius con pipettaggio e incubare la miscela su ghiaccio per cinque minuti.

Al termine dell'incubazione, interrompere la lisi con 10 millilitri di PVS e risospendere il pellet in 25 millilitri di terreno completo per una seconda centrifugazione. Quindi risospendere le cellule in 5 millilitri di terreno completo fresco per il conteggio e centrifugare nuovamente le cellule. Per l'isolamento secondario delle cellule del tessuto linfoide, raccogliere i linfonodi inguinali, ascellari, brachiali, cervicali e mesentarici e la milza da topi transgenici OT-II e trasferire i tessuti linfoidi secondari in una capsula di Petri di plastica contenente 10 millilitri di terreno RPMI completo.

Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, trasferire i linfonodi e la milza in un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e utilizzare uno stantuffo a siringa per omogeneizzare i tessuti. Lavare il colino con un massimo di 15 millilitri di terreno e centrifugare le cellule. Quindi isolare le cellule T CD4-positive mediante smistamento con biglie magnetiche, secondo i protocolli standard.

Per l'attivazione in vivo delle cellule T CD4-positive OT-II naive, etichettare le cellule T isolate da biglie magnetiche con colorante tracciante di cellule vitali, secondo i protocolli standard, e risospendere le cellule marcate a una concentrazione di 10-6 cellule per 100 microlitri di PBS. Quindi trasferire adottivamente 100 microlitri di cellule per animale attraverso la vena caudale. Pre-riscaldare i topi prima dell'iniezione per assicurarsi che le vene della coda siano sufficientemente dilatate da consentire l'erogazione dell'intero volume cellulare.

Dopo 24 ore, somministrare da 10 al quinto OVA maturato con LPS e caricate con peptidi mediante iniezione sottocutanea nel cuscinetto del piede di ciascun animale iniettato con cellule T. Due e cinque giorni dopo la sfida adottiva, prelevare i linfonodi popliziali dagli animali riceventi per il trattamento dei tessuti e l'isolamento delle cellule T, come dimostrato. Per analizzare l'attivazione delle cellule T, colorare le cellule isolate il secondo giorno con anticorpi fluorescenti contro CD4, CD69 e CD25 per determinare la percentuale di cellule T CD64-positive e CD25-positive all'interno della popolazione CD4-positiva ricevente mediante citometria a flusso.

Per valutare la proliferazione delle cellule T, colorare le cellule isolate al quinto giorno con gli anticorpi fluorescenti appropriati contro CD4 e analizzare il decadimento del segnale del colorante tracciante delle cellule vitali nella popolazione di cellule T CD4-positive del donatore mediante citometria a flusso. Per valutare la differenziazione Th1, piastra quattro volte 10 al quinto giorno con cinque cellule T isolate per pozzetto in 200 microlitri di terreno completo, integrato con ionomicina e PMA per pozzetto, in una piastra a 96 pozzetti. Quindi posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per sei ore, aggiungendo Brefeldin A a ciascun pozzetto per bloccare la secrezione di citochine durante le ultime quattro ore della stimolazione.

Al termine dell'incubazione, centrifugare la piastra e scartare il surnatante mediante rapida inversione. Colorare le cellule con anticorpi anti-CD4, quindi fissare in 100 microlitri il 2% di paraformaldeide e l'1% di saccarosio per 20 minuti a temperatura ambiente. Permeabilizzare le cellule con 50 microlitri di tampone di permeabilizzazione per 30 minuti a 4 gradi Celsius, seguito da un lavaggio di centrifugazione con 150 microlitri di PBS per pozzetto.

Successivamente, colorare le citochine intracellulari di interesse, secondo i protocolli standard per 30 minuti a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi di centrifugazione con 150 microlitri di PBS integrati con l'1% di saponina per pozzetto. Quindi, analizzare le cellule mediante citometria a flusso. L'analisi citofluorimetrica di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo GM-CSF dopo stimolazione con LPS, rivela una sovraregolazione dei marcatori di maturazione, come MHCII, CD80 e CD86.

Le cellule T OT-II CD4 positive naive si attivano dopo il trasferimento adottivo agli animali riceventi grazie alla loro sovraregolazione dei marcatori di attivazione delle cellule T, all'espressione superficiale e ai cicli multipli di divisione cellulare. Dopo l'attivazione, le cellule T OT-II CD-positive proliferanti dimostrano un fenotipo Th1, come dimostrato dalla loro espressione intracellulare di interferone gamma. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in otto ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di preparare tutti i reagenti e i materiali il giorno prima dell'esperimento. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in immunologia per studiare le cellule dendritiche e le cellule T nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il midollo osseo dai femori e dalla tibia dei topi e come trasferire le cellule T e le cellule dendritiche agli animali riceventi.

Non dimenticare che lavorare con strumenti affilati come aghi, bisturi o forbici può essere estremamente pericoloso, quindi è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di un'adeguata protezione per le dita durante l'esecuzione di queste procedure.