Decellularizzazione di cuore umano intero all'interno di una custodia pressurizzata in un orientamento invertito
26 novembre 2018
Questo metodo consente di decellularizzazione di un organo solido complesso utilizzando un semplice protocollo basato su shock osmotico e l'aspersione di detergente ionico con rottura di matrice minimal organo. Si compone di una tecnica di decellularizzazione romanzo per cuori umani all'interno di una custodia pressurizzata con monitoraggio in tempo reale del deflusso di detriti cellulari e dinamiche flusso.
Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave sulla generazione di impalcature vascolarizzate, che sono in realtà il Santo Graal del campo dell'ingegneria tissutale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che una busta pressurizzata in orientamento invertito migliora la decellularizzazione degli organi umani non trapiantabili e ci consente di farlo in modo sterile in un lasso di tempo appropriato. Per preparare il cuore alla decellularizzazione, eseguire prima un'ispezione interna per eventuali difetti.
Se è presente un difetto del setto, correggere il difetto con le suture appropriate. Successivamente, ligate la vena cava superiore e inferiore con sutura di seta 2-0. Suturare la parete dell'atrio destro con 5-0 PROLENE e sezionare l'aorta lontano dall'arteria polmonare principale per la successiva cannulazione.
Inserire i connettori, in base al diametro del recipiente, nell'aorta e nell'arteria polmonare e fissare i connettori con 2-0 suture di seta. Utilizzando uno degli orifizi della vena polmonare, inserire una linea di tubi attraverso l'atrio sinistro verso il ventricolo sinistro e collegare una linea di infusione al connettore nell'aorta e una linea di deflusso al connettore nell'arteria polmonare. Posizionare il cuore preparato in una busta di poliestere nell'orientamento invertito e posizionare la busta in un contenitore perfusione.
Collegare ciascuna delle linee alle rispettive porte nel tappo di gomma, in base al diametro del contenitore, e inserire il tappo nel coperchio del contenitore di perfusione per sigillare la busta in poliestere. Quindi, perfondire PBS attraverso la porta di infusione del tappo di gomma per verificare il deflusso dall'arteria polmonare e dalla linea inserita nel ventricolo sinistro, utilizzando questo flusso per pulire l'organo da eventuali tracce residue di sangue all'interno della vascuola. Quando il cuore è pronto, posizionare il bioreattore assemblato in un orientamento verticale e collegare la linea di infusione, la linea della testa di pressione, la linea di deflusso dell'arteria polmonare e la linea di drenaggio del bioreattore alle porte di superficie del cappuccio di gomma sopra il bioreattore perfusione.
Quindi, decellularizzare il cuore per quattro ore con soluzione ipertonica, due ore con soluzione ipotonica, 120 ore con dodecil solfato di sodio, o SDS, e un lavaggio finale con 120 litri di PBS, il tutto sotto costante 120 millimetri di pressione di mercurio misurata alla radice aortica. Durante gli ultimi 10 litri del lavaggio PBS, aggiungere 500 millilitri di soluzione sterile di acido peracetico al 2,1% neutralizzata con 10 idrossido di sodio normale alla soluzione di perfusione per sterilizzare l'impalcatura. Tipicamente, la portata nell'aorta durante il processo di decellularizzazione diminuisce gradualmente man mano che la soluzione di perfusione cambia da ipertonica a ipotonica.
Al contrario, la portata aumenta quando la soluzione di perfusione viene cambiata da una soluzione ipotonica a SDS, a quel punto la portata dell'infusione dimostra fluttuazioni. Il tasso di deflusso dall'arteria polmonare dimostra una tendenza simile con le soluzioni iper-e ipotoniche. Tuttavia, il tasso di deflusso durante la perfusione SDS mostra una diminuzione complessiva.
Anche l'efficienza della perfusione coronarica diminuisce nel tempo poiché i diversi reagenti vengono perfusi attraverso la vascucolatura. Poiché il deflusso perfusa dall'arteria polmonare e dal ventricolo sinistro viene raccolto simultaneamente, il loro contenuto di detriti può essere confrontato mediante spettroscopia. La torbidità dell'effluente di entrambi i vasi diminuisce nel tempo durante le perfusioni, sebbene la torbidità dell'arteria polmonare mostri un cambiamento di colore più brusco rispetto a quello osservato dal ventricolo sinistro durante il periodo di perfusione iniziale.
La valutazione della correlazione tra la torbidità del deflusso e i detriti cellulari mediante un saggio di proteine dell'acido bicinchoninico da sei cuori umani decellularizzati rivela una correlazione lineare tra la concentrazione proteica e la torbidità degli effluenti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante monitorare la portata e raccogliere periodicamente il perfuso per monitorare effettivamente il processo di perfusione. Seguendo questa procedura, altre tecniche come la valutazione meccanica o il test di sterilità possono essere utilizzate per valutare la fedeltà dell'impalcatura e il suo potenziale uso per la ricellularizzazione per generare un tessuto cardiaco funzionale.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della medicina rigenerativa e dell'ingegneria tissutale per esplorare la generazione di interi organi vascolarizzati, cambiando letteralmente il campo del trapianto di organi solidi. Non dimenticare che lavorare con organi, tessuti e sostanze chimiche umani come la SDS può essere estremamente pericoloso e indossare sempre adeguate attrezzature di protezione personale quando si intraprende questa procedura.
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Panoramica
Questo metodo consente la descelularizzazione di organi solidi complessi, in particolare cuori umani, mediante un protocollo semplice che minimizza il danneggiamento della matrice dell'organo. La tecnica utilizza una sacca pressurizzata per il monitoraggio in tempo reale della dinamica del flusso e dell'efflusso dei detriti cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei Tessuti
- Decellularizzazione degli Organi
- Ricerca Cardiovascolare
Sfondo
- La decellularizzazione è fondamentale per creare scaffold vascolarizzati nell'ingegneria tissutale.
- I metodi attuali spesso alterano la matrice dell'organo.
- Sono necessarie tecniche migliorate per organi umani non trapiantabili.
- Il monitoraggio in tempo reale può migliorare il processo di decellularizzazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare una nuova tecnica di descellularizzazione per cuori umani.
- Migliorare la sterilità e l'efficienza del processo di descellularizzazione.
- Favorire la generazione di impalcature vascolarizzate.
Metodi Utilizzati
- Ispezione interna del cuore per rilevare difetti.
- Correzione dei difetti settali mediante sutura.
- Ligatura delle vene cave superiore e inferiore.
- Dissezione dell'aorta per la cannullazione.
Risultati principali
- La busta pressurizzata migliora l'efficienza della decellularizzazione.
- Il monitoraggio in tempo reale consente un migliore controllo del processo.
- È stata ottenuta una minima alterazione della matrice organica.
- Il metodo è applicabile in un ambiente sterile.
Conclusioni
- Questa tecnica rappresenta un notevole progresso nella decellularizzazione degli organi.
- Offre potenzialità per future applicazioni nell'ingegneria dei tessuti.
- Ulteriori ricerche potrebbero ampliarne l'utilizzo ad altri tipi di organi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La descellularizzazione di cuori umani interi mediante l'utilizzo di un sacco pressurizzato in orientamento invertito consente la generazione di impalcature vascolarizzate per l'ingegneria tissutale cardiaca, affrontando la necessità critica di organi trapiantabili. Questo metodo supporta una riduzione del rischio predittiva, preservando l'architettura della matrice extracellulare e permettendo il monitoraggio in tempo reale della dinamica della perfusione, il quale fornisce informazioni sulla qualità dell'impalcatura e sul potenziale di re-cellularizzazione. Tale approccio colloca la tecnica come capacità fondamentale per lo sviluppo del cuore bio-artificiale e per la riduzione della dipendenza da organi donatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi della composizione della matrice extracellulare cardiaca e dell'architettura vascolare per la validazione di bersagli terapeutici nelle terapie contro l'insufficienza cardiaca.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma riproducibile di supporto per studi meccanicistici delle interazioni tra cellule e matrice in tessuti malati rispetto a tessuti sani.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera scaffold standardizzati di origine umana per la valutazione quantitativa dell'insediamento cellulare, della proliferazione e dell'integrazione funzionale in modelli preclinici.
- Valore operativo: Favorisce la prontezza del saggio attraverso metriche di correlazione in tempo reale della torbidità e delle proteine, che consentono il controllo del processo e la coerenza tra un lotto e l'altro.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Favorisce la continuità traslazionale fornendo un impalcatura cardiaca umana rilevante per la malattia, utile per valutare strategie di recellularizzazione e la maturazione elettromeccanica.
- Valore operativo: Permette decisioni di avanzamento proporzionate al rischio mediante l'analisi correlativa della torbidità dell'effluente e della rimozione dei detriti cellulari come indicatore di controllo qualità.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostipite fino alla valutazione preclinica, fornendo una piattaforma di impalcatura vascolarizzata di origine umana.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su bersagli della matrice extracellulare cardiaca e la chiarificazione dei percorsi mediante il mantenimento dell'architettura tissutale nativa.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso la correlazione tra la torbidità misurabile del flusso in uscita e il saggio proteico con acido bicinconinico, per monitorare l'efficienza della decellularizzazione.
- Analitica: Fornisce parametri misurabili come la dinamica della portata, i gradienti di pressione e i profili di fuoriuscita delle particelle, che guidano l'ottimizzazione del processo e le decisioni di avanzamento o interruzione.
- Ricerca Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo un'impalcatura adatta alla ricellularizzazione e alla valutazione funzionale in modelli di malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile di generazione di impalcature applicabile in diversi programmi di riparazione e rigenerazione cardiaca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella fedeltà dello scaffold grazie alla conservazione della matrice extracellulare tridimensionale e delle strutture vascolari, riducendo l'ambiguità meccanicistica nell'ingegneria dei tessuti cardiaci.
- Valore operativo: Standardizzazione e scalabilità ottenute mediante un sistema a sacca pressurizzata, che consente una descellularizzazione sterile e monitorata per periodi di tempo prolungati.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione basate sul monitoraggio in tempo reale della perfusione e su parametri di rimozione dei detriti, riducendo i rischi biologici in fase avanzata nei portafogli di medicina rigenerativa.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta in base al rischio dei candidati scaffold attraverso la correlazione quantitativa tra torbidità e proteine, utilizzata come criterio di rilascio per i flussi di lavoro di ricellularizzazione.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nell'irrorazione d'organo, nella manipolazione dei reagenti per la decellularizzazione e nella lavorazione sterile dei tessuti.
- È dipendente da un'infrastruttura di bioreattore per perfusione in grado di mantenere una pressione costante di 120 mmHg e lo scambio multiplo di soluzioni reattive.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la raccolta del flusso in uscita, le procedure di spettroscopia e i saggi proteici, al fine di garantire una valutazione coerente della qualità dello scaffold.
- Comporta la necessità di adattamenti per diverse dimensioni d'organo e architetture vascolari quando l'applicazione va oltre i cuori umani.
- Include limitazioni pratiche legate ai rischi di esposizione ai reagenti (ad esempio, SDS, acido peracetico), che richiedono rigorosi protocolli di protezione individuale (PPE) e di contenimento.
