Una misura di cromatografia liquida ad alte prestazioni della chinurenina e acido chinurenico: materia biochimica di cognizione e di sonno in ratti

Questo metodo combina approcci biochimici e comportamentali per aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze sull'impatto di una sfida acuta di chinurenina nei ratti. Il vantaggio principale della tecnica è che fornisce un metodo affidabile e coerente per la misurazione dei metaboliti della via della chinurenina nel cervello e nel plasma di ratto. A dimostrare la procedura sarà Carly Fabian, una studentessa assistente di ricerca del mio laboratorio.

All'endpoint sperimentale appropriato dopo la somministrazione intraperitoneale di chinurenine, scongelare il plasma raccolto congelato su ghiaccio umido e diluire i campioni scongelati con acqua ultrapura. Trasferire 100 microlitri di campione diluito in contenitori individuali da 25 microlitri di acido perclorico al 6% e agitare i campioni in centrifuga. Quindi, trasferire 100 microlitri di surnatanti da ciascuna provetta in singole provette per microcentrifuga da 250 microlitri per la determinazione della chinurenina e dell'acido chinurenico.

Per la misurazione dell'acido chinurenico da campioni di cervello, scongelare i campioni di cervello raccolti congelati su ghiaccio secco e pesare individualmente ogni campione su una bilancia analitica precisa. Quando tutti i campioni sono stati pesati, spostare le provette su ghiaccio umido e diluire ogni campione di tessuto con un rapporto peso/volume di uno a 10 con acqua ultrapura, seguita da omogeneizzazione con un sonicatore. Aliquotare 100 microlitri di ciascun campione di liquame in una nuova provetta, quindi aggiungere 25 microlitri di acido perclorico al 25% per il vortice e la centrifugazione.

Quindi, trasferire 100 microlitri di surnatante in singole provette da microcentrifuga da 250 microlitri per la determinazione dell'acido chinurenico. Per preparare la macchina per cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, per l'analisi della chinurenine, posizionare prima le singole provette di aspirazione HPLC nei contenitori in fase mobile, acqua ultrapura e acetonitrile al 100%. Quindi, programmare lo strumento in modo che funzioni con il 5% di acetonitrile e il 95% di acqua ultrapura a 0,5 millilitri al minuto e lasciare che la macchina HPLC funzioni per 20-30 minuti.

Quando sono state raggiunte una pressione e un basale stabili, modificare la composizione della soluzione in una fase mobile al 5% di acetonitrile e al 95% di acetato di sodio ed equilibrare lo strumento per altri 30 minuti. Mentre lo strumento è in equilibrio, accendere la lampada nel rivelatore a fluorescenza. Prima della derivatizzazione, pompare la soluzione di acetato di zinco separatamente attraverso una pompa peristaltica che si combina con la post-colonna di fase mobile e accendere la pompa post-colonna a una portata di 0,1 millilitri al minuto per circa 20 minuti, fino a raggiungere una pressione stabile di circa 500 psi.

Quando lo strumento è pronto per l'analisi, impostare il software del sistema per controllare i parametri della sequenza del campione e per consentire l'autoiniezione di più campioni. Nella schermata Esegui campione, fare clic su File'e trascinare verso il basso fino a Crea nuovo set di campioni'selezionando Vuoto'nella nuova finestra. Elencare individualmente tutti gli standard e i campioni nell'ordine in cui devono essere eseguiti, con gli standard analizzati all'inizio e alla fine della sequenza.

Nella colonna delle funzioni, designare gli standard e i campioni e impostare il programma per iniettare acqua ogni cinque campioni. Impostare il tempo di esecuzione per ciascun campione a 15 minuti e iniettare 20 microlitri di campioni dagli standard, seguiti da 20 microlitri di campioni di plasma e 30 microlitri di campioni di omogeneizzato cerebrale come sperimentalmente appropriato. Quindi, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione in base al composto da misurare ed eseguire la sequenza.

Per quantificare i dati, aprire la schermata Sfoglia progetto e nella scheda Set di campioni, fare doppio clic sul set di campioni da quantificare. Dall'elenco delle iniezioni, evidenziare tutti gli standard e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Processo'nella nuova finestra. Quindi, utilizzare il menu a discesa per selezionare Calibra e quantifica'Evidenzia nuovamente tutti gli standard, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Rivedi'Quando i cromatogrammi si aprono, integrare e calibrare ciascuno standard per generare la curva standard.

Quindi, torna alla scheda Set di campioni e fai doppio clic sul set di campioni per quantificare e rivedere come dimostrato, integrando e quantificando ogni campione per produrre la concentrazione di ciascun campione in base alla curva standard creata in precedenza. L'analisi HPLC di campioni di tessuto prelevati da animali somministrati con chinurenina rivela un tempo di ritenzione della chinurenina di circa sei minuti e un tempo di ritenzione dell'acido chinurenico di circa 11 minuti. La quantificazione della chinurenina plasmatica e dell'acido chinurenico ippocampale rivela che l'iniezione acuta di chinurenina aumenta i livelli di acido chinurenico cerebrale con un picco raggiunto a due ore dopo l'iniezione che ritorna al basale a quattro ore dopo l'iniezione.

Sebbene non siano state osservate differenze di gruppo durante le prove di addestramento al paradigma di evitamento passivo, gli animali di controllo mostrano un aumento significativo della latenza per entrare nel lato oscuro durante le prove di test, indicando l'apprendimento contestuale, mentre gli animali iniettati con chinurenina 24 ore prima non mostrano lo stesso aumento della latenza, dimostrando un deficit nell'apprendimento. Inoltre, la valutazione dell'impatto di un aumento acuto della chinurenina durante la fase di luce sull'architettura sonno-veglia indica una riduzione della durata totale del sonno con movimenti oculari rapidi durante le prime due ore dopo l'iniezione di chinurenine. Questi dati sono rispecchiati da un aumento della durata della veglia durante questi periodi di tempo e da una leggera riduzione del sonno con movimenti oculari non rapidi, dimostrando che un aumento acuto della chinurenina causa anche disturbi nella dinamica sonno-veglia.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'analisi comportamentale possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sul ruolo dell'elevata formazione di acido chinurenico nella modulazione della cognizione e del sonno.