Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

L'obiettivo di questo protocollo è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte umane che esprimono proteine di fusione endogene fuse per terminali di tag fluorescenti N o C terminali. Per ottenere il knock in desiderato, utilizziamo il sistema CRISPR-Cas9 e un approccio basato sulla ribonucleoproteina utilizzando la proteina Cas9 di S.pyogenes wild type e un RNA CRSPR sintetico in due parti e tracrRNA. Questo RNP viene co-consegnato con la sequenza di tag fluorescente desiderata come plasmide donatore tramite elettroporazione.

Le cellule modificate putativamente che esprimono la proteina marcata fluorescente, sono arricchite da FACS. Vengono quindi generate linee clonali per l'analisi dei risultati di modifica precisi. Questo protocollo di editing genetico presenta molti vantaggi rispetto ai tradizionali costrutti di sovraespressione.

Poiché un tag fluorescente viene introdotto nel genoma, la localizzazione subcellulare e la dinamica della proteina di fusione risultante possono essere studiate sotto controllo regolatorio endogeno. Qui utilizziamo le cellule staminali pluripotenti indotte come sistema modello perché ci permette di studiare le proteine marcate in cellule diploidi non trasformate. Inoltre, poiché le cellule possono essere differenziate in più tipi di cellule, come le cellule dei cardiomiociti mostrate qui, questo approccio offre l'opportunità di creare e studiare proteine marcate in una varietà di contesti cellulari isogenici.

Tuttavia, con un'attenta ottimizzazione, questo protocollo potrebbe essere adattato per l'editing dei genomi di altri tipi di cellule di mammifero. Ciao, sono Amanda Haupt, faccio parte del team di cellule staminali e di editing genetico qui all'Allen Institute for Cell Science. Oggi, abbiamo utilizzato questo approccio per generare oltre 35 diverse linee cellulari che esprimono proteine di fusione endogene.

Li usiamo per studiare un'ampia varietà di strutture e processi cellulari unici. Questo approccio ha avuto successo fino al 95% dei loci tentati fino ad oggi con il nostro gruppo. Questo metodo sarà particolarmente utile per i biologi cellulari che sono interessati a comprendere meglio la dinamica di una proteina nelle cellule vive.

Tuttavia, una volta generate le linee clonali modificate, le possibilità di studio sono infinite. Con questo metodo siamo in grado di identificare in modo coerente i cloni che hanno tag proteici fluorescenti monoallelici senza altre interruzioni nella sequenza genomica. Occasionalmente siamo anche in grado di ottenere cloni modificati biallelicamente.

In questo video mostreremo alcuni dei passaggi chiave nella trasfetzione, nell'arricchimento FACS e nell'isolamento di linee cellulari clonali che esprimono proteine di fusione fluorescenti regolate endogenamente. Due o tre ore prima della trasfezione, trattare le hiPSC con dieci inibitori micromolari di ROCK integrati nei terreni di crescita. Ciò promuoverà la sopravvivenza dopo l'elettroporazione.

Le cellule avranno un aspetto appuntito dopo questo trattamento. Prima della trasfezione, le cellule devono essere rimosse dalla piastra di chiusura del tessuto utilizzando una singola regione di dissociazione cellulare e la sospensione cellulare deve essere raccolta in una provetta conica. Preparare un'aliquota di 1,84 volte 10 per le sei cellule per ogni condizione sperimentale da trasfettare.

Preparare provette del complesso ribonucleoproteico per ogni trasfezione aggiungendo 2,88 microlitri di RNA guida da 10 micromolari e 2,88 microlitri di Cas9 da 10 micromolari a una provetta da 1,5 mil. Incubare a temperatura ambiente per un minimo di 10 minuti, un massimo di un'ora. Pellettare l'aliquota della cella preparata nel passaggio precedente a 211 volte G per tre minuti a temperatura ambiente.

Quindi aspirare il surnatante e correre a far girare il pellet cellulare in 220 microlitri di tampone di elettroporazione. Aggiungere 220 microlitri di cellule risospese nella provetta del complesso RNP da 1,5 mil precedentemente preparata. Aggiungere 4,6 microlitri di un microgrammo per microlitro di plasmide donatore.

Utilizzare la punta di nucleececazione e la pipetta per miscelare i due contenuti due o tre volte, quindi trasferire un centinaio di microlitri di sospensione nel dispositivo di elettroporazione preparato. Evitare di introdurre bolle nella punta. Applicare milletrecento volt per un impulso di trenta millisecondi.

Trasferire delicatamente la sospensione in una piastra a sei pozzetti con un movimento vorticoso. Disperdere le cellule muovendo delicatamente la piastra da un lato all'altro e dalla parte anteriore a quella posteriore. Dopo aver ripetuto per tutte le condizioni sperimentali e i controlli, incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24 ore, cambiando il terreno in terreno di crescita regolare senza inibitore ROCK a 24 ore.

Quindi continuare ad alimentare le hiPSC ogni 24 ore per 72-96 ore monitorando la loro confluenza. Quando le hiPSC raggiungono il 68-80% di confluenza, si procede all'arricchimento FACS. Due o tre ore prima della trasfezione, trattare le hiPSC con 10 inibitori micromolari di ROCK integrati nei terreni di crescita per promuovere la sopravvivenza dopo l'arricchimento di FACS.

Per selezionare le cellule, rimuoverle dalla piastra utilizzando il reagente di dissociazione a cellula singola, quindi filtrare la sospensione hiPSC attraverso un filtro a maglie da 35 micron in tubi di polistirene a fondo tondo. Ordina le celle utilizzando la dispersione diretta e la dispersione laterale, tra cui: altezza rispetto alla larghezza, detriti di terzine e doppietti. Utilizzare le celle di controllo solo buffer live per impostare il gate positivo FP, ad esempio che meno dell'1,1% delle celle solo buffer rientrino nel gate.

Quando si selezionano le cellule staminali, adattare le impostazioni dello strumento per promuovere la sopravvivenza cellulare, come suggerito nella sezione di discussione. Le efficienze tipiche di knock in, determinate dalla percentuale di cellule FP positive mediante FACS, possono variare dallo 0,1% al 5%Smistare le cellule in una provetta in polipropilene da 1,5 a 15 mil contenente da 0,5 a 2 mil di terreno di crescita a temperatura ambiente integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK. Centrifugare le cellule raccolte a 211 volte G per tre minuti a temperatura ambiente.

Aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di terreno di crescita integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK. Trasferire fino a tremila cellule assortite in un singolo pozzetto di una piastra da 96 pozzetti rivestita di matrigel fresca. Incubare le cellule selezionate a 37 gradi Celsius in CO2 al 5% per 24 ore, trasformando il terreno in terreno di crescita integrato con un inibitore ROCK a 5 micromolari a 24 ore.

Quindi, a 48 ore, continuare a nutrire regolarmente le cellule, senza inibitori ROCK ogni 24 ore per 72-96 ore monitorando la confluenza. Una volta che le cellule sono abbastanza mature da poter essere espulse dalla piastra a 96 pozzetti, si consiglia di passarle gradualmente in piastre più grandi. Quindi, ad esempio, da un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, spostarli fino a uno o due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.

E poi da lì in una piastra a 6 pozzetti, eccetera, fino a quando non si hanno abbastanza celle per scopi a valle. Di solito almeno tre o quattro milioni di cellule. Per generare linee clonali dalla popolazione arricchita di cellule modificate punitivamente FACS, passare in sospensione a singola cellula e placcare diecimila cellule su una piastra di 10 centimetri e lasciare che le colonie crescano per cinque-sette giorni.

Quando le colonie sono visibili macroscopicamente, sono abbastanza grandi da essere isolate. Su un microscopio da dissezione, utilizzare una pipetta P200 per raschiare e aspirare delicatamente le singole colonie dalla superficie della piastra. Trasferire il volume contenente la colonia in un singolo pozzetto della piastra a 96 pozzetti.

Dopo che tutte le colonie sono state trasferite, incubare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24 ore. Sostituire il terreno in un normale terreno di crescita senza inibitore ROCK a 24 ore. Quindi continua a nutrire le cellule ogni 24 ore per 72-96 ore fino a quando le colonie non hanno approssimativamente triplicato le loro dimensioni.

Le cellule dovranno essere coltivate e fatte passare in piastre a 96 pozzetti per avere un numero sufficiente di cellule per crioconservarle antalizzarsi per l'estrazione del DNA genomico. Per ulteriori dettagli, vedere il protocollo scritto. Per il passaggio in piastre a 96 pozzetti, utilizzare un aspiratore a otto canali per rimuovere e scartare i terreni dalla prima colonna.

Utilizzando una pipetta multicanale P200, aggiungere circa 200 microlitri di DPBS alla prima colonna della piastra per lavare le cellule. Utilizzando un aspiratore a otto canali, rimuovere ed eliminare il lavaggio DPBS dalla prima colonna. Quindi aggiungere 40 microlitri di reagente di dissociazione alla prima colonna.

Ripetere questi passaggi lavorando una colonna alla volta per un massimo di sei colonne della piastra a 96 pozzetti. Cambia le punte per essere sicuro di non contaminare i pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore per tre-cinque minuti dal momento in cui il reagente di dissociazione è stato aggiunto alla prima colonna.

Quando le cellule nella prima colonna della piastra hanno iniziato a sollevarsi dal fondo, utilizzare una pipetta multicanale P200 per aggiungere 160 microlitri di DPBS alla prima colonna e triturare delicatamente le cellule nelle posizioni a ore 12, 3, 6 e 9 di ciascun pozzetto. Trasferire l'intero volume con sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Ripetere questi passaggi per le colonne rimanenti che contengono reagente di dissociazione, cambiando le punte in modo da non contaminare i pozzetti.

Centrifugare la piastra con fondo a V nella centrifuga a 385 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. I sub mostrati fino a questo punto per il passaggio di 96 pozzetti vengono eseguiti allo stesso modo ogni volta che le celle vengono passate in questo formato di piastra. Successivamente ti mostreremo come procedere se sei pronto per crioconservare le cellule in formato a 96 pozzetti.

Per ulteriori informazioni, vedere il protocollo scritto. Dopo la fase di centrifugazione illustrata nella sezione precedente, aspirare il surnatante utilizzando una pipetta multicanale P200 e quindi risospendere in 60 microlitri di terreno di crescita integrati con 10 inibitori micromolari di ROCK. Ripetere per tutti i pozzetti, cambiando le punte in modo da non contaminare in modo incrociato.

Trasferire 30 microlitri di sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti non rivestita da Matrigel. Trasferire i restanti 30 microlitri di sospensione in una piastra sorella, quindi aggiungere rapidamente 170 microlitri di tampone di congelamento a ciascun pozzetto senza mescolare. Si noti che questo processo viene eseguito in piastre sorelle duplicate in modo che esista una popolazione di cellule di riserva dopo che una delle singole piastre è stata scongelata.

L'inserimento di cellule crioconservate solo in ogni altra colonna della piastra a 96 pozzetti consente uno scongelamento più rapido. Avvolgere il piatto con parafilm e metterlo in una scatola di polistirolo a temperatura ambiente con coperchio. Metti l'intera scatola nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.

Dopo 24 ore, le lastre possono essere trasferite fuori dalla scatola di polistirolo e ordinate a meno 86 gradi Celsius per un massimo di quattro settimane. La crioconservazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in formato a 96 pozzetti consente una pausa temporale nella coltura cellulare. Il ricercatore può eseguire saggi di convalida genomica sulle miniere clonali per identificare i cloni geneticamente desiderabili da scongelare per studi futuri.

Quattro giorni dopo la trasfezione della linea hiPSC del WTC con una proteina guida specifica per l'RNA Cas9 e un plasmide stampo del donatore accuratamente progettato, è stato osservato che lo 0,95% delle cellule esprimeva GFP. Il FACS è stato utilizzato per selezionare tutte le cellule GFP positive come popolazione arricchita. Studi preliminari al microscopio hanno rivelato la localizzazione prevista della proteina di fusione della lamina nucleare B1 mEGFP nell'involucro nucleare.

La proteina marcata in fluorescenza è stata osservata in circa il 95% delle cellule con intensità variabili. Dopo la generazione della linea clonale, sono stati ottenuti cloni con intensità mEGFP uniforme e ulteriormente analizzati per un editing preciso. Per concludere, abbiamo dimostrato un metodo di trasfezione per l'editing genetico di cellule staminali pluripotenti indotte umane per l'espressione di proteine di fusione fluorescenti regolate endogenamente.

Poiché le tipiche inefficienze di knock sono basse, alcune strategie di arricchimento come il metodo FACS mostrato qui si traduce in una popolazione di cellule putativamente modificate che esprimono la proteina di fusione. La popolazione arricchita può essere utilizzata per studi biologici o possono essere generate linee clonali come descritto in questo metodo, rendendo possibile l'identificazione di linee cellulari che sono modificate con precisione geneticamente. È importante ricordare che le rotture del doppio filamento indotte da Cas9 nel genoma vengono spesso riparate in modo impreciso nonostante l'incorporazione del tag nel locus previsto.

Inoltre, nei cloni modificati monoallelicamente, l'allele non marcato contiene spesso indel, molto probabilmente causati da una riparazione di giunzione delle estremità non omologa. Questi risultati sottolineano l'importanza della convalida genetica dopo un knock-in CRISPR Cas9 rivelato solo attraverso l'analisi del genoma di linee cellulari clonali. L'espressione della proteina di fusione attesa da sola non garantisce un editing preciso.

Quando si utilizza questo protocollo per l'editing di cellule staminali pluripotenti indotte umane, fare attenzione a seguire le raccomandazioni dettagliate nel protocollo scritto per garantire una manipolazione delicata delle cellule per una sopravvivenza cellulare ottimale e una differenziazione spontanea minima. Ci auguriamo che questo video e l'elenco dei protocolli e dei materiali associati ti aiutino a eseguire esperimenti simili nel tuo laboratorio sulla tua proteina preferita. Grazie per l'attenzione.