Name: Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Scopri il tagging di proteine endogene con tag fluorescenti in cellule staminali pluripotenti umane indotte utilizzando CRISPR/Cas9. Questo metodo consente di studiare la dinamica proteica sotto controllo regolatorio endogeno in tempo reale.

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Ringraziamo Dambournet Daphne per molte discussioni penetranti e consigli sul gene editing, Thao per l'illustrazione, Angelique Nelson per la lettura critica del manoscritto e Andrew Tucker per la generazione della linea cellulare di lillo B1 mEGFP-etichetta. Vogliamo riconoscere le cellule staminali e Gene Editing e team di sviluppo di analisi presso l'Istituto di Allen per la scienza delle cellule per il loro contributo al processo di controllo qualità e gene editing. La linea WTC che abbiamo usato per creare la nostra linea di cella gene-modificato è offerta dal Bruce R. Conklin Laboratory presso gli istituti di Gladstone e UCSF. Ringraziamo l'Istituto Allen per il fondatore di scienza di cella, Paul G. Allen, per la sua visione, incoraggiamento e supporto.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo presentato qui per generare in modo endogeno regolato fusioni di proteina fluorescente in hiPSCs è un approccio versatile e potente per la generazione di linee cellulari di gene modificato con applicazioni che vanno dall'imaging cellule vive a vari studi funzionali e " modelli di malattia in un piatto"usando paziente-derivati hiPSC linee13,14,15. Mentre questo metodo è stato utilizzato per introdurre grandi FP tag a N - o C-terminale delle proteine endogene, potenzialmente potrebbe essere utilizzato per introdurre altri tag o piccoli cambiamenti genetici a modello o malattia-causanti corretta mutazioni22,23 . Per gli inserti più piccoli, la dimensione del braccio omologia può essere ridotta, ma l'approccio generale all'editing presentati in questo metodo si può ancora applicare24,25. Mentre l'uso di hiPSCs è fortemente incoraggiato per la loro utilità vasta, con attenta ottimizzazione, questo protocollo può essere adattato per modificare i genomi di altre linee cellulari di mammifero.
Quando si identifica un gene di interesse per il tagging di FP, stime di abbondanza di trascrizione (da microarray o RNA-Seq dati) è un buon punto di partenza per valutare se un gene o una isoforma di interesse è espresso, anche se i livelli della trascrizione non correla sempre con livelli della proteina. La strategia di FACS-arricchimento descritta qui funziona meglio per geni che sono espressi almeno moderatamente bene il tipo di cella di interesse. Questa strategia ha anche avuto successo nella selezione per le fusioni che mostrano modelli di localizzazione punctate e/o discreti come centrin, desmoplakina e paxillin dove il fondo rapporto segnale è molto basso12,19. Geni che non sono altamente espressi o sono espressi solo in tipi cellulari derivati possono richiedere strategie di selezione supplementari.
Il punto di partenza per crRNA e donatore disegni del plasmide di modello utilizzato nelle linee cellulari umane dovrebbe essere il genoma umano di riferimento (GRCh38). Perché i genomi di diverse linee cellulari possono variare all'interno della stessa specie, e poiché CRISPR/Cas9 è sequenza-specifici, è estremamente utile identificare varianti di linea specifico delle cellule (polimorfismi a singolo nucleotide o inserzioni/delezioni (indels)) che differiscono dal genoma di riferimento e incorporare questi nel design. Questo assicura che crRNAs sarà compatibile con il genoma ospite e che le braccia di omologia di donatore modello plasmide manterrà tutte le varianti specifiche linee cellulari. Una strategia suggerita è di incorporare omozigotiche varianti nelle braccia modello plasmide omologia crRNAs e donatore durante il processo di progettazione. Incorporando varianti eterozigotiche è facoltativo. I reagenti specifici utilizzati per esperimenti di knock-in grande e altre considerazioni chiave per questo protocollo sono discussi di seguito.
Proteina Cas9
Il vantaggio principale dell'utilizzo della proteina Cas9 è che introducendo il Cas9 e gRNA come un complesso RNP ha dimostrato di provocare una durata limitata di attività della nucleasi rispetto ad approcci basati su plasmide dove espressione del Cas9 e gRNA può continuare per giorni e condurre 26,ad una maggiore attività di on e off-target27. Un ulteriore vantaggio dell'utilizzo di proteine Cas9 è che è prontamente disponibile per fendere una volta all'interno delle cellule. Questo contrasta con i metodi più convenzionali dell'utilizzo Cas9 mRNA o Cas9/gRNA plasmide che richiedono la trascrizione, la traduzione e la proteina elaborazione26,28. Proteina S. pyogenes Cas9 wildtype è ora disponibile da molte fonti commerciali.
Guida di RNA
Ci sono molti strumenti disponibili pubblicamente per l'individuazione di obiettivi di crRNA vicino al sito di inserimento desiderato di FP che hanno zero o pochi predetto off-target negli host genoma29,30,31,32. Efficienze in HDR e la precisione del risultato HDR variano ampiamente tra gli obiettivi di crRNA utilizzati in un dato locus12. Per questo motivo, test diversi crRNAs (2-4 e preferibilmente all'interno di 50 bp al sito d'inserzione desiderata) al locus è raccomandato in quanto ciò può aumentare la probabilità di un esperimento riuscito di editing. Possibilità attuali per la consegna di gRNA includono sintetico 2-parte crRNA tracrRNA, gRNAs singolo sintetico (sgRNAs), e in vitro trascritto sgRNAs, o la consegna di un plasmide alle cellule che esprimono il sgRNA da un promotore di U6. Questo protocollo non è stato ottimizzato per attività di fenditura alta. Non modificato in 2 parti crRNA e tracrRNA (Vedi Tabella materiali) sono stati utilizzati con l'obiettivo di generare linee cellulari mono-allelica FP-etichetta mentre provocando la perturbazione meno potenziale per le cellule.
Donatore modello plasmide
Perché alcune dell'omologia braccio sequenza condizione nel donatore plasmide modello verrà incorporati nel genoma ospite durante l'evento HDR, le mutazioni di punto per i siti di riconoscimento di crRNA dovrebbe presentare per impedire ulteriore scissione di Cas9 seguito HDR. Spesso il cambiamento dirompente più semplice è di mutare la sequenza di PAM. Perché alcune sequenze di PAM non canonico possono essere ancora riconosciuti da wild-type S. pyogenes Cas9, è meglio evitare di usare NGG, NAG o NGA33. Quando si cambia il braccio di omologia, evitare mutazioni non-sinonimo e l'introduzione di codoni rari. Se un cambiamento sinonimo per la sequenza di PAM non è possibile, è consigliabile rendere tre mutazioni puntiformi sinonima della regione semi (10 bp prossimale a PAM) del sito di legame di crRNA. Dovrebbe prestare attenzione estrema quando si apportano queste modifiche nella 5ʹ regione non tradotta (UTR) poiché queste regioni possono contenere sequenze regolatrici importanti. Consultare un database di conservazione genetica come tracce di genomica comparativa del Browser genoma UCSC possono fornire una guida in questi casi, come modifiche alle basi non conservato possono essere tollerate più meglio che cambia a basi altamente conservato17. A volte il semplice inserimento della sequenza FP è sufficiente per danneggiare il sito di associazione di crRNA (come in Figura 1); Tuttavia, la sequenza appena aggiunta dovrebbe essere verificata per la persistenza dell'associazione crRNA e sequenze di PAM.
Aminoacido linker tra la FP e la proteina nativa si consiglia di conservare la funzione della proteina di fusione34. Spesso un linker dell'aminoacido può essere scelto per la sua particolare carica o dimensione. Se una fusione di cDNA con un design simile alla mirata endogena proteina di fusione è stato ben studiato, stessa sequenza del linker può essere utilizzato per la CRISPR/Cas9 knock-in esperimento12,19. Se tali informazioni non sono disponibile, un linker breve come GTSGGS inoltre è stato usato con successo12. Altri studi hanno dimostrato il successo con una sequenza del linker acido 3-ammino piccolo generico per una serie di obiettivi35.
Transfezione e arricchimento di FACS
Molti reagenti di transfezione disponibili in commercio sono formulati per la consegna di alcuni tipi di molecole alle cellule, mentre un sistema di elettroporazione può essere utilizzato per fornire reagenti con una vasta gamma di dimensioni, carica e composizione. Oltre ad essere un comune metodo di transfezione per duro transfect cellule come hiPSCs, elettroporazione porta anche il vantaggio di fornire tutti i tre componenti per CRISPR/Cas9-mediata FP knock-in, come descritto in questo metodo. L'elettroporazione è stato trovato per produrre i migliori risultati rispetto ad altri reagenti commercialmente disponibili durante lo sviluppo di questo metodo (dati non mostrati) e inoltre è stato utilizzato da altri utenti per RNP consegna26,28,36 .
Quando si utilizza questo protocollo per l'editing hiPSCs, si dovrebbe prestare particolare attenzione a garantire una gestione delicata delle cellule prima e dopo il processo per la sopravvivenza cellulare ottimale e minima differenziazione spontanea di editing di gene. In particolare, i metodi di arricchimento di FACS dovrebbero essere adattati per l'ordinamento di cellule staminali utilizzando l'ugello più grande possibile (130 µm), un basso tasso di flusso (≤24 µ l/min), conservanti guaina fluido (ad esempio soluzione fisiologica, Vedi Tabella materiali) e basso del campione pressione (10 psi). Invece di singola cella ordinamento, che si traduce nell'attuabilità suboptimale in cellule staminali, il hiPSCs FACS-arricchito vengono ordinati alla rinfusa e ampliato come una popolazione per ottimizzare l'integrità di cellula staminale e attuabilità delle cellule. Tuttavia, la singola cella ordinamento può essere appropriato per meno tipi cellulari sensibili. Per promuovere la sopravvivenza delle cellule, le cellule vengono restituite alla cultura non più di un'ora dopo la raccolta per l'arricchimento di FACS e conservate a temperatura ambiente durante il processo di ordinamento. Per alcuni tipi di cellule, la sopravvivenza delle cellule può essere migliorata anche incubando le cellule su ghiaccio (4° C) durante tutto il processo di ordinamento.
L'espansione della massa delle cellule positive-FP fornisce un'opportunità per valutare la popolazione dall'analisi di imaging per localizzazione della proteina di fusione prima di generare linee clonali. Mentre la popolazione arricchita risultante delle cellule può essere sufficiente per alcuni studi, queste popolazioni visualizzare frequentemente FP segnale di varia intensità. Le linee clonali isolate hanno segnale uniforme (Figura 3), che li rende più appropriato per gli esperimenti funzionali12.
Generazione di linea clonale delle cellule
Durante tutto il processo di generazione linea editing e clonale, è importante monitorare la morfologia delle cellule. hiPSC colonie coltivate in condizioni prive di alimentatore dovrebbero esibire i bordi regolari e un centro ben confezionato, anche12,18,19. Cellule differenziate dovrebbero essere osservate in meno del 5% della cultura. Quando la raccolta di diverse colonie, scegliere quelli che mostra la buona morfologia. Durante la piastra a 96 pozzetti passaggio eventi, controllare cloni per morfologia e sospendere quelli che hanno invaso come questo può condurre alla differenziazione o essere un'indicazione di instabilità genetica.
Generazione delle varietà di cellula clonale permette per conferma genetica di editing preciso, che è importante perché indotta da Cas9 doppio filo si rompe nel genoma sono spesso riparato impreciso nonostante incorporazione del tag al luogo desiderato. Analisi PCR-basata precedentemente descritte ha mostrato che cumulativamente attraverso dieci loci genomici unici molti (45%) dei cloni che esprimono FP sofferta dall'integrazione di spina dorsale di plasmide di donatore al luogo di destinazione o (raramente) in modo casuale nel genoma12. Inoltre, il 23% di GFP-positive cloni (n = 177) attraverso dieci loci unici sono stati trovati per harbor mutazioni presso o vicino al sito di taglio crRNA attesi nell'allele senza tag, probabilmente a causa di NHEJ12. Questa analisi genetica di molte linee clonali (~ 100 cloni/edit) sottolinea l'importanza della validazione genetica che non è possibile in una popolazione delle cellule poiché FP-espressione e localizzazione della proteina di fusione previsto da solo non garanzia di editing preciso12 . Inoltre, non è possibile eseguire queste analisi PCR-basata su una popolazione arricchita delle cellule con alcuna certezza, che giustificano la necessità per la generazione linea clonale prima analisi significativa possono essere completata. Conferma genetica del inserito tag FP e verifica dell'integrità genetica dell'allele inedito (in un clone modificato mono-allelica) sono entrambi necessari per assicurare il preciso editing presso il locus mirato oltre espressione contrassegno.
Un basso tasso di modifiche bi-allelica e mancanza di mutazioni fuori bersaglio (come dosati di Sanger e il sequenziamento dell'esoma) sono stati osservati per data utilizzando questo metodo (dati non pubblicati)12. Ciò è coerente con gli studi precedenti che descrivono l'uso di breve durata RNP per CRISPR/Cas9 esperimenti26,27. La mancanza di linee di cellule clonali con bi-allelica modifiche può anche essere locus specifico o a causa dell'incapacità della cellula di tollerare due etichettate copie di una proteina essenziale come suggerito da esperimenti precedentemente pubblicati dove sono stati presunte bi-allelica celle modificate osservate per un locus (LMNB1), ma non un altro (TUBA1B)12. Linee di Bi-allelic completamente convalidato clonale delle cellule sono state generate utilizzando questo metodo per tag ST6 beta-galactoside alfa-2, 6-sialiltrasferasi 1 (ST6GAL1) e RAB5A membro RAS oncogene (RAB5A) con mEGFP19.
Di là di confermare la precisione della modifica nel genoma, ci sono una varietà di test di controllo qualità che può essere utilizzato per ulteriori caratterizzano la linea clonale e identificare cloni che soddisfano tutte le cellule staminali, genomica, e criteri biologici delle cellule per utilizzano in futuro studi . Analisi biologiche e funzionale delle cellule possono essere utilizzate per confermare l'espressione appropriata, la localizzazione e funzione della proteina fusion12. Confronto all'inedito controllo genitori vi aiuterà a valutare l'influenza del processo di editing su localizzazione, la dinamica e la funzione. Altri saggi come crescita analisi e test per la stabilità genomica può anche aiutare a determinare se la proteina taggata è perturbante alla cella. Quando si utilizza hiPSC in questo protocollo, valutazione di marcatori di pluripotenza e potenziale di differenziazione può essere critico nel determinare un clone che è prezioso per a valle studia12. Perché estesa cultura della hiPSC ha dimostrato di portare a instabilità genetica, monitoraggio del tasso di crescita e cariotipo delle varietà di cellula clonale è anche importante12,37. Tuttavia, la finale destinato uso di celle modificate determinerà il livello e l'ampiezza di analisi di controllo di qualità e varia a seconda dell'applicazione.

L'uso di strategie di modifica del genoma, soprattutto CRISPR/Cas9, per studiare i processi cellulari sta diventando sempre più accessibile e preziosa1,2,3,4,5, 6 , 7. una delle tante applicazioni di CRISPR/Cas9 è l'introduzione (tramite riparazione omologia diretto (HDR)) di grandi sequenze esogeni come GFP in loci genomici specifici che poi servono come reporter per l'attività di un gene o una proteina prodotto8 . Questa tecnica può essere utilizzata per unire una sequenza della proteina fluorescente a un telaio di lettura aperto endogeno dove la proteina di fusione in modo endogeno regolamentato risultante può essere utilizzata per visualizzare la localizzazione subcellulare e la dinamica della proteina di interesse5 ,6,9,10,11. Mentre le proteine etichettate in modo endogeno offrono molti vantaggi rispetto ai sistemi di sovraespressione, inserimento di grandi sequenze nel genoma umano è un processo inefficiente in genere richiedono una selezione o una strategia di arricchimento per ottenere una popolazione di cellule che possono essere facilmente studiati5,12.
Questo protocollo descrive l'inserimento di una sequenza di DNA codifica per una proteina fluorescente (FP) in un locus genomico desiderato. Il protocollo comprende progettazione e consegna del plasmide di modello del donatore e il complesso ribonucleoproteico (RNP) (proteina wild-type S. pyogenes Cas9 combinata con sintetico CRISPR RNA (crRNA) e trans-attivazione crRNA (tracrRNA)). È anche descritto l'arricchimento delle celle putativamente modificate tramite celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS) e il processo di generazione di linea clonale delle cellule. Ad oggi, questo metodo è stato utilizzato per generare linee hiPSC con monoallelica o tag (raramente) bi-allelica proteina fluorescente verde (GFP) etichettatura venticinque proteine che rappresentano importanti strutture cellulari. Le celle modificate risultante da questi sforzi sono state confermate per avere l'inserimento genetico previsto, esprimono una proteina di fusione corretta localizzazione e mantenere la pluripotenza e un12 cariotipo stabile (e dati non pubblicati). Questo metodo è stato utilizzato anche per generare più altri single e dual (due differenti proteine contrassegnati nella stessa cella) modificato popolazioni di hiPSCs (dati non pubblicati).
IPSCs umane derivate da un donatore sano sono stati scelti per questi sforzi editing genomico perché, a differenza di molte linee cellulari convenzionali, sono diploidi, karyotypically stabile, non trasformate e proliferativa. Queste proprietà forniscono un modello interessante per lo studio della biologia delle cellule fondamentali e modellazione di malattia. Inoltre, il potenziale di differenziazione di hiPSCs offre l'opportunità di studiare di più stadi di sviluppo in parallelo attraverso le varie stirpi e tipi cellulari, utilizzando cellule isogeniche tra cui organoids, tessuti e modelli "malattia in un piatto"13 ,14,15. Mentre questo protocollo è stato sviluppato per hiPSCs (linea WTC), può essere informativa per lo sviluppo di protocolli usando altre linee cellulari di mammifero.

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters, o</td> software bioinformatico simile <td></td><td>per in silico design di plasmidi donatori</td></tr><tr><td>TE Tampone pH 8.0</td><td>IDT, o simile</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2 incubatore, o simile</td><td>ThermoFisher Scientific, o</td><td>simile 51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (1000 & micro; L, 200 & micro; L, 20 & micro; L, 10 & micro; L, 2 &micro; L)</td><td>Rainin o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1000 & micro; L, 200 & micro; L, 20 & micro; L)</td><td>Pipetta multicanale Rainin o similare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(200 &micro; L)</td><td>Rainin o</td> pipette sierologiche simili <td></td><td></td></tr><tr><td>(25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar o</td> collettore a 8 canali BRAND simile <td></td><td></td></tr><tr><td>per Quiksip, Millipore Sigma autoclavabile</td><td>o</td><td>BR704526-1EA</td> simili <td>da utilizzare con puntali per pipette non filtrati, come i puntali per pipette a bassa ritenzione di Molecular BioProducts, Pure 10, sotto</td></tr> i <tr><td>puntali per pipette a bassa ritenzione di Molecular BioProducts, Pure 10</td><td>Thermo Fisher o simile</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Pipette</td><td>Controller Drummond, o simile</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur monouso</td><td>VWR, o simile</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Classe II, Tipo A2 Cabina di sicurezza biologica</td><td>CELLGARD, o simile</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, fattore di crescita ridotto</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lotto testato prima dell'uso con hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-rosso fenolo)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>a freddo, per la diluizione Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>terreni di crescita consigliati per la linea WTC hiPSC</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC linea hiPSC</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>la linea hiPSC utilizzata in questo protocollo è disponibile tramite Coriell</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) senza calcio, senza magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL di polistirene conico</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 ( Proteina sintetica Proteina</td><td></td><td></td> CRISPR-Cas9 Proteina <td></td></tr> purificata <tr><td>CRISPR-Cas9</td><td></td><td></td><td></td></tr> Proteina purificata <tr><td></td><td></td> <><td>CRISPR-Cas9 Proteina</td><td></td></tr><tr><td>purificata di tipo >> <<><selvaggio ricombinante M</td><td>Università della California-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide donatore personalizzato (PriorityGENE)</td>Il design dell'inserto donatore <td>Genewiz</td><td></td><td>è stato sintetizzato e clonato nella spina dorsale pUC57 da Genewiz</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Clontech</td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione Neon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione al neon, 100 & micro; Kit L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL in polistirene Provetta a fondo tondo con tappo per filtro cellulare Falcon</td><td></td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL in provetta conica in polipropilene ad alta trasparenza</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Software FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo versione 10.2</td> Banca del sangue <td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Soluzione salina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>utilizzato come tampone FACS senza conservanti</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Olympus SZX7, o simile</td><td>Olympus, o simile</td><td></td><td></td>Piastra</tr> per <tr>coltura tissutale, piastra per colture cellulari <td>Falcon</td><td>353072</td><td></td>96<td>pozzetti a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>, fondo a V</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>utilizzato come tampone di crioconservazione per cellule in formato piastra a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

proteina endogena tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando crispr/cas9

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Un protocollo è presentato per la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) che proteine endogene express fuse per tag fluorescente N - o C-terminale in-struttura. Il sistema CRISPR/Cas9 procariotico (cluster regolarmente interspaziato corto palindromo 9 ripetizioni/CRISPR-associati) può essere utilizzato per introdurre grandi sequenze esogeni in loci genomici tramite riparazione omologia diretto (HDR). Per ottenere il desiderato knock-in, questo protocollo impiega la ribonucleoproteina (RNP)-dove la proteina wild type Streptococcus pyogenes Cas9, guida sintetica 2 RNA (gRNA) e un plasmide di modello del donatore vengono consegnati alle cellule tramite l'approccio basato sul elettroporazione. Putativamente modificate cellule che esprimono le proteine fluorescente contrassegnate sono arricchite da celle attivate la fluorescenza che ordinano (FACS). Linee clonali sono poi generati e possono essere analizzati per i risultati di editing precisi. Introducendo il tag fluorescente del locus genomico del gene di interesse, la localizzazione subcellulare risultante e la dinamica della proteina di fusione può essere studiato sotto controllo regolamentare endogena, un miglioramento fondamentale rispetto convenzionale sovraespressione sistemi. L'uso di hiPSCs come sistema modello per il gene tagging offre l'opportunità di studiare le proteine etichettate in cellule diploidi, non trasformate. Dal momento che hiPSCs può essere differenziato in più tipi di cellule, questo approccio offre l'opportunità di creare e studiare le proteine etichettate in una varietà di contesti cellulari isogeniche.

L'obiettivo di questo esperimento era di fondere mEGFP (monomerico avanzata GFP) alla proteina nucleare Lilo B1 introducendo la sequenza di mEGFP fino alla fine di 5ʹ del gene LMNB1 (N-terminale della proteina). Un linker (sequenza dell'amminoacido SGLRSRAQAS) è stato scelto basata su precedenti costrutti di cDNA dal Michael Davidson proteina fluorescente collezione21. Perché la regione di associazione crRNA nel plasmide modello donatore per ogni candidato crRNA è stato interrotto dopo l'inserimento in silico di mEGFP e la sequenza del linker, nessuna mutazione di punto doveva essere fatto interferire con potenziali crRNA riconoscimento e scissione di Cas9 della sequenza dei donatori (Figura 1). La sequenza di donatore conteneva armi di omologia di 1 kb che fiancheggiano entrambe le estremità della sequenza mEGFP-linker. La risultante 2.734 bp di DNA è stato clonato in una spina dorsale pUC57, sequenza verificato, e il plasmide di modello donatore risultante è stato purificato mediante un'endotossina-libero maxi prep. Il donatore modello plasmide e RNP complesso transfected, putativamente modificato le cellule sono state arricchite e la localizzazione della proteina di fusione B1 Lilo mEGFP-nucleare è stata confermata da microscopia di fluorescenza (Figura 2). Solo risultati dalla transfezione di crRNA1 sono descritti qui, anche se entrambe le sequenze di crRNA prodotto popolazioni putativamente modificato12.
Rispetto al controllo negativo, che non conteneva nessun gRNA, Cas9 proteina o plasmide di modello donatore nella reazione elettroporazione (solo buffer), il crRNA1 LMNB1 transfettate le cellule contenute 0,95% cellule di mEGFP-positive che rappresentano il putativamente modificato mEGFP-nucleare Liuzzi B1 popolazione (Figura 3a). Questo risultato è stato all'interno della gamma di knock-in efficienza osservata attraverso molti loci genomici utilizzando questo metodo, come precedentemente segnalato12.
Le cellule mEGFP-positive sono sono isolate da FACS e ripreso da microscopia diretta per confermare la localizzazione prevista della proteina di fusione B1 mEGFP-nucleare LILO alla busta nucleare. Dopo FACS-arricchimento, circa il 90% delle cellule ordinate dalla popolazione crRNA1 LMNB1 erano mEGFP-positivi (come determinato da microscopia), suggerendo che alcune cellule mEGFP-negativi co-purificati con le cellule GFP-positive durante la procedura di ordinamento. Questo era un livello accettabile di arricchimento che ha permesso per la raccolta di 96 cloni che potrebbe allora essere geneticamente selezionati per l'editing di successo. Generalmente, un cut-off per l'arricchimento di successo è del 50% positivo GFP.
La maggior parte della popolazione cellulare ordinato visualizzato fluorescenza la busta nucleare (periferia nucleare) in cellule nondividing e a un'estesa lamina nucleare all'interno del citoplasma durante fiducia fornendo mitosi nella corretta genomico modifica presso il LMNB1 locus. La popolazione arricchita ha contenuto le cellule con segnale luminoso o dim. Questa differenza nell'intensità del segnale può riflettere una combinazione di corrette ed errate modifica i risultati e mette in evidenza l'utilità di generare una linea clonale geneticamente convalidata per ulteriori studi (vedi discussione) (Figura 3b)12. Dopo la generazione di linea clonale, geneticamente convalidato cellule hanno mostrato intensità uniforme di GFP in esperimenti di microscopia (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Figura 1 . Progettare una strategia per il tagging di GFP N-terminale del gene LMNB1. Il tag GFP è stato progettato per 5ʹ di inserimento N-terminale del primo esone di LMNB1 localizzato sul cromosoma 5. Omologia sia 5ʹ che 3ʹ le braccia sono 1 kb ciascuno e si incontrano tra il codone di inizio (ATG) e il secondo codone (armi di omologia solo parzialmente rappresentati in figura). Due candidati crRNAs sono stati progettati per guidare Cas9 fendere come vicino al sito di inserimento previsto come possibile, pur essendo unico nel genoma. Sequenza per mEGFP e un linker dell'amminoacido sono stati inseriti solo 3ʹ del codone di inizio (sequenza mEGFP e il linker non in scala). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Figura 2 . Flusso di lavoro per la produzione in modo endogeno con tag linee clonali hiPSC. Componenti di transfezione, tra cui il complesso RNP Cas9/crRNA/tracrRNA (mostrato in rosso Cas9 proteina con crRNA oro e viola tracrRNA), contenente le braccia di omologia (HAs, mostrato in oro), il plasmide del modello donatore e FP + sequenza del linker (mostrato in verde), sono stati individulamente. Dopo 4 giorni, le cellule FP-positive putativamente modificata erano arricchite da FACS e ampliate come una popolazione di tutte le celle ordinate semina in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (~ 1.000 cellule) e quindi espanse in coltura fino a una popolazione lavorativa di diversi milioni di euro cellule potrebbero essere analizzate come la popolazione"arricchita" (Vedi protocollo punto 3.8). Il rendimento delle cellule positive-FP differisce da esperimento a causa di tassi variabili di HDR12; un arricchimento di successo in genere può includere ~ 300-5.000 cells fianchi dopo trasfezione di circa 1.6 x 106 . Studi preliminari di formazione immagine ha confermato il segnale e la localizzazione della proteina di fusione nella popolazione arricchita. Colonie sono state vendemmiate manualmente in una piastra a 96 pozzetti per espansione e crioconservazione. Ulteriormente lo screening genomico di controllo di qualità usando gocciolina digitali altri dosaggi basati sulla PCR e PCR (ddPCR) fu usato per identificare correttamente modificati cloni, come descritto in precedenza12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Figura 3 . Arricchimento delle popolazioni delle cellule putativamente modificato. (A) flusso cytometry trame del LMNB1 modificato post-transfezione quattro giorni di cellule. L'asse y Visualizza intensità GFP e l'asse x Visualizza forward scatter. Ordinamento cancelli erano impostate in base il controllo solo buffer. Dal momento che hiPSCs sono sensibili alla perturbazione, live/dead macchia è stato omesso e un cancello molto conservatrice di FSC/SSC è stato usato invece. (B) dopo arricchimento, la popolazione di LMNB1 Cr1 modificato cellule hanno mostrato ~ 90% delle cellule con GFP localizzazione alla busta nucleare (previsto LMNB1 localizzazione). La popolazione conteneva cellule di diversa intensità GFP, nonché alcune cellule GFP-negative. Barre della scala sono 10 micron. (C) dopo la generazione di linea clonale, le cellule hanno mostrato un intensità GFP uniforme, con alcune differenze dipendente dal ciclo cellulare. Barra della scala è di 20 micron.

Descritto qui è un protocollo per l'etichettatura in modo endogeno espresse proteine con tag fluorescente in cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando CRISPR/Cas9. Celle putativamente modificate sono arricchite da ordinamento di attivate la fluorescenza delle cellule e linee clonali della cellula vengono generate.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte umane che esprimono proteine di fusione endogene fuse per terminali di tag fluorescenti N o C terminali. Per ottenere il knock in desiderato, utilizziamo il sistema CRISPR-Cas9 e un approccio basato sulla ribonucleoproteina utilizzando la proteina Cas9 di S.pyogenes wild type e un RNA CRSPR sintetico in due parti e tracrRNA. Questo RNP viene co-consegnato con la sequenza di tag fluorescente desiderata come plasmide donatore tramite elettroporazione.Le cellule modificate putativamente che esprimono la proteina marcata fluorescente, sono arricchite da FACS. Vengono quindi generate linee clonali per l'analisi dei risultati di modifica precisi. Questo protocollo di editing genetico presenta molti vantaggi rispetto ai tradizionali costrutti di sovraespressione.Poiché un tag fluorescente viene introdotto nel genoma, la localizzazione subcellulare e la dinamica della proteina di fusione risultante possono essere studiate sotto controllo regolatorio endogeno. Qui utilizziamo le cellule staminali pluripotenti indotte come sistema modello perché ci permette di studiare le proteine marcate in cellule diploidi non trasformate. Inoltre, poiché le cellule possono essere differenziate in più tipi di cellule, come le cellule dei cardiomiociti mostrate qui, questo approccio offre l'opportunità di creare e studiare proteine marcate in una varietà di contesti cellulari isogenici.Tuttavia, con un'attenta ottimizzazione, questo protocollo potrebbe essere adattato per l'editing dei genomi di altri tipi di cellule di mammifero. Ciao, sono Amanda Haupt, faccio parte del team di cellule staminali e di editing genetico qui all'Allen Institute for Cell Science. Oggi, abbiamo utilizzato questo approccio per generare oltre 35 diverse linee cellulari che esprimono proteine di fusione endogene.Li usiamo per studiare un'ampia varietà di strutture e processi cellulari unici. Questo approccio ha avuto successo fino al 95% dei loci tentati fino ad oggi con il nostro gruppo. Questo metodo sarà particolarmente utile per i biologi cellulari che sono interessati a comprendere meglio la dinamica di una proteina nelle cellule vive.Tuttavia, una volta generate le linee clonali modificate, le possibilità di studio sono infinite. Con questo metodo siamo in grado di identificare in modo coerente i cloni che hanno tag proteici fluorescenti monoallelici senza altre interruzioni nella sequenza genomica. Occasionalmente siamo anche in grado di ottenere cloni modificati biallelicamente.In questo video mostreremo alcuni dei passaggi chiave nella trasfetzione, nell'arricchimento FACS e nell'isolamento di linee cellulari clonali che esprimono proteine di fusione fluorescenti regolate endogenamente. Due o tre ore prima della trasfezione, trattare le hiPSC con dieci inibitori micromolari di ROCK integrati nei terreni di crescita. Ciò promuoverà la sopravvivenza dopo l'elettroporazione.Le cellule avranno un aspetto appuntito dopo questo trattamento. Prima della trasfezione, le cellule devono essere rimosse dalla piastra di chiusura del tessuto utilizzando una singola regione di dissociazione cellulare e la sospensione cellulare deve essere raccolta in una provetta conica. Preparare un'aliquota di 1,84 volte 10 per le sei cellule per ogni condizione sperimentale da trasfettare.Preparare provette del complesso ribonucleoproteico per ogni trasfezione aggiungendo 2,88 microlitri di RNA guida da 10 micromolari e 2,88 microlitri di Cas9 da 10 micromolari a una provetta da 1,5 mil. Incubare a temperatura ambiente per un minimo di 10 minuti, un massimo di un'ora. Pellettare l'aliquota della cella preparata nel passaggio precedente a 211 volte G per tre minuti a temperatura ambiente.Quindi aspirare il surnatante e correre a far girare il pellet cellulare in 220 microlitri di tampone di elettroporazione. Aggiungere 220 microlitri di cellule risospese nella provetta del complesso RNP da 1,5 mil precedentemente preparata. Aggiungere 4,6 microlitri di un microgrammo per microlitro di plasmide donatore.Utilizzare la punta di nucleececazione e la pipetta per miscelare i due contenuti due o tre volte, quindi trasferire un centinaio di microlitri di sospensione nel dispositivo di elettroporazione preparato. Evitare di introdurre bolle nella punta. Applicare milletrecento volt per un impulso di trenta millisecondi.Trasferire delicatamente la sospensione in una piastra a sei pozzetti con un movimento vorticoso. Disperdere le cellule muovendo delicatamente la piastra da un lato all'altro e dalla parte anteriore a quella posteriore. Dopo aver ripetuto per tutte le condizioni sperimentali e i controlli, incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24 ore, cambiando il terreno in terreno di crescita regolare senza inibitore ROCK a 24 ore.Quindi continuare ad alimentare le hiPSC ogni 24 ore per 72-96 ore monitorando la loro confluenza. Quando le hiPSC raggiungono il 68-80% di confluenza, si procede all'arricchimento FACS. Due o tre ore prima della trasfezione, trattare le hiPSC con 10 inibitori micromolari di ROCK integrati nei terreni di crescita per promuovere la sopravvivenza dopo l'arricchimento di FACS.Per selezionare le cellule, rimuoverle dalla piastra utilizzando il reagente di dissociazione a cellula singola, quindi filtrare la sospensione hiPSC attraverso un filtro a maglie da 35 micron in tubi di polistirene a fondo tondo. Ordina le celle utilizzando la dispersione diretta e la dispersione laterale, tra cui: altezza rispetto alla larghezza, detriti di terzine e doppietti. Utilizzare le celle di controllo solo buffer live per impostare il gate positivo FP, ad esempio che meno dell'1,1% delle celle solo buffer rientrino nel gate.Quando si selezionano le cellule staminali, adattare le impostazioni dello strumento per promuovere la sopravvivenza cellulare, come suggerito nella sezione di discussione. Le efficienze tipiche di knock in, determinate dalla percentuale di cellule FP positive mediante FACS, possono variare dallo 0,1% al 5%Smistare le cellule in una provetta in polipropilene da 1,5 a 15 mil contenente da 0,5 a 2 mil di terreno di crescita a temperatura ambiente integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK. Centrifugare le cellule raccolte a 211 volte G per tre minuti a temperatura ambiente.Aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di terreno di crescita integrato con 10 inibitori micromolari di ROCK. Trasferire fino a tremila cellule assortite in un singolo pozzetto di una piastra da 96 pozzetti rivestita di matrigel fresca. Incubare le cellule selezionate a 37 gradi Celsius in CO2 al 5% per 24 ore, trasformando il terreno in terreno di crescita integrato con un inibitore ROCK a 5 micromolari a 24 ore.Quindi, a 48 ore, continuare a nutrire regolarmente le cellule, senza inibitori ROCK ogni 24 ore per 72-96 ore monitorando la confluenza. Una volta che le cellule sono abbastanza mature da poter essere espulse dalla piastra a 96 pozzetti, si consiglia di passarle gradualmente in piastre più grandi. Quindi, ad esempio, da un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, spostarli fino a uno o due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.E poi da lì in una piastra a 6 pozzetti, eccetera, fino a quando non si hanno abbastanza celle per scopi a valle. Di solito almeno tre o quattro milioni di cellule. Per generare linee clonali dalla popolazione arricchita di cellule modificate punitivamente FACS, passare in sospensione a singola cellula e placcare diecimila cellule su una piastra di 10 centimetri e lasciare che le colonie crescano per cinque-sette giorni.Quando le colonie sono visibili macroscopicamente, sono abbastanza grandi da essere isolate. Su un microscopio da dissezione, utilizzare una pipetta P200 per raschiare e aspirare delicatamente le singole colonie dalla superficie della piastra. Trasferire il volume contenente la colonia in un singolo pozzetto della piastra a 96 pozzetti.Dopo che tutte le colonie sono state trasferite, incubare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 24 ore. Sostituire il terreno in un normale terreno di crescita senza inibitore ROCK a 24 ore. Quindi continua a nutrire le cellule ogni 24 ore per 72-96 ore fino a quando le colonie non hanno approssimativamente triplicato le loro dimensioni.Le cellule dovranno essere coltivate e fatte passare in piastre a 96 pozzetti per avere un numero sufficiente di cellule per crioconservarle antalizzarsi per l'estrazione del DNA genomico. Per ulteriori dettagli, vedere il protocollo scritto. Per il passaggio in piastre a 96 pozzetti, utilizzare un aspiratore a otto canali per rimuovere e scartare i terreni dalla prima colonna.Utilizzando una pipetta multicanale P200, aggiungere circa 200 microlitri di DPBS alla prima colonna della piastra per lavare le cellule. Utilizzando un aspiratore a otto canali, rimuovere ed eliminare il lavaggio DPBS dalla prima colonna. Quindi aggiungere 40 microlitri di reagente di dissociazione alla prima colonna.Ripetere questi passaggi lavorando una colonna alla volta per un massimo di sei colonne della piastra a 96 pozzetti. Cambia le punte per essere sicuro di non contaminare i pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore per tre-cinque minuti dal momento in cui il reagente di dissociazione è stato aggiunto alla prima colonna.Quando le cellule nella prima colonna della piastra hanno iniziato a sollevarsi dal fondo, utilizzare una pipetta multicanale P200 per aggiungere 160 microlitri di DPBS alla prima colonna e triturare delicatamente le cellule nelle posizioni a ore 12, 3, 6 e 9 di ciascun pozzetto. Trasferire l'intero volume con sospensione cellulare in una piastra a 96 pozzetti con fondo a V. Ripetere questi passaggi per le colonne rimanenti che contengono reagente di dissociazione, cambiando le punte in modo da non contaminare i pozzetti.Centrifugare la piastra con fondo a V nella centrifuga a 385 volte G per tre minuti a temperatura ambiente. I sub mostrati fino a questo punto per il passaggio di 96 pozzetti vengono eseguiti allo stesso modo ogni volta che le celle vengono passate in questo formato di piastra. Successivamente ti mostreremo come procedere se sei pronto per crioconservare le cellule in formato a 96 pozzetti.Per ulteriori informazioni, vedere il protocollo scritto. Dopo la fase di centrifugazione illustrata nella sezione precedente, aspirare il surnatante utilizzando una pipetta multicanale P200 e quindi risospendere in 60 microlitri di terreno di crescita integrati con 10 inibitori micromolari di ROCK. Ripetere per tutti i pozzetti, cambiando le punte in modo da non contaminare in modo incrociato.Trasferire 30 microlitri di sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti non rivestita da Matrigel. Trasferire i restanti 30 microlitri di sospensione in una piastra sorella, quindi aggiungere rapidamente 170 microlitri di tampone di congelamento a ciascun pozzetto senza mescolare. Si noti che questo processo viene eseguito in piastre sorelle duplicate in modo che esista una popolazione di cellule di riserva dopo che una delle singole piastre è stata scongelata.L'inserimento di cellule crioconservate solo in ogni altra colonna della piastra a 96 pozzetti consente uno scongelamento più rapido. Avvolgere il piatto con parafilm e metterlo in una scatola di polistirolo a temperatura ambiente con coperchio. Metti l'intera scatola nel congelatore a meno 80 gradi Celsius.Dopo 24 ore, le lastre possono essere trasferite fuori dalla scatola di polistirolo e ordinate a meno 86 gradi Celsius per un massimo di quattro settimane. La crioconservazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in formato a 96 pozzetti consente una pausa temporale nella coltura cellulare. Il ricercatore può eseguire saggi di convalida genomica sulle miniere clonali per identificare i cloni geneticamente desiderabili da scongelare per studi futuri.Quattro giorni dopo la trasfezione della linea hiPSC del WTC con una proteina guida specifica per l'RNA Cas9 e un plasmide stampo del donatore accuratamente progettato, è stato osservato che lo 0,95% delle cellule esprimeva GFP. Il FACS è stato utilizzato per selezionare tutte le cellule GFP positive come popolazione arricchita. Studi preliminari al microscopio hanno rivelato la localizzazione prevista della proteina di fusione della lamina nucleare B1 mEGFP nell'involucro nucleare.La proteina marcata in fluorescenza è stata osservata in circa il 95% delle cellule con intensità variabili. Dopo la generazione della linea clonale, sono stati ottenuti cloni con intensità mEGFP uniforme e ulteriormente analizzati per un editing preciso. Per concludere, abbiamo dimostrato un metodo di trasfezione per l'editing genetico di cellule staminali pluripotenti indotte umane per l'espressione di proteine di fusione fluorescenti regolate endogenamente.Poiché le tipiche inefficienze di knock sono basse, alcune strategie di arricchimento come il metodo FACS mostrato qui si traduce in una popolazione di cellule putativamente modificate che esprimono la proteina di fusione. La popolazione arricchita può essere utilizzata per studi biologici o possono essere generate linee clonali come descritto in questo metodo, rendendo possibile l'identificazione di linee cellulari che sono modificate con precisione geneticamente. È importante ricordare che le rotture del doppio filamento indotte da Cas9 nel genoma vengono spesso riparate in modo impreciso nonostante l'incorporazione del tag nel locus previsto.Inoltre, nei cloni modificati monoallelicamente, l'allele non marcato contiene spesso indel, molto probabilmente causati da una riparazione di giunzione delle estremità non omologa. Questi risultati sottolineano l'importanza della convalida genetica dopo un knock-in CRISPR Cas9 rivelato solo attraverso l'analisi del genoma di linee cellulari clonali. L'espressione della proteina di fusione attesa da sola non garantisce un editing preciso.Quando si utilizza questo protocollo per l'editing di cellule staminali pluripotenti indotte umane, fare attenzione a seguire le raccomandazioni dettagliate nel protocollo scritto per garantire una manipolazione delicata delle cellule per una sopravvivenza cellulare ottimale e una differenziazione spontanea minima. Ci auguriamo che questo video e l'elenco dei protocolli e dei materiali associati ti aiutino a eseguire esperimenti simili nel tuo laboratorio sulla tua proteina preferita. Grazie per l'attenzione.

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