Name: In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri l'auto-organizzazione dei pattern proteici MinD e MinE su membrane lipidiche supportate in microcompartimenti PDMS. Questo metodo permette un controllo preciso della formazione dei pattern per studiare la dinamica delle membrane cellulari.

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Ringraziamo Michael Heymann e Frank Siedler per la produzione di silicio wafer, Core Facility MPI-B per gli interventi nella purificazione della proteina e Simon Kretschmer e Leon Harrington per commenti sul manoscritto.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
<li>Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ParA%2FMinD+family+puts+things+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ParA/MinD family puts things in their place.</a> Trends Microbiol. 20 (9), 411-418 (2012).</li>
<li>Shih, Y. -L., Zheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+cell+division+site+by+the+Min+system+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the cell division site by the Min system in Escherichia coli.</a> Environ Microbiol. 15 (12), 3229-3239 (2013).</li>
<li>Halatek, J., Frey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+canalized+MinD+transfer+and+MinE+sequestration+explain+the+origin+of+robust+MinCDE-protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly canalized MinD transfer and MinE sequestration explain the origin of robust MinCDE-protein dynamics.</a> Cell Rep. 1 (6), 741-752 (2012).</li>
<li>Raskin, D. M., De Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinDE-dependent+pole-to-pole+oscillation+of+division+inhibitor+MinC+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">MinDE-dependent pole-to-pole oscillation of division inhibitor MinC in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181 (20), 6419-6424 (1999).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320 (5877), 789-792 (2008).</li>
<li>Wu, F., van Schie, B. G. C., Keymer, J. E., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+and+scale+orient+Min+protein+patterns+in+shaped+bacterial+sculptures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Symmetry and scale orient Min protein patterns in shaped bacterial sculptures.</a> Nat Nanotechnol. 10 (June), 719-726 (2015).</li>
<li>Hu, Z., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+regulation+of+cell+division+in+E.+coli%3A+Spatiotemporal+oscillation+of+MinD+requires+stimulation+of+its+ATPase+by+MinE+and+phospholipid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological regulation of cell division in E. coli: Spatiotemporal oscillation of MinD requires stimulation of its ATPase by MinE and phospholipid.</a> Mol Cell. 7 (6), 1337-1343 (2001).</li>
<li>Meinhardt, H., de Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+Escherichia+coli%3A+A+model+for+the+pole-to-pole+oscillations+of+Min+proteins+and+the+localization+of+the+division+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in Escherichia coli: A model for the pole-to-pole oscillations of Min proteins and the localization of the division site.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (25), 14202-14207 (2001).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+self-organizing+protein+gradients+as+spatial+cues+in+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of self-organizing protein gradients as spatial cues in cell-free systems.</a> Elife. 3, e03949(2014).</li>
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<li>Vecchiarelli, A. G., Mizuuchi, K., Funnell, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfing+biological+surfaces%3A+Exploiting+the+nucleoid+for+partition+and+transport+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surfing biological surfaces: Exploiting the nucleoid for partition and transport in bacteria.</a> Mol Microbiol. 86 (3), 513-523 (2012).</li>
<li>Thanbichler, M., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MipZ%2C+a+spatial+regulator+coordinating+chromosome+segregation+with+cell+division+in+Caulobacter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MipZ, a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter.</a> Cell. 126 (1), 147-162 (2006).</li>
<li>Lim, H. C., Surovtsev, I. V., Beltran, B. G., Huang, F., Bewersdorf, J., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+DNA-relay+mechanism+in+ParABS-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evidence for a DNA-relay mechanism in ParABS-mediated chromosome segregation.</a> Elife. 3, e02758(2014).</li>
<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+microdomains+localize+to+negatively+curved+regions+of+Escherichia+coli+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin microdomains localize to negatively curved regions of Escherichia coli membranes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 6264-6269 (2011).</li>
<li>Ivanov, V., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+modes+of+interconverting+dynamic+pattern+formation+by+bacterial+cell+division+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple modes of interconverting dynamic pattern formation by bacterial cell division proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8071-8078 (2010).</li>
<li>Caspi, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+Min+protein+patterns+in+fully+confined+fluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mapping out Min protein patterns in fully confined fluidic chambers.</a> Elife. 5, e19271(2016).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+MinDE+complex+acts+as+a+toggle+switch+that+drives+Min+oscillation+coupled+to+cytoplasmic+depletion+of+MinD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound MinDE complex acts as a toggle switch that drives Min oscillation coupled to cytoplasmic depletion of MinD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), E1479-E1488 (2016).</li>
<li>Kretschmer, S., Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+modulation+of+reconstituted+Min+protein+patterns+and+gradients+by+defined+mutations+in+MinE%27s+membrane+targeting+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale modulation of reconstituted Min protein patterns and gradients by defined mutations in MinE's membrane targeting sequence.</a> PLoS One. 12 (6), e0179582(2017).</li>
<li>Schweizer, J., Loose, M., Bonny, M., Kruse, K., Monch, I., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+sensing+by+self-organized+protein+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Geometry sensing by self-organized protein patterns.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (38), 15283-15288 (2012).</li>
<li>Martos, A., Raso, A., Jiménez, M., Petrášek, Z., Rivas, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+polymers+tethered+to+the+membrane+by+ZipA+are+susceptible+to+spatial+regulation+by+min+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FtsZ polymers tethered to the membrane by ZipA are susceptible to spatial regulation by min waves.</a> Biophys J. 108 (9), 2371-2383 (2015).</li>
<li>Vecchiarelli, A. G., Li, M., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinities+of+MinD+and+MinE+to+anionic+phospholipid+influence+Min+patterning+dynamics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential affinities of MinD and MinE to anionic phospholipid influence Min patterning dynamics in vitro.</a> Mol Microbiol. 93 (3), 453-463 (2014).</li>
<li>Glock, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+a+biological+reaction-diffusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Optical control of a biological reaction-diffusion system.</a> Angew Chemie Int Ed. 57 (9), 2362-2366 (2018).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+pole-to-pole+oscillations+of+min+proteins+in+microengineered+polydimethylsiloxane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of pole-to-pole oscillations of min proteins in microengineered polydimethylsiloxane compartments.</a> Angew Chemie Int Ed. 52 (1), 459-462 (2013).</li>
<li>Miyagi, A., Ramm, B., Schwille, P., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+Reveals+the+Inner+Workings+of+the+MinDE+Protein+Oscillator%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">High-Speed Atomic Force Microscopy Reveals the Inner Workings of the MinDE Protein Oscillator.</a> Nano Lett. 18 (1), 288-296 (2017).</li>
<li>Ramirez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treadmilling+analysis+reveals+new+insights+into+dynamic+FtsZ+ring+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Treadmilling analysis reveals new insights into dynamic FtsZ ring architecture.</a> PLoS Biol. 16 (5), e2004845(2018).</li>
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<li>Zieske, K., Schweizer, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+topology+assisted+alignment+of+Min+protein+waves%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface topology assisted alignment of Min protein waves.</a> FEBS Lett. 588 (15), 2545-2549 (2014).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Min+protein+patterns+emerge+from+rapid+rebinding+and+membrane+interaction+of+MinE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (5), 577-583 (2011).</li>
<li>Zieske, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+geometry-modulated+protein+patterns+in+membrane+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstituting geometry-modulated protein patterns in membrane compartments.</a> Methods Cell Biol. 128, 149-163 (2015).</li>
<li>Gruenberger, A., Probst, C., Heyer, A., Wiechert, W., Frunzke, J., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+picoliter+bioreactor+for+microbial+single-cell+analysis%3A+fabrication%2C+system+setup%2C+and+operation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic picoliter bioreactor for microbial single-cell analysis: fabrication, system setup, and operation.</a> J Vis Exp. (82), e50560(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Loose, M., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21545286">Protein self-organization: Lessons from the min system.</a> Annu Rev Biophys. 40, 315-336 (2011).</li>
<li>Arumugam, S., Petrašek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinCDE+exploits+the+dynamic+nature+of+FtsZ+filaments+for+its+spatial+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MinCDE exploits the dynamic nature of FtsZ filaments for its spatial regulation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1192-E1200 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo descritto un protocollo per la ricostituzione in vitro di MinCDE auto-organizzazione su facce planari supportato lipidici e lipidici a doppio strato coperto strutture 3D, utilizzando l'esempio di asta-a forma di microstrutture PDMS. Al fine di ottenere dati importanti da queste analisi, i fattori più importanti da controllare sono qualità della proteina e della membrana.
Per garantire la qualità delle proteine, proteine massa dovrebbe essere confermato mediante SDS-PAGE e spettrometria di massa. Inoltre, occorre verificare che le proteine siano solubili e non aggregati, mediante cromatografia analitica o la dispersione della luce dinamica. Gel filtrazione può essere utilizzato per rimuovere qualsiasi frazione di aggregati di proteine. Regolazione del pH attenzione e qualità di nucleotidi aggiunto è critica, come l'aggiunta di nucleotidi non rettificati o parzialmente degradato alla proteina scorte o auto-organizzanti saggi è sufficiente ad eliminare l'attività della proteina, quindi abolizione auto-organizzazione.
Accanto alla qualità delle proteine, qualità di membrana è più critica e formazione impropria della membrana è più spesso la causa per difettosi auto-organizzazione e l'origine delle strutture superficiali artefactual.
Quando si esegue il protocollo per la prima volta, è utile etichettare i lipidici supportati includendo lipidi etichettati come Atto-655-DOPE o DiI a basse percentuali di molare (0,05%). Quindi la proprietà e la qualità della membrana può essere giudicati direttamente. Utilizzando FRAP, la fluidità della membrana può essere valutata. Inoltre, uno può valutare direttamente la qualità del lavaggio dei SLB, come ci può essere troppo molte vescicole, nessuna membrana fluida o nessuna membrana affatto, se esso è stato lavato. L'approccio di camera aperta permette di lavare rigorosamente la membrana e quindi anche per rimuovere le vescicole che stanno attaccando sulla superficie di SLB. I fattori più importanti per l'ottenimento del lipido supportato fluido e omogeneo doppii strati sono la pulizia e l'idrofilia della superficie di appoggio e la corretta dimensione e omogeneità di SUvs può essere utile controllare la dimensione del SUV e dimensioni distribuzione utilizzando diffusione dinamica della luce. Per distribuzioni di dimensione stretta, consigliamo le vescicole di espulsione, piuttosto che sonicating li. Altri metodi di pulizia vetrini coprioggetti, ad esempio, trattamenti con basi forti, detergenti base o utilizzando vetrini coprioggetti direttamente dopo il risciacquo con acqua, possono produrre buoni risultati, a seconda della miscela del lipido e di applicazione.
La prima metà del protocollo presentato qui, la ricostituzione in vitro su lipidici supportati planare in aperta chambers, ha il vantaggio di rendere la superficie accessibile per microscopie ottiche, ad esempio TIRF microscopia30, FRAP analisi6, singola particella34, come pure la sonda per superfici tecniche quali la microscopia di forza atomica26di rilevamento. La grande area omogenea consente migliori statistiche alle concentrazioni definite. L'approccio di camera aperta permette inoltre di controllare con precisione la concentrazione nella proteina e una rapida e semplice aggiunta di ulteriori componenti, permettendo quindi a titolare di concentrazione nella proteina in una singola camera20. Il dosaggio può essere espanso con aggiunta di altri componenti batteriche divisome come FtsZ22,35, ZipA22 o la proteina chimerica FtsZ-YFP-MTS10,35.
Altri gruppi hanno adottato un approccio simile per ricostituire il Min sistema in vitro, ma utilizzare una cella di flusso invece di una camera aperta17,18,19. Le cellule di flusso sono determinati vantaggi, in particolare quando un ambiente 3D completamente chiuso è necessario18, l'influenza di flusso17,19,23 o membrana composizione23 modelli di MinCDE è studiato, o se pattern proteici devono essere osservati sotto proteina limitando condizioni19. Tuttavia, il controllo locale delle concentrazioni molecolari è più difficile. Componenti proteiche, soprattutto la mente, si legano fortemente alla membrana incontrano prima18,19. Nella nostra esperienza, le proteine esibiscono frequentemente legame non specifico alla tubazione, insenature, siringhe e altre parti di microfluidica. Quindi, le concentrazioni di proteina locale differiscono da concentrazioni ingresso18 e variano anche sopra la lunghezza della cella di flusso, causando una varietà di modelli differenti della proteina sulla membrana tra ingresso e uscita, come osservato da altri19.
La seconda metà del protocollo presentato qui, la ricostituzione in vitro in asta-a forma di microstrutture ri-utilizzando l'approccio di camera aperta su un supporto modellato coperto da lipidi bilayer permette per un semplice mimo di comportamento di proteina in vivo anche se un controllo preciso sulla concentrazione proteica viene perso a causa di rimozione del tampone. Si noti che perché la lunghezza d'onda di MinDE è circa un ordine di grandezza più grandi in vitro che in vivo l'asta-a forma di microcompartments sono anche circa un ordine di grandezza più grandi (10 x 30 µm) rispetto a un asta-a forma di e. coli di cella.
Nel complesso, questo protocollo consente il controllo preciso di tutte le condizioni compreso concentrazione proteica, buffer composizione e proprietà della membrana. L'utilizzo di supporti strutturati 3D consente la reazione essere studiato sotto confinamento spaziale, che imita il comportamento in vivo senza la necessità di apparecchiature complesse microfluidica.

Reticoli spatiotemporal sono essenziali nella natura, che regolano attività complesse a livello pluricellulare e cellulare, da morfogenesi a divisione cellulare regolamentati1,2. Sistemi di reazione-diffusione svolgono un ruolo importante nella creazione di questi modelli, ma sono ancora non ben compreso. Un primo esempio di un sistema di reazione-diffusione e il miglior sistema biologico caratterizzato finora è l'Escherichia coli MinCDE sistema3,4,5,6,7. Il sistema di MinCDE oscilla dal Polo di cella al Polo di cella in e. coli per determinare la metà della cella come il sito di futura Divisione. Questo sistema si basa sulla mente dell'atpasi, l'atpasi proteina d'attivazione, miniera e la membrana come una reazione spaziale matrice8. MinC non fa parte del meccanismo di formazione del modello, ma è l'effettivo agente funzionale: un inibitore della divisome principale proteina FtsZ5,6. MinC si lega alla mente e quindi segue le oscillazioni, risultante in un gradiente di concentrazione di tempo-mediata della proteina che è massima ai poli della cellula e minima al centro delle cellule, consentendo solo FtsZ a polimerizzare a midcell9,10 . Il sistema di MinCDE è parte della più grande famiglia di Walker A ATPases che sono fondamentali per l'organizzazione spazio-temporale in batteri2, per il posizionamento e trasporto della proteina complessi11 e plasmidi12 e per la regolazione delle cellule Divisione13 e cromosoma segregazione14. Quindi, il sistema di reazione-diffusione di MinCDE non solo rappresenta un sistema di reazione-diffusione archetipico, ma ha anche attirato l'attenzione per la sua importanza per l'organizzazione spazio-temporale nei batteri.
Studi dettagliati funzionali del MinCDE sistema in vivo sono complicati, come manipolazione dell'omissione del gene e proteine in genere causare difetti di divisione cellulare. Inoltre, cambiando la composizione della membrana o le proprietà del citosol in vivo è molto impegnativo15,16. Modifiche al sistema e fattori che sono difficili da interpretare nel complesso ambiente della cellula, ancor di più se è disturbato in una funzione così essenziale come la divisione cellulare. Noi ed altri abbiamo quindi girato per un approccio in vitro la ricostituzione, riducendo il sistema ai relativi componenti di base: mente, miniera, trifosfato di adenosina come fonte di energia e il doppio strato lipidico supportati come una reazione matrice6,17, 18. questo approccio bottom-up permette di sondare il meccanismo di auto-organizzazione in dettaglio senza la complessità di una cellula vivente. La forma di proteine viaggiando superficie onde6 e altri tipi di modelli17,19 in queste condizioni, anche se con una lunghezza d'onda che è di solito circa un ordine di grandezza maggiore di in vivo. L'uso di una camera aperta facilita un controllo preciso su tutti gli aspetti che influenzano la formazione di pattern: proteina concentrazioni6, proteina proprietà20, membrana composizione10, buffer composizione e concentrazione di ATP 6, anche con aggiunta di altri fattori quali affollamento agenti21 e altre proteine di divisome22. In confronto, la ricostituzione in vitro del sistema MinCDE in una cella di flusso18,19,23 può essere utilizzata per l'influenza del flusso17,23, proteina della sonda limitando le condizioni19, membrana composizione19 e confinamento 3D18 il pattern proteico, ma esegue il rendering di un controllo esatto del componente proteica/concentrazione e inoltre componente sequenziale molto più complicato.
Utilizzando questa camera aperta, abbiamo modellato anche il supporto dei planar lipidici mediante il quale uno può sondare come geometriche confini influenza modello formazione21, un fenomeno che ha recentemente stato anche studiato in vivo utilizzando batteri modellato in microstrutture7. Abbiamo impiegato anche questo test per studiare mutazioni come sono definite nella mia formazione di pattern di effetto del sistema20. Inoltre, lo stesso formato di base di analisi è stato impiegato per indagare come la formazione di pattern può essere controllato dalla luce, introducendo un peptide di miniera azobenzene-reticolato il dosaggio e di imaging con TIRF microscopia24.
Abbiamo trovato che, al fine di replicare il modello MinDE formazione osservata in vivo in un confinamento di sistema, in vitro è stata la chiave. Consentito l'utilizzo di asta-a forma di microcompartments, con dimensioni regolati alla lunghezza d'onda più grande di MinDE in vitro (10 x 30 µm), rivestito con un doppio strato lipidico supportati la ricostituzione delle oscillazioni di poli-poli MinDE e formazione di gradienti della proteina 10,25. In questa analisi, i lipidici supportati sono depositati su un substrato PDMS fantasia che contiene repliche diverse centinaia di microcompartments a forma di bastoncello che rimangono aperti in alto a sinistra. In questo modo, la reazione può essere impostata in una camera aperta, e successivamente il buffer viene abbassato al bordo del microcompartments, limitando quindi la reazione di un piccolo volume. Anche se questi scomparti hanno un'interfaccia aria-buffer su un lato e quindi non rappresentano un confinamento 3D completo di membrana, le dinamiche di proteina ha imitato in vivo oscillazioni10,25. Rispetto al confinamento 3D completo, che mostra molto simili risultati18, l'analisi di microstrutture aperto è relativamente semplice e facile da gestire e può essere eseguita anche da laboratori che non sono dotati di attrezzature specializzate microfluidica e Servizi in camera pulita.
Qui, presentiamo un protocollo sperimentale per la ricostituzione MinCDE formazione di pattern su supportato dei lipidi bilayer in vitro utilizzando una camera aperta che permette di controllare tutti i componenti e facile accesso mediante microscopia ottica e, con minore modifiche, inoltre è adattabile per tecniche di superficie-sonda26. Accanto a planare lipidici supportati, mostriamo anche come confinamento della proteina può essere ottenuto utilizzando lipidici supportati fantasia semplice su asta-a forma di microstrutture PDMS. Queste analisi, anche se ottimizzato per il sistema di MinCDE, possono essere trasferite anche ad altri sistemi di proteine che interagiscono in modo simile con la membrana, ad esempio FtsZ27 o una corteccia di actina minimo28.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG Avanti</td><td>Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sale disodico triidrato</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-difosfato sale monopotassico diidrato</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Etilene Diammina Tetraacetato</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico 98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno 50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glicerolo 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB medio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarosio</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>Reticolante PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Colla</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 e #63 funzionano entrambi bene</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td></td><td>utilizzato solo per microstrutture PDMS</td></tr><tr><td>Provetta di reazione da 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>Pallone di</tr><tr><td>coltura 0030123301 2L</td><td>Corning</td><td>, ad es. 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna di gelfiltrazione: HiLoad Superdex 75 PG o 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td>Colonna</tr> di <tr><td>desalinizzazione Econo-Pac 10DG Colonna preimpaccata</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>dispositivo per dialisi: Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer, 3,5K MWCO, 0,1 - 0,5 mL o 0,5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 o 66330</td><td></td></tr><tr><td>lama di</td><td></td><td></td><td></td> rasoio</tr><tr><td><forte>Strumenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acqua ultrapura: Sistemi di acqua ultrapura Milli-Q Tipo 1</td><td>Sistema</td> automatizzato di purificazione delle proteine Merck<td></td><td></td></tr><tr><td>: &Auml; kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bagno, sonicatore</td><td>Branson</td><td></td><td>, ad esempio modello 1510</td></tr><tr><td>ARE-250, miscelatore</td>, <td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulitore al plasma Zepto</td><td>Diener, uso elettronico</td><td></td>, <td>ossigeno come gas di processo</td></tr><tr><td>, pipette a spostamento positivo,</td><td>marca</td><td>Transferpettor, modelli</td> con <td></td> punte</tr> <tr><td>in vetroMicroscopio a scansione laser confocale LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Dotato di obiettivo a immersione in acqua Zeiss C-Apochromat 40X/1.20</td></tr><tr><td>Plasmidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmide codificante His-MinD e MinE non marcato per migliorare la resa</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmide codificante His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmide codificante His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille</td><td></td><td>codificante plasmidi His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmide codificante per His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro ricostituzione di self-organizing pattern proteico su lipidici supportati

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Molti aspetti dell'organizzazione spatiotemporal fondamentale delle cellule sono regolati dai sistemi del tipo di reazione-diffusione. In vitro la ricostituzione di tali sistemi permette per studi dettagliati dei loro meccanismi di fondo che non sarebbe fattibile in vivo. Qui, forniamo un protocollo per la ricostituzione in vitro del sistema MinCDE di Escherichia coli, che posiziona il setto di divisione delle cellule nel mezzo delle cellule. Il dosaggio è stato progettato per fornire solo i componenti necessari per l'auto-organizzazione, vale a dire una membrana, le due proteine mente e MinE ed energia sotto forma di ATP. Abbiamo pertanto fabbricare una camera di reazione aperta su un vetrino coprioggetti, su cui si forma un doppio strato lipidico supportati. Il design aperto della camera permette per la preparazione ottimale del bilayer del lipido e manipolazione controllata dei contenuti alla rinfusa. Le due proteine, mente e MinE, nonché ATP, vengono quindi aggiunti nel volume di massa sopra la membrana. La formazione immagine è possibile da molti microscopie ottiche, come i supporti di progettazione confocale, grandangolari e microscopia TIRF allo stesso modo. In una variante del protocollo, il doppio strato lipidico è formato su un supporto di fantasia, su microstrutture PDMS a forma di cellulare, invece di vetro. Abbassando la soluzione di massa fino all'orlo di questi comparti racchiude la reazione in un vano più piccolo e fornisce i confini che permettono che imita di in vivo comportamento oscillatorio. Presi insieme, descriviamo i protocolli per ricostituire il sistema MinCDE sia con che senza confinamento spaziale, consentendo ai ricercatori di controllare con precisione tutti gli aspetti che influenzano la formazione di pattern, ad esempio intervalli di concentrazione e l'aggiunta di altri fattori o proteine e sistematicamente aumentare la complessità del sistema in un relativamente semplice messa a punto sperimentale.

Purificazione della proteina seguendo il nostro protocollo dovrebbe produrre proteine Min di purezza adeguata. Come riferimento, la Figura 1 fornisce un'immagine di SDS-PAGE della mente, fluorescente etichettati mente, MinE e MinC. I singoli passaggi della procedura per eseguire un test di auto-organizzazione di MinDE su non-fantasia lipidici supportati sono descritti nella Figura 2. Usando questo protocollo, regolari MinDE viaggiare le onde di superficie possa essere osservati durante l'alloggiamento (Figura 3). La lunghezza d'onda può variare leggermente all'interno della camera, ma in generale i modelli sembrano simili. I bordi della camera non dovrebbero essere utilizzati per confronti quantitativi, come membrane che forma sulla colla UV sembra avere proprietà diverse rispetto sul vetro di superficie (vedere Figura 3). Le onde di superficie itinerante possono essere analizzate tracciando l'intensità lungo la direzione di propagazione (Figura 3B). Mentre mente fluorescenza altipiani piuttosto veloce dal bordo superiore dell'onda e quindi diminuisce bruscamente sul bordo d'uscita, miniera fluorescenza aumenta quasi linearmente dall'inizio dell'onda mente e raggiunge il suo massimo dopo mente sul bordo d'uscita, dove si si stacca nettamente6.
Accanto alla qualità delle proteine, la qualità della lipidici supportati è più critica per una regolare auto-organizzazione dei MinCDE. Da un lato se la membrana viene lavata troppo eccessivamente o la superficie sottostante è stata pulita e così addebitata troppo fortemente, possono formare fori nella membrana (Figura 6A, parte superiore). D'altra parte se la membrana non è lavata correttamente o la superficie sottostante non è pulita, idrolizzato, vescicole che si attaccano alla membrana o sarà compromessa la fluidità di membrana (Figura 6A, in basso). Anche se non così evidente come quando si osserva la membrana direttamente via con etichettati lipidi, questi problemi possono essere rilevati anche dal segnale di fluorescenza di mente, come modelli non sono regolari e la fluorescenza nei massimi non è omogenea ma contiene "buchi" o punti luminosi come mostrato nel pannello centrale della Figura 6A.
Per auto-l'organizzazione di MinDE in asta-a forma di microstrutture PDMS la procedura è riassunto nella Figura 4. Diversi passaggi di protocollo non devono essere ripetute, come proteine e lipidi possono essere riutilizzati. Come su substrati non-fantasia, il substrato viene pulito e idrolizzato (di pulizia al plasma), un doppio strato lipidico supportati è formata sul PDMS e il test di auto-organizzazione è impostato in un volume di 200 µ l. Per verificare che si è formata una membrana corretta e MinDE auto-organizza sulla membrana, gli alloggiamenti sono Imaging. Quando una membrana corretta è stata formata, MinDE forme regolari viaggio onde superficiali sulla superficie del PDMS tra le microstrutture individuali e anche auto-organizza in fondo le microstrutture come le onde possono liberamente muoversi sopra l'intero superficie ricoperta di membrana (Figura 5A). Dopo la rimozione del tampone, la superficie tra i comparti non dovrebbe mostrare alcun pattern MinDE moltiplicazione (figura 5B), come dovrebbe essere completamente asciutto. Se MinDE modelli sono ancora in movimento, più buffer deve essere rimosso. Le proteine sono ora confinate nel microcompartments a forma di bastoncino il PDMS rivestito di membrana ed aria sull'interfaccia superiore (Figura 5), in cui self organizzeranno. In queste condizioni le due proteine possono eseguire Polo-Polo oscillazioni come mostrato in Figura 5. Come una frazione della mente e la mia è sempre legata alla membrana, anche durante la rimozione del tampone, le concentrazioni dopo la rimozione del tampone non sono paragonabili a concentrazioni di input. A causa di questo effetto le concentrazioni variano anche tra singole microstrutture il coprivetrino stesso come essi dipendono dalla posizione dei modelli prima della rimozione del tampone. Produzione di wafer di silicio o PDMS stampaggio da wafer di silicio può causare microstrutture incomplete che non possono essere utilizzate per l'analisi (Figura 6B). Inoltre, a causa del buffer microstrutture di rimozione potrebbero asciugarsi durante il processo e quindi, dovrebbero essere esclusi dall'ulteriore analisi (Figura 6B). Di conseguenza solo una frazione di microstrutture in uno alloggiamento Mostra le oscillazioni di Polo-Polo desiderate. Per analizzare le dinamiche di proteina in microstrutture, un kymograph può essere ottenuta disegnando una selezione su tutta la struttura (Figura 5E). Quando MinCDE oscillare da Polo a Polo, MinC e mente mostrerà un gradiente di concentrazione mediato nel tempo con la massima concentrazione ai poli di vano e concentrazione minima al centro del vano (Figura 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figura 1: SDS-PAGE mostrando i prodotti finali di purificazioni proteina. Sua mente (33,3 kDa), His-eGFP-mente (60,1 kDa), His-mRuby3-mente (59,9 kDa), His-miniera (13,9 kDa) e His-MinC (28,3 kDa) sono mostrati in ordine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figura 2: diagramma di flusso del processo mostrando i singoli passaggi e la tempistica del protocollo per un auto-organizzazione su lipidici con motivi non supportati (passi 1-6). Caselle tratteggiate indicano che una di queste due opzioni può essere utilizzata per la pulizia. Le frecce contrassegnate dai cerchi indicano dove il protocollo può essere sospesa e ripresa successivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figura 3: Imaging di MinDE analisi mediante microscopia confocale a. A) a spirale regolare Min, da quale velocità di propagazione, la trama di intensità e la velocità possono essere ottenute misurazioni. Concentrazioni usate: 0,6 µM mente (30% eGFP-mente), 1,8 µM His-miniera (30% sua-miniera-Alexa647) B) esempio grafico di intensità normalizzata per la regione segnata in r. C) Panoramica della camera di dosaggio intero (barra della scala: 1mm, stesse concentrazioni di proteina come sopra). Spirali o senso di rotazione così come modelli di destinazione possono essere osservati. La regione ingrandita Mostra come onda modelli differiscono sulla UV-colla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figura 4: diagramma di flusso del processo mostrando i singoli passaggi e la tempistica del protocollo per l'auto-organizzazione in asta-a forma di microstrutture (passi 1-5, 7, 8). Caselle grigie indicano passaggi dove i prodotti possono essere riutilizzati dal protocollo su lipidici con motivi non supportati. Le frecce contrassegnate dai cerchi indicano dove il protocollo può essere sospesa e ripresa successivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figura 5: risultati rappresentativi per MinDE modello formazione in asta-a forma di microcompartments PDMS. A) MinDE auto-organizzarsi sulla superficie del PDMS formando onde di superficie in viaggio (1 µM mente (30% EGFP-mente), 2 µM miniera e 2,5 mM ATP). B) dopo il buffer è abbassato all'altezza di microstrutture, l'auto-organizzazione della proteina si interrompe sulla superficie planare tra il microcompartments. C) schematica di un asta-a forma di microcompartment. D) immagini rappresentative delle oscillazioni di poli-poli MinDE dopo la rimozione del tampone. E) Kymograph delle oscillazioni lungo la riga evidenziata indicata in D). F) immagine e il profilo dell'intensità di fluorescenza media della serie tempo mostrato nella D) mostrando chiaramente il gradiente della proteina che è massima ai poli microcompartment e minima al centro del vano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figura 6: esempi di risultati sperimentali negativi. A) membrane over-lavate si accumulano fori, mentre preparazioni suboptimali della vescicola e composizioni lipidiche conducono ad attaccare le vescicole. I pannelli del due centro mostrano una combinazione di entrambi i problemi e come diventano visibili quando si osservano oscillazioni Min. Le membrane sono state etichettate con 0.05% Atto655-DOPE. (scala bar: 50 µm) B) pannello superiore: seccava microcompartments può essere causato da troppo rimozione di buffer o quando il buffer si volatilizza nel corso del tempo. Pannello di fondo: scomparti Incomplete possono formarsi durante la produzione di wafer o stampaggio PDMS. (scala bar: 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementari 1: Mappa di plasmide per la sua mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 2: Mappa di plasmide per sua-EGFP-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 3: Mappa di plasmide per sua-mRuby3-mente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 4: Mappa di plasmide per la sua miniera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 5: Mappa di plasmide per sua MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementari 6: File CAD per wafer di silicio di microcompartments a forma di bastoncello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Forniamo un protocollo per in vitro test di auto-organizzazione della mente e la mia su un doppio strato lipidico supportati in una camera aperta. Inoltre, descriviamo come racchiudere il dosaggio del lipido-clad PDMS microcompartments per simulare condizioni in vivo di confinamento di reazione.

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'organizzazione delle cellule e sulle membrane, ad esempio quale ruolo svolgono i segnali geometrici nel processo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un controllo preciso su tutti gli aspetti che influenzano la formazione del pattern, come le concentrazioni proteiche. Per iniziare, generare vescicole multilamellari come descritto nel protocollo di testo.Ora, congelare-scongelare i lipidi per sette-10 cicli, preparando prima un becher con acqua a 70-99 gradi Celsius su una piastra calda, nonché un contenitore contenente azoto liquido. Tenere la fiala in azoto liquido con una pinzetta grande fino a quando l'azoto non smette di bollire. Quindi trasferire il flaconcino in acqua calda fino a quando la soluzione non è completamente scongelata.Ripeti questi passaggi fino a quando la miscela lipidica appare chiara alla vista, a seconda della miscela. Quindi, assemblare un estrusore lipidico e pre-risciacquare il sistema con il tampone Min. Estrudere la miscela lipidica tra 35 e 41 volte attraverso una membrana di 50 nanometri di dimensione dei pori.Assicurarsi di terminare con un numero dispari di passaggi per evitare aggregati che non hanno mai attraversato la membrana. Distribuire vetrini coprioggetti su una piastra di Petri in vetro rovesciato o su un'altra superficie inerte. Con una pipetta di vetro, aggiungere sette gocce di acido solforico concentrato al centro di ciascun vetrino coprioggetti.Quindi aggiungere due gocce di perossido di idrogeno al 50% al centro delle gocce acide. Coprire la reazione e incubare per almeno 45 minuti. Ora, raccogli i vetrini coprioggetti singolarmente usando una pinzetta e risciacqua l'acido con acqua ultrapura.Posizionare i vetrini coprioggetti lavati in supporti antiaderenti o in un dispositivo di trasporto simile. A questo punto, sciacquare accuratamente ogni vetrino coprioggetti con acqua ultrapura e asciugare la superficie con gas pressurizzato. Segnare il lato pulito del vetrino coprioggetti con un pennarello indelebile.Per assemblare la camera, tagliare e scartare prima il coperchio e la parte conica di una provetta di reazione da 0,5 millilitri con forbici affilate. Quindi applicare la colla UV sul bordo superiore del tubo e distribuire uniformemente la colla utilizzando una punta per pipetta. Incollare il tubo capovolto sul lato pulito del vetrino coprioggetti.Infine, polimerizza la colla UV posizionando più camere sotto una lampada a 360 nanometri o un LED per cinque-15 minuti. Per una formazione supportata del doppio strato lipidico, preriscaldare un blocco termico a 37 gradi Celsius e incubare provette di reazione da due millilitri con tampone Min o SLB in una provetta per camera. Soffiare l'azoto nelle camere assemblate e polimerizzate per rimuovere la polvere o altre particelle che potrebbero essersi depositate durante l'indurimento UV e l'assemblaggio.Quindi, posizionare le camere sul blocco termico. Diluire un'aliquota di 20 microlitri di lipidi chiari con 130 microlitri di tampone Min, costruendo una concentrazione di lavoro di 0,53 milligrammi per millilitro. Aggiungere 75 microlitri della miscela lipidica in ogni camera.Ora, imposta un timer su tre minuti. Durante il tempo di incubazione, le vescicole scoppiano sulla superficie del vetro idrofilo e si fondono per formare un SLB coerente. Trascorsi 60 secondi, aggiungere 150 microlitri di tampone Min in ogni camera.Dopo i restanti 120 secondi, lavare ogni camera aggiungendo 200 microlitri di tampone Min o SLB, pipettando accuratamente su e giù alcune volte, rimuovendo e aggiungendo altri 200 microlitri. Una volta che ogni camera è stata lavata una volta, procedere a lavare accuratamente la prima camera fino ad esaurimento dei due millilitri di tampone. Il lavaggio dei doppi strati lipidici supportati richiede una certa esperienza per perfezionare l'entità dei movimenti nella camera e trovare la corretta intensità di lavaggio.Per produrre microstrutture PDMS da wafer di silicio modellati, utilizzare prima un bicchiere di plastica per pesare 10 grammi di base PDMS e un grammo di reticolante PDMS. Utilizzare un dispositivo di miscelazione per miscelare e degassare la miscela PDMS. A questo punto, utilizzare la punta di una pipetta per far cadere una piccola quantità di PDMS direttamente sulla struttura del wafer di silicio.Posizionare immediatamente un vetrino coprioggetti 1 sulla goccia PDMS e prendere l'estremità superiore di una punta di pipetta pulita per premere delicatamente il vetrino coprioggetti sul wafer di silicone. Il PDMS dovrebbe diffondersi sottilmente tra il vetrino coprioggetti e il wafer di silicio. Metti il wafer con i vetrini coprioggetti in un forno e polimerizza il PDMS per tre o quattro ore, o durante la notte, a 75 gradi Celsius.Quindi, togliete la cialda dal forno e lasciatela raffreddare a temperatura ambiente. Con una lama di rasoio, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti con il PDMS attaccato dal wafer di silicone. Ora, collegare una camera di plastica al PDMS come descritto in precedenza per il vetro.Prendere i vetrini coprioggetti con la camera attaccata e metterli nel pulitore al plasma con l'ossigeno come gas di processo. Pulire i vetrini coprioggetti con il plasma. In questo lavoro è stata utilizzata una potenza del 30% e una pressione di ossigeno di 0,3 millibar per un minuto.Ora, prepara un SLB nella camera come descritto prima sul vetro. Per eseguire il saggio di auto-organizzazione, regolare il volume del tampone nella camera a 200 microlitri di tampone Min, meno la quantità di proteina e la soluzione di ATP. Quindi aggiungere MinD, etichettato MinD, MinE e, se lo si desidera, MinC, e mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio.Ora, aggiungi 2,5 millimolari di ATP per avviare l'auto-organizzazione di MinDE. Nei successivi 10-30 minuti, verificare la formazione regolare del pattern MinDE e le microstrutture formate correttamente su un microscopio a fluorescenza. Quando si sono formati i normali modelli MinDE, pipettare delicatamente su e giù due volte per miscelare i componenti.Rimuovere la maggior parte del tampone utilizzando una pipetta da 100 microlitri, quindi rimuovere con cura il resto utilizzando una pipetta da 10 microlitri. Per consentire tempi di imaging più lunghi, inserire un pezzo di spugna inumidito all'interno della camera. Assicurarsi che la spugna non entri in contatto con la superficie del vetrino coprioggetti.Chiudere immediatamente la camera con un coperchio per evitare l'essiccazione del tampone residuo nelle microstrutture. Prima dell'imaging delle microstrutture, confermare che l'auto-organizzazione di MinDE è bloccata sulla parte superiore della microstruttura PDMS mentre le proteine nelle microcavità oscillano. In questo video rappresentativo, l'imaging a due colori mostra come MinD e MinE si auto-organizzano in onde superficiali che si conformano a modelli a spirale su doppi strati lipidici supportati.Qui, l'imaging a colori singoli mostra MinD e MinE che eseguono oscillazioni da polo a polo nelle microstrutture PDMS. Le oscillazioni stabiliscono un gradiente di concentrazione MinD mediato nel tempo con la massima concentrazione ai poli del compartimento e la concentrazione minima al centro del compartimento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il tracciamento di singole particelle, al fine di determinare la cinetica di legame della membrana e i tempi di residenza.Non dimenticare che lavorare con la soluzione piranha può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i dispositivi di protezione individuale.

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La fusione mitocondriale è un'importante reazione omeostatica alla base delle dinamiche mitocondriali. Descritto qui è un sistema di ricostituzione in vitro per studiare la fusione mitocondriale interno-membrana che può risolvere il tethering della membrana, docking, emifusione, e l'apertura pore. Viene discussa la versatilità di questo approccio nell'esplorazione dei sistemi a membrana cellulare.

Una piattaforma di membrana modello per la ricostituzione delle dinamiche della membrana mitocondriale

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Questo protocollo descrive la formazione di doppi strati lipidici supportati e l'aggiunta di filamenti citoscheletrici e proteine motorie per studiare la dinamica delle reti citoscheletriche ricostituite e legate alla membrana utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Qui viene descritto un protocollo per la generazione di pattern proteici reversibili e regolati dalla luce con un'elevata precisione spaziotemporale sulle membrane lipidiche artificiali. La metodica consiste nella fotoattivazione localizzata della proteina iLID (improved light-inducible dimer) immobilizzata su membrane modello che, sotto luce blu, si lega alla sua proteina partner Nano (SspB wild-type).

Modelli proteici dinamici indotti dalla luce su membrane modello

Scopri l'auto-organizzazione dei pattern proteici MinD e MinE su membrane lipidiche supportate in microcompartimenti PDMS. Questo metodo permette un controllo preciso della formazione dei pattern per studiare la dinamica delle membrane cellulari.

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

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