In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'organizzazione delle cellule e sulle membrane, ad esempio quale ruolo svolgono i segnali geometrici nel processo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un controllo preciso su tutti gli aspetti che influenzano la formazione del pattern, come le concentrazioni proteiche. Per iniziare, generare vescicole multilamellari come descritto nel protocollo di testo.

Ora, congelare-scongelare i lipidi per sette-10 cicli, preparando prima un becher con acqua a 70-99 gradi Celsius su una piastra calda, nonché un contenitore contenente azoto liquido. Tenere la fiala in azoto liquido con una pinzetta grande fino a quando l'azoto non smette di bollire. Quindi trasferire il flaconcino in acqua calda fino a quando la soluzione non è completamente scongelata.

Ripeti questi passaggi fino a quando la miscela lipidica appare chiara alla vista, a seconda della miscela. Quindi, assemblare un estrusore lipidico e pre-risciacquare il sistema con il tampone Min. Estrudere la miscela lipidica tra 35 e 41 volte attraverso una membrana di 50 nanometri di dimensione dei pori.

Assicurarsi di terminare con un numero dispari di passaggi per evitare aggregati che non hanno mai attraversato la membrana. Distribuire vetrini coprioggetti su una piastra di Petri in vetro rovesciato o su un'altra superficie inerte. Con una pipetta di vetro, aggiungere sette gocce di acido solforico concentrato al centro di ciascun vetrino coprioggetti.

Quindi aggiungere due gocce di perossido di idrogeno al 50% al centro delle gocce acide. Coprire la reazione e incubare per almeno 45 minuti. Ora, raccogli i vetrini coprioggetti singolarmente usando una pinzetta e risciacqua l'acido con acqua ultrapura.

Posizionare i vetrini coprioggetti lavati in supporti antiaderenti o in un dispositivo di trasporto simile. A questo punto, sciacquare accuratamente ogni vetrino coprioggetti con acqua ultrapura e asciugare la superficie con gas pressurizzato. Segnare il lato pulito del vetrino coprioggetti con un pennarello indelebile.

Per assemblare la camera, tagliare e scartare prima il coperchio e la parte conica di una provetta di reazione da 0,5 millilitri con forbici affilate. Quindi applicare la colla UV sul bordo superiore del tubo e distribuire uniformemente la colla utilizzando una punta per pipetta. Incollare il tubo capovolto sul lato pulito del vetrino coprioggetti.

Infine, polimerizza la colla UV posizionando più camere sotto una lampada a 360 nanometri o un LED per cinque-15 minuti. Per una formazione supportata del doppio strato lipidico, preriscaldare un blocco termico a 37 gradi Celsius e incubare provette di reazione da due millilitri con tampone Min o SLB in una provetta per camera. Soffiare l'azoto nelle camere assemblate e polimerizzate per rimuovere la polvere o altre particelle che potrebbero essersi depositate durante l'indurimento UV e l'assemblaggio.

Quindi, posizionare le camere sul blocco termico. Diluire un'aliquota di 20 microlitri di lipidi chiari con 130 microlitri di tampone Min, costruendo una concentrazione di lavoro di 0,53 milligrammi per millilitro. Aggiungere 75 microlitri della miscela lipidica in ogni camera.

Ora, imposta un timer su tre minuti. Durante il tempo di incubazione, le vescicole scoppiano sulla superficie del vetro idrofilo e si fondono per formare un SLB coerente. Trascorsi 60 secondi, aggiungere 150 microlitri di tampone Min in ogni camera.

Dopo i restanti 120 secondi, lavare ogni camera aggiungendo 200 microlitri di tampone Min o SLB, pipettando accuratamente su e giù alcune volte, rimuovendo e aggiungendo altri 200 microlitri. Una volta che ogni camera è stata lavata una volta, procedere a lavare accuratamente la prima camera fino ad esaurimento dei due millilitri di tampone. Il lavaggio dei doppi strati lipidici supportati richiede una certa esperienza per perfezionare l'entità dei movimenti nella camera e trovare la corretta intensità di lavaggio.

Per produrre microstrutture PDMS da wafer di silicio modellati, utilizzare prima un bicchiere di plastica per pesare 10 grammi di base PDMS e un grammo di reticolante PDMS. Utilizzare un dispositivo di miscelazione per miscelare e degassare la miscela PDMS. A questo punto, utilizzare la punta di una pipetta per far cadere una piccola quantità di PDMS direttamente sulla struttura del wafer di silicio.

Posizionare immediatamente un vetrino coprioggetti 1 sulla goccia PDMS e prendere l'estremità superiore di una punta di pipetta pulita per premere delicatamente il vetrino coprioggetti sul wafer di silicone. Il PDMS dovrebbe diffondersi sottilmente tra il vetrino coprioggetti e il wafer di silicio. Metti il wafer con i vetrini coprioggetti in un forno e polimerizza il PDMS per tre o quattro ore, o durante la notte, a 75 gradi Celsius.

Quindi, togliete la cialda dal forno e lasciatela raffreddare a temperatura ambiente. Con una lama di rasoio, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti con il PDMS attaccato dal wafer di silicone. Ora, collegare una camera di plastica al PDMS come descritto in precedenza per il vetro.

Prendere i vetrini coprioggetti con la camera attaccata e metterli nel pulitore al plasma con l'ossigeno come gas di processo. Pulire i vetrini coprioggetti con il plasma. In questo lavoro è stata utilizzata una potenza del 30% e una pressione di ossigeno di 0,3 millibar per un minuto.

Ora, prepara un SLB nella camera come descritto prima sul vetro. Per eseguire il saggio di auto-organizzazione, regolare il volume del tampone nella camera a 200 microlitri di tampone Min, meno la quantità di proteina e la soluzione di ATP. Quindi aggiungere MinD, etichettato MinD, MinE e, se lo si desidera, MinC, e mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio.

Ora, aggiungi 2,5 millimolari di ATP per avviare l'auto-organizzazione di MinDE. Nei successivi 10-30 minuti, verificare la formazione regolare del pattern MinDE e le microstrutture formate correttamente su un microscopio a fluorescenza. Quando si sono formati i normali modelli MinDE, pipettare delicatamente su e giù due volte per miscelare i componenti.

Rimuovere la maggior parte del tampone utilizzando una pipetta da 100 microlitri, quindi rimuovere con cura il resto utilizzando una pipetta da 10 microlitri. Per consentire tempi di imaging più lunghi, inserire un pezzo di spugna inumidito all'interno della camera. Assicurarsi che la spugna non entri in contatto con la superficie del vetrino coprioggetti.

Chiudere immediatamente la camera con un coperchio per evitare l'essiccazione del tampone residuo nelle microstrutture. Prima dell'imaging delle microstrutture, confermare che l'auto-organizzazione di MinDE è bloccata sulla parte superiore della microstruttura PDMS mentre le proteine nelle microcavità oscillano. In questo video rappresentativo, l'imaging a due colori mostra come MinD e MinE si auto-organizzano in onde superficiali che si conformano a modelli a spirale su doppi strati lipidici supportati.

Qui, l'imaging a colori singoli mostra MinD e MinE che eseguono oscillazioni da polo a polo nelle microstrutture PDMS. Le oscillazioni stabiliscono un gradiente di concentrazione MinD mediato nel tempo con la massima concentrazione ai poli del compartimento e la concentrazione minima al centro del compartimento. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il tracciamento di singole particelle, al fine di determinare la cinetica di legame della membrana e i tempi di residenza.

Non dimenticare che lavorare con la soluzione piranha può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i dispositivi di protezione individuale.