Name: Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare lorigine della sindrome Myelodysplastic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Scopri il trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare la malignità in vivo nei modelli di sindrome mielodisplastica. Questa tecnica consente l'analisi funzionale delle cellule staminali tumorali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, National Institutes of Health (concedere numeri ZIA SC 010378 e BC 010983).

Le procedure animale descritte in questo articolo sono state approvate dal National Cancer Institute a Bethesda Animal Care e Comitato di uso e sono conformi alle politiche contenute all'interno, la politica di servizio di sanità pubblica su cura umanitaria e uso di animali da laboratorio, il Animal Welfare Act e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. cella preparazione
<ol><li>Raccolta del midollo osseo cellule nucleate (BMNC)<ol>
<li>Utilizzare solo materiali sterili. Sterilizzare gli strumenti riutilizzabili usando un autoclave a vapore. Acquisto di aghi, siringhe e oggetti in plastica in contenitori sterili monouso. Effettuare tutte le manipolazioni di cellulare e dell'animale in una classe II, tipo A2 sicurezza microbiologica.</li>
		<li>Preparare la BMNCs in un 14 mL contenente 3 mL di HF2 provetta a fondo sferico (Hank equilibrata soluzione salina completati con 2% di siero fetale bovino).</li>
		<li>Eutanasia C57Bl6 topi donatore (positivi per CD45 allele CD45.2), di età in genere 2-6 mesi, utilizzando una camera di CO2 .</li>
		<li>Sterilizzare la carcassa del mouse spruzzando etanolo al 70% su tutto il corpo con un flacone spray. La buccia dalle gambe, dal bacino fino alla caviglia.</li>
		<li>Rimuovere i femori e le tibie dalla carcassa utilizzando forbici sterili (dritto, punte acute, 11,5 cm) e forcipe (Graefe, seghettata, Larghezza punta 0,8 mm). Tagliare la relativa muscolatura chiaramente.</li>
		<li>Tagliare le estremità prossimale e distale della tibia con le forbici. Tenendo la tibia con il forcipe, inserire una siringa da 3 mL calibro 27 contenente 2,5 mL di HF2 nella cavità del midollo tibial all'estremità distale della tibia (caviglia). Lavare le cellule del midollo osseo dalla tibia con una leggera pressione in 14 mL provetta a fondo sferico.<ol>
<li>Ripetere per l'altra tibia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tagliare le estremità prossimale e distale del femore con le forbici. Svuotamento della cavità del midollo di femore inserendo un ago di calibro 20 collegato ad una siringa da 3 mL contenente 2,5 mL di HF2 nell'estremità distale della cavità del midollo di femore e applicando la pressione delicata alla siringa.<ol>
<li>Ripetere per altre femore, raccogliendo tutti i del midollo osseo da entrambe le tibie e femori nella stessa 14 mL fondo tubo tondo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Disperdere la massa di midollo aspirando su e giù più volte con lo stesso calibro 20 ago collegato alla siringa da 3 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Macchiatura dell'anticorpo di BMNC<ol>
<li>Conteggio BMNC. Aggiungere 20 µ l di una soluzione di acido acetico 3% a 20 µ l della sospensione BMNC generata nel passaggio 1.1.8. Poi, di contare con un emocitometro e un microscopio invertito.</li>
		<li>A pellet il BMNC mediante centrifugazione delicata a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con HF2 utilizzando 90 µ l per 107 celle e aggiungere 10 µ l di anticorpo anti-lignaggio biotinilato cocktail alla sospensione di cellule.</li>
		<li>Dopo incubazione per 20 min a 4 ° C, lavare le cellule marcate con 3 mL di tampone fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Risospendere il BMNC con 100 µ l di HF2 per 107 cellule. Aggiungere 2 µ l di allophycocyanin (APC) coniugato anti-biotina anticorpo per la sospensione di eritrociti, seguita da incubazione a 4 ° C per 20 min.</li>
		<li>Sciacquare il BMNC macchiato con 3 mL di PBS e risospendere il BMNC con HF2 completati con 0,2 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) per l'ordinamento delle cellule di flusso cytometry.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flusso cytometry ordinamento delle cellule di BMNC<ol>
<li>Calibrare il classificatore celle di flusso cytometry. Ottimizzare tutti i tubi di fotomoltiplicatore (PMT), scatter e parametri di fluorescenza usando le cellule non macchiate e impostare all'interno della gamma lineare di ogni rivelatore.</li>
		<li>Preparare non macchiate, PI-macchiato, e APC etichettato lignaggio cocktail celle in parallelo dal punto 1.2. Analizzare per compensazione spettrale.</li>
		<li>Discriminare le cellule doppietto di gating sequenziale di FSC-H vs SSC-H, 640-SSC-A vs 640-SSC-H e 640-SSC-S vs 640-SSC-W.</li>
		<li>Escludere le cellule non vitali utilizzando PI eccitato a 561 nm ed emissione raccolti con un filtro passa-banda 614/20. Eccitare il lignaggio APC etichettati cellule a 640 nm e raccogliere emissione con un filtro passa-banda 671/30.</li>
		<li>Registrare valori di fluorescenza come altezza di tensione e raccogliere almeno 100.000 eventi nei file di dati di modalità elenco per visualizzare le popolazioni di essere ordinati.</li>
		<li>Calcolare la compensazione spettrale dopo l'acquisizione di tre campioni di 10.000 cellule per i seguenti: senza etichetta celle, PI etichettati cellule e cocktail di anti-lignaggio anticorpo coniugato con etichettati cellule APC.</li>
		<li>Impostare tre regioni per ordinare lignaggio negativo (LN), lignaggio positiva (LP) con l'intensità di fluorescenza dim (LP1) e la popolazione di LP con fluorescenza brillante (LP2) in provette da 5 mL contenente 0,5 mL di media di 10% FBS.</li>
		<li>Celle di ordinamento utilizzando un'una goccia avvolgono e purificano la modalità di interruzione.</li>
		<li>Eseguire analisi di tipo post con 1.000 cellule totali su ogni campione ordinato per confermare la purezza e la vitalità delle cellule ordinate.</li>
		<li>Raccogliere le cellule ordinate mediante centrifugazione a 450 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare con 0,5 mL di HF2.</li>
		<li>Confermare ordinato cella numero con emocitometro e tripan blu. Regolare il numero di cellulare con HF2 per trapianto. Nota: Un ampio spettro di popolazioni BMNC può essere isolato per trapianto utilizzando ulteriori combinazioni degli anticorpi coniugati fluorocromo passo 1.2.2 sopra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. destinatario topi preparazione e trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT)
<ol><li>Preparazione dei destinatari del trapianto<ol>
<li>Mantenere la veterinaria e allevamento cura dei topi Congenici destinatario (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in una struttura animale patogeni specifici (SPF) di libero.</li>
		<li>Per la decontaminazione profilattica della pista gastrointestinale, fornire acqua sterile contenente 100 mg/L di ciprofloxacina ai destinatari per 7 giorni prima dell'irradiazione della dose letale (9 Gy) e mantenere per 14 giorni dopo l'irradiazione.</li>
		<li>Fornire un'irradiazione di dose letale (9 Gy) da una fonte Cs come segue. Utilizzare un operatore addestrato, certificato di Cs. Impostare lo strumento di origine Cs a consegnare irradiazione gamma di 70 cGy/min totale del corpo. Posto 10 topi in un supporto personalizzati e inserire il supporto della camera di irradiatore. Consegnare l'irradiazione dal corpo intero di 9 Gy in 13 min e restituire i topi nelle loro gabbie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trapianto di cellule staminali ematopoietiche<ol>
<li>Mescolare wild type (WT) BMNC da un mouse di destinatario Congenici (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) ad una dose di cella di 2 x 105 celle per mouse con 2-5 x 104 cellule del test purificato che BMNC preparato con flusso cytometry ordinamento come descritto in 1.3 di cui sopra. Mescolare le cellule nella stessa siringa. Nota: Il BMNC WT forniscono un effetto con parsimonia di radiazione al destinatario mouse e consentono la sopravvivenza del mouse destinatario se le celle di prova non supportano l'ematopoiesi. Il WT BMNC utilizzato in questo tipo di esperimento espressa l'allele CD45.1 e così può essere distinto dalle cellule test usando gli anticorpi che discriminano tra CD45.1 e CD45.2. Le cellule WT BM si riferiscono a come "cellule helper", "cellule di radiazione-sparing" o "cellule concorrente".</li>
		<li>Regolare il volume di miscela delle cellule a 200 µ l per destinatario utilizzando HF2 sterile per facilitare l'iniezione.</li>
		<li>Le miscele di cella per i topi irradiati letalmente di destinatario via endovenosa vena iniezione coda utilizzando una siringa da 1 mL e un ago 28 calibri, entro 24 h di irradiazione del trapianto. Posizionare la coda di topo sotto una lampada di calore, come calore conduce alla dilatazione della vena della coda. Nota: Tutti i topi destinatari alla fine dello studio di eutanasia e valutare la progressione di malattia di autopsia, l'istologia e citometria a flusso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. engraftment analisi mediante citometria a flusso
<ol><li>Per valutare engraftment delle cellule dei donatori, raccogliere sangue periferico (PB) dai topi destinatari alla 6a settimana, settimana 12 e 16 ° settimana dopo il trapianto.</li>
	<li>Scaldare i destinatari nella gabbia con lampada di calore per circa 1 min e posizionare il mouse in un dispositivo di ritenuta.</li>
	<li>Tagliare la vena della coda con un bisturi (lama 10, manico per bisturi #3) e raccogliere 100 µ l di PB per ogni destinatario utilizzando un tubo di microcapillary contenenti EDTA come anticoagulante.</li>
	<li>Dividere il PB raccolto in due aliquote uguali inserendo 50 µ l in una microcentrifuga sterile. Utilizzare un'aliquota per un conteggio di anima completa (CBC) automatizzato (eseguita presso il Core di istopatologia NCI) e utilizzare la seconda aliquota per la macchiatura dell'anticorpo e citometria a flusso.</li>
	<li>Per rilevare il engraftment erogatore da citometria a flusso, lisare i globuli rossi (RBC) aggiungendo 1 mL di tampone di Lisi ipotonica RBC (8,29 g/L di NH4Cl, 1 g/L di KHCO3, 0,037 g/L di Na2EDTA, pH 7,2) a 50 µ l del PB raccolti. Vortexare il campione di miscelare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare il lisato PB a 4.600 x g per 1,5 min attentamente aspirare il supernatante e scartare.</li>
	<li>Parzialmente di disturbare il pellet cellulare delicatamente toccando o "sfogliando" il fondo della provetta. Aggiungere 1,3 mL di PBS nel pellet si trova in provetta e centrifugare a 4.600 x g per un minimo di 1,5 accuratamente aspirato e scartare il surnatante.</li>
	<li>Disturbare il pellet cellulare toccando o sfogliando e aggiungere 200 µ l di HF2 completati con 5% di siero del ratto per il pellet cellulare.</li>
	<li>Aggiungere anticorpo anti-CD45.2 (1 µ l) coniugato con allophycocyanin (APC) per la sospensione delle cellule. Incubare a 4 ° C per almeno 30 min e brevemente vortice la miscela.</li>
	<li>Dopo la colorazione, lavare le cellule due volte come sopra descritto e risospendere con 400 µ l di HF2 completati con 1 µ g/mL di PI.</li>
	<li>Rilevare l'attecchimento utilizzando un citometro a flusso di 4 colori. Ottenere ulteriori informazioni sui tipi di cellulari all'interno del sangue periferico mediante l'aggiunta di altri anticorpi per rilevare tipi cellulari specifici, quali linfociti B o T.</li>
	<li>Registrare dati di attecchimento seriale utilizzando un foglio di calcolo per consentire un'ulteriore analisi dei dati.</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
<li>Heaney, M. L., Golde, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10341278">Myelodysplasia.</a> The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18467609">Myelodysplastic syndromes.</a> Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).</li>
<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
<li>Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98+gene+fusions+and+hematopoietic+malignancies%3A+common+themes+and+new+biologic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights.</a> Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXD13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. <a target="_blank" href="https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/286455">Preleukemic acute human leukemia.</a> Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).</li>
<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla di divulgare.

Anche se MDS sono un disordine clonale di cellule staminali ematopoietiche, il MDS "gambo", o cellule di origine, non sono ancora state caratterizzate. Precedentemente abbiamo dimostrato che MDS possono essere transplantable ai topi WT usando il midollo osseo dai topi NHD13 di HSCT, caratterizzata da anemia macrocitica, leucopenia, neutropenia e prova morfologica della displasia15. Inoltre, analisi competitiva ripopolamento identificato un vantaggio di crescita delle cellule dal midollo osseo NHD1...

Le sindromi mielodisplastiche (MDS) rappresentano un gruppo eterogeneo di disordini clonali sangue caratterizzati da ematopoiesi inefficace, prova morfologica della displasia e una propensione per la trasformazione in leucemia mieloide acuta (AML)1,2 ,3,4. Ematopoiesi inefficace è riconosciuto come un arresto di maturazione nel midollo osseo e risultati nel sangue periferico citopenie nonostante un1,di midollo osseo ipercellulare3. L'incidenza di MDS è stato variamente stimato di 2-12 casi ogni 100.000 persone ogni anno negli Stati Uniti, e l'incidenza di MDS aumenta con l'età, rendendo questo una condizione importante per capire dato l'invecchiamento US popolazione3, 5. Anche se la maggior parte dei casi di MDS non hanno nessuna eziologia libera, alcuni casi di MDS sono probabilmente dovuto l'esposizione agli agenti genotossici noti, inclusi i solventi come benzene e cancro chemioterapia6.
Pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno in genere acquisito mutazioni in cellule MDS7. Anche se relativamente raro, un numero di pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno acquisito le traslocazioni cromosomiche bilanciate che coinvolgono geni quali NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Il nostro laboratorio ha un interesse profondo traslocazioni cromosomiche, che coinvolgono il gene NUP988. Topi transgenici che esprimono un transgene NUP98-HOXD13 (NHD13) regolato dal promotore Vav1 e gli elementi enhancer di visualizzare tutte le caratteristiche chiave di MDS, compreso il sangue periferico citopenie, prova morfologica della displasia e la trasformazione di AML9 .
Sebbene MDS sono stati riconosciuti per oltre 60 anni10e sono considerati come un disordine clonale della cellula formativa, gli sforzi per attecchire cellula umana di MDS in topi immunodeficienti sono stati in gran parte infruttuosi, perché le cellule MDS integrano scarsamente11, 12,13,14 e i topi non sviluppano la malattia clinica. Nel tentativo di identificare quali cellule ematopoietiche possono trasmettere MDS, abbiamo girato per il modello di NHD13 e ha mostrato che noi potremmo interdigitate MDS come un'entità di malattia che ha mostrato tutti i segni cardinali di MDS umana, tra cui sangue periferico citopenie, displasia, e trasformazione da AML15. In questo rapporto, presentiamo i dettagli tecnici di questi esperimenti, nonché approcci ulteriormente frazionare ematopoietiche staminali e cellule del precursore (HSPC), nel tentativo di identificare cellule d'inizio di MDS.

<table><tbody><tr><td>Provetta a fondo tondo da 14 mL</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank</td><td>Anticorpo Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>Siringa da 3 mL</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 27 G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 20 G</td><td>BD</td><td></td><td></td>305176</tr><tr><td>Lineage Cocktail</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>Anticorpi anti-biotina</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>Siringa da insulina</td></tr><tr><td>Lampada riscaldante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>macchina FACS</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2 laser, 5 rivelatori di colore Strumento</td></tr><tr><td>di selezione FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5 laser, 23 parametri, 6 smistamento simultaneo</td></tr><tr><td>della popolazione Ioduro di propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Irradiator</td><td>Best Theratronics</td><td>Gammacell 40</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per prelievo del sangue</td><td>RAM scientific</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>Ricevente topi</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 topi</td><td>n/a C57Bl</td><td>/6, CD45.2</td><td>Colonia mantenuta presso NIH</td></tr><tr><td>5 mL tubo a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome myelodysplastic

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Sindromi mielodisplastiche (SMD) sono un gruppo eterogeneo di disordini di cellule staminali ematopoietiche che sono definiti da ematopoiesi inefficace, sangue periferico citopenie, displasia e una propensione per la trasformazione in leucemia acuta. Topi transgenici NUP98-HOXD13 (NHD13) ricapitolano MDS umano in termini di sangue periferico citopenie, displasia e trasformazione in leucemia acuta. Precedentemente abbiamo dimostrato che MDS può essere trasferito da un topo geneticamente ingegnerizzato con MDS ai destinatari di selvaggio-tipo di trapianto di cellule di midollo osseo nucleata MDS (BMNC). Più chiaramente capire la cella MDS di origine, abbiamo sviluppato approcci di trapiantare specifici, immunophenotypically definito sottoinsiemi ematopoietici. In questo articolo, descriviamo il processo di isolamento e di trapianto di specifiche popolazioni di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici. A seguito di trapianto, descriviamo gli approcci per valutare l'efficacia del trapianto e la persistenza delle cellule MDS del donatore.

Vi mostriamo le figure rappresentative per risultati di molti esperimenti. La figura 1 Mostra un rappresentante flusso cytometry ordinamento esperimento. Durante il differenziamento ematopoietico normale, come le cellule diventano impegna un specifico lineage ematopoietico, acquisiscono lignaggio-definizione di indicatori di superficie delle cellule e perdere il potenziale di auto-rinnovamento. Pertanto, in topi wild-type, autorinnovamento delle cellule stami...

Descriviamo l'uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) per valutare il potenziale maligno delle cellule emopoietiche geneticamente. HSCT è utile per valutare varie cellule ematopoietiche maligne in vivo , nonché generando un'ampia coorte di topi con sindromi mielodisplastiche (MDS) o leucemia per valutare nuove terapie.

Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande nel campo del metodo di malignità sulla caratterizzazione di una cellula che inizia una malignità. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una base per l'analisi funzionale di queste cellule staminali tumorali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono dove la terapia delle sindromi mielodisplastiche o MDS, in quanto può aiutare nell'identificazione delle cellule che iniziano la malattia.Per preparare i destinatari al trasferimento adottivo, una settimana prima del trapianto fornire acqua sterile integrata con 100 milligrammi per litro di ciprofloxacina agli ANIMALI riceventi congeni per sette giorni in una struttura animale specifica e priva di agenti patogeni. Il settimo giorno, un operatore qualificato e certificato di cesio 17 ha impostato lo strumento sorgente di cesio per fornire 70 centigrays di irradiazione gamma corporea totale al minuto. Posizionare 10 topi in un supporto progettato su misura.Inserire il supporto nella camera dell'irradiatore, fornire 9 grigi di irradiazione totale del corpo in 13 minuti. Quindi riportare gli animali nelle loro gabbie. La mattina dopo, spruzzare il 70% di etanolo su un intero topo C57 nero da due a sei falena e usare le forbici per rimuovere la pelle dal bacino alle caviglie.Usa le flessidi con le forbici per rimuovere la femora e le tibiae. Tagliare in modo pulito i muscoli dalle ossa. Tagliare le estremità prossimali e distali per le tibiae e raccogliere una tibia con le forcep.Inserire una siringa da tre millilitri dotata di un ago da 27 gage nella cavità del midollo osseo e sciacquare il midollo osseo in un tubo inferiore rotondo da 14 millilitri contenente 2,5 millilitri di soluzione salina tamponata Hanks integrata con siero bovino fetale al 2% o HF2. Quando tutto il midollo è stato raccolto, aspirare il tessuto più volte attraverso la punta dell'ago da 20 gage per disperdere la massa del midollo in un'unica sospensione per il conteggio. Per etichettare le cellule nucleate del midollo osseo, o BMNC, per lo smistamento del flusso, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere il pellet a una volta per dieci al settimo BMNC per 90 microlitri di concentrazione di HF2.Successivamente, aggiungere dieci microlitri di un cocktail anticorpale biotinilato e anti-lignaggio alla sospensione cellulare per un'incubazione di 20 minuti a 4 gradi Celsius. Seguito da un lavaggio centrifuga in tre millilitri di PBS. Sospendere di nuovo il pellet in 100 microlitri di HF2 per una per dieci fino alla settima cellule.Etichettare secondariamente le cellule con due microlitri di anticorpo anti biotina coniugato APC. Dopo 20 minuetti a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce, lavare le cellule in tre millilitri di PBS fresco. Sospendere nuovamente il pellet in HF2 integrato con 0,2 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio sul ghiaccio.Ora calibrate lo smistatore di celle di citometria a flusso utilizzando celle non macchiate per ottimizzare tutti i parametri di tubi fotomoltiplicatori, dispersione e fluorescenza all'interno dell'intervallo lineare di ogni rivelatore. Acquisire tre campioni di 10.000 celle per le celle etichettate APC senza etichetta, PI etichettate e anti-lignaggio. Alla fine dell'ordinamento, analizzare 1.000 celle da ogni campione per confermare la purezza e la vitalità delle celle ordinate.Spin giù i campioni nella centrifuga. Quindi sospendere di nuovo i pellet in 0,5 millilitri di HF2 per il conteggio. Per il trasferimento adottivo delle cellule selezionate, mescolare 100 microlitri di due volte il BMNC di tipo selvatico da un animale ricevente congene in HF2 sterile.Con 100 microlitri da due a cinque per dieci al quarto il donatore smistato BMNC di interesse per l'HF2 sterile in un tubo di micro centrifuga per animale ricevente. Caricare una siringa millilitro, dotata di un misuratore da 28 gage per ricevente con 200 microlitri di cellule. Quindi, posizionare i topi ricevente sotto una lampada termica per indurre la dilatazione della vena della coda.Consegnare le miscele cellulari a ciascun animale ricevente irradiato letale attraverso la vena della coda. Poiché l'autorinnovimento delle cellule staminali è limitato al lignaggio negativo BMNC di tipo selvatico, il lignaggio negativo, il basso lignaggio positivo e le cellule positive ad alta discendenza vengono ordinate e trapiantate in destinatari di tipo selvaggio per determinare la capacità di autori ricambio di ogni popolazione cellulare. Il BMNC trans genetico donatore trapiantato adottivamente da animali modello MDS può essere distinto ex vivo per la loro espressione marcatore di superficie cellulare CD45.2.Entro 16 settimane dal trapianto di BNMC negativo di lignaggio, o BMNC non di assortimento da animali donatori di MDS transgenici, le cellule transgeniche fuori competono con le cellule di tipo selvatico come evidenziato da una percentuale crescente di cellule donatrici positive CD45.2, osservate nel sangue periferico degli animali riceventi irradiati letale. Qui vengono mostrate cellule da una trasformazione leucemica da un topo trapiantato con cellule MDS transgeniche. Si noti la presenza di numerose esplosioni e forme immature.Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare di limitare il tempo di manipolazione ex vivo, in quanto può posizionare stress indebito sulle cellule, con conseguente morte cellulare o perdita funzionale. Dopo lo sviluppo questa tecnica apre la strada ai ricercatori del programma sul campo, per mettere in malignità per esplorare la fonte della malattia nei topi geneticamente modificati.

use-hematopoietic-stem-cell-transplantation-to-assess-origin

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Questo protocollo fornisce linee guida passo dopo passo per l'impostazione di esperimenti competitivi di trapianto di midollo osseo di topo per studiare la funzione delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche senza previa purificazione delle cellule staminali mediante selezione cellulare.

Trapianti competitivi per valutare staminali ematopoietiche cellule Fitness

È necessaria per monitorare attecchimento dopo trapianto di cellule staminali in pazienti con emoglobinopatie quantificazione delle cellule derivate dal donatore. Una combinazione di flusso cytometry-base cella ordinamento, analisi di formazione della Colonia e successiva analisi del tandem brevi ripetizioni possono essere utilizzati per valutare la proliferazione e il differenziamento dei progenitori nel vano degli eritrociti.

Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

La diagnosi MDS è difficile in assenza di criteri morfologici o citogenetica non informativo. MFC potrebbe contribuire ad affinare il processo diagnostico MDS. Per diventare utile per la pratica clinica, l'analisi MFC deve basarsi su parametri con sufficiente sensibilità e specificità, e i dati devono essere riproducibili tra operatori diversi.

Citometria di flusso di database-Guida per la valutazione della maturazione delle cellule mieloidi del midollo osseo

Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'isolamento e la colorazione delle cellule del midollo osseo murino al fenotipo delle cellule staminali emopoietiche e progenitrici insieme alle cellule staminali endoteliali e mesenchimali di nicchia di supporto. È incluso anche un metodo per arricchire le cellule situate nelle aree endostali e centrali del midollo osseo.

Analisi citometrica a flusso di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche del midollo osseo murino e cellule di nicchia stromale

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Le iniezioni intrafemorali consentono l'attecchimento di un piccolo numero di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), posizionando le cellule direttamente nella cavità del midollo osseo. Qui descriviamo un protocollo sperimentale di iniezione intrafemorale di HSPC umane in topi immunodeficienti.

Iniezione intrafemorale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane in topi immunocompromessi 

Scopri il trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare la malignità in vivo nei modelli di sindrome mielodisplastica. Questa tecnica consente l'analisi funzionale delle cellule staminali tumorali.

Uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche per valutare l'origine della sindrome Myelodysplastic

Esplora altri video