Name: Luminophore formazione in varie conformazioni di albumina di siero bovino di legame delloro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Scopri la formazione di fluorofori rossi nel complesso BSA-Au(III) studiando i siti di legame specifici e le modifiche conformazionali dipendenti dal pH. Questo metodo permette di analizzare le interazioni proteina-metallo in biochimica inorganica.

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1. sintesi del complesso BSA-Au(III)
<ol><li>Sciogliere 25 mg di BSA in 1 mL di acqua di grado di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) in un flaconcino di reazione da 5 mL. Nota: La soluzione dovrebbe apparire chiara.</li>
	<li>Sciogliere triidrato di oro (III) cloruro (acido cloroaurico) ad una concentrazione di 5 millimetri di acqua di grado HPLC. Nota: La soluzione appare gialla. Soluzione di acido cloroaurico preparata a questa concentrazione si tradurrà in una BSA al rapporto tra Au 01:13.<ol>
<li>In alternativa, preparare una soluzione di acido cloroaurico con una concentrazione di ovunque tra 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) fino a 20 mM (BSA:Au = 01:50) in HPLC del grado dell'acqua. Nota: Diversi rapporti di BSA all'oro si tradurrà in modelli drasticamente diversa fluorescenza rossa della mappa eccitazione-emissione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collocare il flaconcino di reazione di BSA in bagnomaria a 37 ° C e mescolare vigorosamente a 750 giri/min con un agitatore magnetico.</li>
	<li>Subito dopo inizia l'agitazione, aggiungere 1 mL di acido cloroaurico alla soluzione. Il colore della soluzione dovrebbe trasformare da incolore a giallo.</li>
	<li>Mescolare il composto per 2 min a 37 ° C e a 750 giri/min con un agitatore magnetico.</li>
	<li>Nella fiala di reazione, aggiungere 100 μL di 1 M NaOH alla soluzione per portare il pH a 12. Nota: Immediatamente dopo l'aggiunta di NaOH, la soluzione dovrebbe scurire leggermente al giallo-marrone e poi tornare indietro al giallo.</li>
	<li>Continuare a mescolare a 750 giri/min per 2 h e a 37 ° C. La soluzione dovrebbe cambiare lentamente dal giallo ad un colore giallo/marrone scuro. Questo cambiamento di colore indica la formazione del rosso fluorescenti BSA-Au(III) complesso.</li>
	<li>Lasciare riposare a temperatura ambiente per 2 giorni, il campione e la soluzione continuerà a scurire ad un marrone ambrato e aumenterà l'intensità di fluorescenza.<ol>
<li>In alternativa, lasciare il campione continuare a mescolare a 37 ° C per 12 h più come il colore della soluzione si evolve ad un'ambra marrone.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sintesi di BSA-Cu(II)-Au(III)
<ol><li>Sciogliere 25 mg di BSA in 1 mL di acqua di grado HPLC. La soluzione dovrebbe apparire chiara.</li>
	<li>Sciogliere il rame (II) cloruro diidrato in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM. La soluzione dovrebbe apparire la luce blu.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione acquosa di BSA per un flaconcino di reazione da 5 mL e posto in un bagno di acqua a 37 ° C. Mescolare il composto a 750 giri/min.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 0,5 mL della soluzione di rame (II) cloruro diidrato nel flaconcino di reazione e mescolare per 2 min. La soluzione rimarrà luce blu.</li>
	<li>Aggiungere 75 µ l di 1 M NaOH per portare il pH a 12 e lasciar per mescolare per 2 h. La soluzione diventerà viola.</li>
	<li>Sciogliere l'acido cloroaurico in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di acido cloroaurico acquosa nel flaconcino di reazione e regolare il pH torna a 12 utilizzando 1 M NaOH.</li>
	<li>Mescolare la miscela di reazione per 2 h. Nota: La soluzione dovrebbe evolvere in un color marrone.</li>
</ol>3. sintesi di BSA-Ni(II)-Au(III)
<ol><li>Sciogliere 25 mg di BSA in 1 mL di acqua di grado HPLC. La soluzione dovrebbe apparire chiara.</li>
	<li>Sciogliere il nichel (II) cloruro esaidrato in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM. La soluzione dovrebbe apparire la luce verde.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di soluzione acquosa di BSA per un flaconcino di reazione da 5 mL e porre in un bagno di acqua a 37 oC. mescolare la miscela a 750 giri/min.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 0,5 mL della soluzione di nichel (II) cloruro esaidrato flaconcino di reazione e mescolare per 2 min. Nota: La soluzione rimarrà luce verde.</li>
	<li>Aggiungere 75 µ l di 1 M NaOH per portare il pH a 12 e lasciar per mescolare per 2 h. Nota: La soluzione diventa giallo scuro.</li>
	<li>Sciogliere l'acido cloroaurico in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 5 mM.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di acido cloroaurico acquosa nel flaconcino di reazione e regolare il pH torna a 12.</li>
	<li>Mescolare la miscela di reazione per 2 h. Nota: La soluzione dovrebbe evolvere in un color marrone.</li>
</ol>4. sintesi di [Cys34-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>Sciogliere 2 mg di N-ethylmaleimide (NEM) in 1 mL di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4).</li>
	<li>Sciogliere 2 mg di BSA in 1 mL di soluzione di PBS-NEM.</li>
	<li>Trasferire la soluzione in un flaconcino di reazione da 5 mL e mescolare a 20 ° C a 500 giri/min per 1 h.</li>
	<li>Dializzare la soluzione utilizzando 12 tubi di dialisi di kDa in 500 mL di PBS, agitazione a 50 giri/min con un agitatore magnetico durante la notte per rimuovere NEM non reagito.</li>
	<li>Sciogliere l'acido cloroaurico in PBS per una concentrazione di 0,4 mM. Nota: La soluzione sarà un giallo tenue.</li>
	<li>Trasferire il flaconcino di reazione a un bagno di acqua a 37 ° C. Mescolare a 750 giri/min.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 1 mL di soluzione di acido cloroaurico nel flaconcino di reazione e lasciar per mescolare per 2 min.</li>
	<li>Aggiungere 75 μL di 1 M NaOH al flaconcino di reazione per portare il pH a 12 e lasciar per mescolare per 2 h.</li>
</ol>5. sintesi di [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)
<ol><li>Preparare una soluzione 2 M urea e 50mm di bicarbonato di ammonio (NH4HCO3, pH 8.0) in acqua di grado HPLC.</li>
	<li>Sciogliere 3,3 mg di BSA in 1 mL della soluzione precedente e trasferimento di un flaconcino di reazione da 5 mL.</li>
	<li>Fare una soluzione stock di 0,25 M tris(2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) sciogliendo 62,5 mg di TCEP in 1 mL di acqua per HPLC.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione madre di TCEP nel flaconcino di reazione fino a quando la concentrazione finale di TCEP è di 8 mM.</li>
	<li>Incubare la soluzione in un bagno di acqua per 1 h a 50 ° C. Mescolare a 500 giri/min con un agitatore magnetico.</li>
	<li>Lasciare la soluzione completamente raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 100 mM NEM sciogliendo 12,5 mg di NEM in 1 mL di acqua di grado HPLC.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione madre di NEM nel flaconcino di reazione fino a quando la concentrazione finale di NEM è di 16 mM.</li>
	<li>Lasciare agire la soluzione combinare per 2 h a 20 ° C. Mescolare a 500 giri/min.</li>
	<li>Dializzare la soluzione utilizzando un tubo di dialisi di 12 kDa, mescolando la soluzione a 50 giri/min con un agitatore magnetico pernottamento in 500 mL di 50mm NH4HCO3 per rimuovere l'eccesso TCEP, NEM e urea.</li>
	<li>Spostare il flaconcino di reazione in un bagno di acqua a 37 ° C e mescolare a 750 giri/min.</li>
	<li>Sciogliere l'acido cloroaurico in acqua di grado HPLC a una concentrazione di 0,66 mM.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 1 mL di soluzione di acido cloroaurico nel flaconcino di reazione e lasciar per mescolare per 2 min.</li>
	<li>Aggiungere 1 M NaOH fino a quando il pH della soluzione è 12 e lasciare che la soluzione di continuare a mescolare per 2 h.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

I composti di BSA-Au(III) preparati a pH 12 presentano fluorescenza rossa ad una lunghezza d'onda di emissione di λem= 640 nm quando eccitato con raggi ultravioletti (UV) luce λex= 365 nm (Figura 1A). L'emergere di fluorescenza rossa è un processo lento e avrà un paio di giorni a temperatura ambiente per aumentare a un'intensità massima. In esecuzione della reazione a 37 ° C produrrà i risultati ottimali, anche se alta temperatura può essere utilizzato per prod...

Un composto di BSA-Au esibendo un ultravioletto (UV)-eccitabile fluorescenza rossa, con notevole spostamento di stokes, è stato originariamente sintetizzato da Xie et al. 1. la fluorescenza rossa univoco e stabile può trovare varie applicazioni in campi quali rilevamento2,3,4,5,6,7o imaging nanomedicina8 ,9,10,11,12,13. Questo composto è stato studiato estesamente da molti ricercatori nel campo delle nano-scienze in ultimi anni14,15,16. Il composto di BSA-Au è stato interpretato come Au25 nanocluster. L'obiettivo del metodo presentato è per esaminare questo composto in dettaglio e per capire l'origine della fluorescenza rossa. Seguendo l'approccio presentato, la presenza di più siti di legame di Au e l'origine della fluorescenza, alternativa per la nucleazione di singolo sito di nanocluster di Au25 , possono essere illustrate. Lo stesso approccio può essere impiegato per studiare come altre proteine17,18,19 complessato con Au(III) può cambiare le loro proprietà intrinseche, fluorescente.
La sintesi del composto rosso fluorescente BSA-Au richiede un controllo stretto dei rapporti molari di BSA per Au (BSA:Au) per massimizzare l'intensità della fluorescenza e la posizione dei picchi a eccitazione-emissione mappa (EEM)20. Si può dimostrare che più siti di legame esistano per Au(III) per l'associazione, tra cui il frammento di asparagina (o frammento di Asp, i primi quattro residui dell'amminoacido al N-terminale di BSA)21,22. Dell'aminoacidoth 34 di BSA (Cys-34) è inoltre indicato per coordinare Au(III) e di essere coinvolti nel meccanismo del rosso fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20. Su tutti i ponti disolfuro Cys Cys di sfaldatura e tappatura tutti fluorescenza di tioli, rosso non è prodotta ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Questo indica la necessità di legami disolfuro Cys Cys come il sito di legame di Au(III) per produrre la fluorescenza rossa.
Tecniche di chimica della proteina non sono stati ampiamente utilizzati per studiare i complessi di BSA-Au(III) della comunità di nano-scienza. Tuttavia, sarebbe prezioso per impiegare queste tecniche per capire alcuni aspetti di questi complessi, nonché di acquisire una comprensione dettagliata delle sedi del legame di Au(III) in BSA. Questo articolo è destinato a mostrare alcune di queste tecniche.

<table><tbody><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA), 96%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>cloruro d'oro (III) triidrato, 99,9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di rame (II) diidrato, 99,999%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459097</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di nichel (II) esaidrato, 99,9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>654507</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimmide (NEM), >99,0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP), >98,0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, >98,0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Urea, 99,5%</td><td>Chem-Implex Int'l</td><td>30142</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio, 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr></tbody></table>

luminophore formazione in varie conformazioni di albumina di siero bovino di legame dell'oro

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

Lo scopo dei protocolli presentati è quello di studiare il processo di associazione Au(III) a BSA, cedendo la fluorescenza rossa indotta da cambiamento di conformazione (λem = 640 nm) dei complessi BSA-Au(III). Il metodo consente di regolare il pH per mostrare che l'emersione della fluorescenza rossa è correlato con le transizioni di equilibrio pH-indotta delle conformazioni BSA. Rosso fluorescente BSA-Au(III) complessi possono essere formati solo con un adeguamento del pH pari o superiore a 9.7, che corrisponde alla conformazione "A-form" di BSA. Il protocollo per regolare la BSA al rapporto molare Au e per monitorare il corso di tempo del processo di associazione Au(III) è descritto. Il numero minimo di Au(III) a BSA, per produrre la fluorescenza rossa, è meno di sette. Descriviamo il protocollo nei passaggi per illustrare la presenza di più siti di legame di Au(III) in BSA. Prima, con l'aggiunta di rame (Cu(II)) o nichel (cationi Ni(II)) seguiti da Au(III), questo metodo si rivela un sito di legame per Au(III) che non è il fluoroforo rosso. In secondo luogo, modificando tiolo tappatura agenti BSA, viene rivelato un altro sito di legame di Au(III) nonfluorophore-formanti. In terzo luogo, i dominî di BSA di sfaldatura e tappatura dei legami disolfuro, sono illustrati i possibili siti di associazione Au(III). Il protocollo descritto, per controllare le conformazioni di BSA e l'associazione Au(III), può essere generalmente applicato per studiare le interazioni di altre proteine e cationi metallici.

Dalla fluorescenza del complesso BSA-Au(III), è stato osservato che la conversione della fluorescenza intrinseca blu di BSA (λem = 400 nm) a fluorescenza rossa (λem = 640 nm) si verifica a circa pH 9.7 attraverso un equilibrio transizione (Figura 1). EEM di BSA-Au(III) alle diversa BSA a rapporti molari Au è illustrato nella Figura 2, e questi dati mostrano come alterare i rapporti molari p...

I protocolli per studiare l'associazione di oro cationi (Au(III)) a varie conformazioni di albumina di siero bovino (BSA) come pure per caratterizzare la fluorescenza di BSA-Au unica dipendente conformazionale sono presentati.

Luminophore formazione in varie conformazioni di albumina di siero bovino di legame dell'oro

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle nanoscienze, come la formazione di fluorofori e complessi proteici medi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aiuta a illustrare specifici siti di legame dei metalli e proteine. Innanzitutto, sciogliere 25 milligrammi di BSA in un millilitro di acqua HPLC in una fiala di reazione da cinque millilitri contenente un'ancoretta magnetica.Quindi, preparare una soluzione di cinque millimolari di acido cloroaurico e acqua di grado HPLC. Mettere la fiala di reazione contenente la soluzione di BSA in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e mescolare a 750 giri/min utilizzando un agitatore magnetico. Subito dopo l'inizio dell'agitazione, aggiungere un millilitro della soluzione di acido cloroaurico alla soluzione di BSA.Dopo aver mescolato per due minuti, aggiungere 100 microlitri di idrossido di sodio molare alla soluzione per portare il PH a 12. Sciogliere 25 milligrammi di BSA in un millilitro di acqua di grado HPLC in un flaconcino di reazione. Successivamente, preparare una soluzione di cinque millimolari di cloruro di rame diidrato in acqua di grado HPLC.Aggiungere un millilitro della soluzione di BSA a una fiala di reazione da cinque millilitri contenente un'ancoretta magnetica e metterla a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Mescolare la soluzione a 750 giri/min. Aggiungere immediatamente 0,5 millilitri della soluzione di cloruro di rame diidrato alla fiala di reazione.Dopo aver mescolato per due minuti, aggiungere 75 microlitri di idrossido di sodio molare alla soluzione per portare il PH a 12 e mescolare per due ore. Successivamente, preparare una soluzione di cinque millimolari di acido cloroaurico in acqua di grado HPLC. Aggiungere 0,5 millilitri della soluzione di acido cloroaurico alla fiala di reazione.Quindi, regolare il PH a 12 utilizzando un idrossido di sodio molare e mescolare la soluzione per due ore. Aggiungere un millilitro di soluzione di BSA a una fiala di reazione da cinque millilitri contenente un'ancoretta magnetica e metterla a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Mescolare la soluzione a 750 giri/min.Aggiungere immediatamente 0,5 millilitri di una soluzione di cloruro di nichel esaidrato da cinque millimolari precedentemente preparata al flaconcino di reazione. Dopo aver mescolato per due minuti, aggiungere 75 microlitri di idrossido di sodio molare per portare il PH a 12 e mescolare per due ore. Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di acido cloroaurico da cinque millimolari alla fiala di reazione.Quindi, regolare il PH a 12 utilizzando un idrossido di sodio molare e mescolare la miscela di reazione per due ore. Sciogliere due milligrammi di N-etilmaleimmide in un millilitro di PBS. Quindi, sciogliere due milligrammi di BSA in un millilitro della soluzione di maleimmide.Trasferire la soluzione in una fiala di reazione da cinque millilitri contenente un'ancoretta magnetica e agitare a 20 gradi Celsius e 500 giri/min per un'ora. Dopo un'ora, dializzare la soluzione utilizzando un tubo per dialisi da 12 kilodalton in 500 millilitri di PBS. Agitazione a 50 giri/min con un agitatore magnetico durante la notte per rimuovere l'etilmaleimmide non reagita.Il giorno seguente, trasferire la fiala di reazione contenente la soluzione di maleimmide in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e agitare a 750 giri/min. Immediatamente, aggiungere una soluzione di acido cloroaurico 0,4 millimolare precedentemente preparata al flaconcino di reazione. Dopo aver mescolato per due minuti, aggiungere 75 microlitri di idrossido di sodio molare alla soluzione per portare il PH a 12 e mescolare per due ore.Preparare una soluzione di urea a due molari e bicarbonato di ammonio 50 millimolare in acqua di grado HPLC. Quindi, sciogliere 3,3 milligrammi di BSA in un millilitro di soluzione di urea e trasferirli in una fiala di reazione da cinque millilitri contenente un'ancoretta magnetica. Successivamente, preparare una soluzione madre di TCEP 0,25 molari sciogliendo 62,5 milligrammi di TCEP e un millilitro di acqua di grado HPLC.Aggiungere la soluzione madre al flaconcino di reazione fino a quando la concentrazione finale di TCEP è di otto millimolari. Quindi, incubare la soluzione a bagnomaria per un'ora a 50 gradi Celsius mescolando a 500 giri/min. Nel frattempo, preparare una soluzione madre da 100 nanomolari di N-etilmaleimmide sciogliendo 12,5 milligrammi di N-etilmaleimmide in un millilitro di acqua di grado HPLC.Aggiungere la soluzione madre al flaconcino di reazione raffreddato fino a quando la concentrazione finale di N-etilmaleimmide è di 16 millimolari. Quindi, mescolare a 20 gradi Celsius e 500 giri/min per due ore. Dializzare la soluzione utilizzando 12 tubi per dialisi kelodalton in 500 millilitri di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari, agitando a 50 giri/min con un agitatore magnetico durante la notte per rimuovere i reagenti in eccesso.Il giorno successivo, trasferire la fiala di reazione a bagnomaria a 37 gradi Celsius e mescolare a 750 giri/min. Aggiungere immediatamente, un millilitro di soluzione di acido cloroaurico 0,66 millimolare precedentemente preparata al flaconcino di reazione. Dopo aver mescolato per due minuti, aggiungere un idrossido di sodio molare alla soluzione fino a quando il PH è 12 e mescolare per due ore.Dalla fluorescenza del terzo complesso d'oro di BSA, è stato osservato che la conversione della fluorescenza blu intrinseca di BSA in fluorescenza rossa avviene a circa PH 9,7 attraverso una transizione di equilibrio. Le mappe di eccitazione-emissione dell'oro BSA tre a diversi rapporti molari BSA/oro mostrano come l'alterazione dei rapporti molari produca la stessa lunghezza d'onda di emissione a diverse lunghezze d'onda di eccitazione. Rame, nichel e oro si legano in modo competitivo a un sito noto in BSA.La BSA con cappuccio di cisteina 34 mostra un cambiamento nei modelli di picco della mappa di eccitazione-emissione al momento del legame con l'oro e questi risultati mostrano come l'alterazione di specifici siti di legame alteri i modelli di fluorescenza. Il BSA all-tiol-capped-non mostra fluorescenza rossa e rivela legami disolfuro cisteina-cisteina come possibili siti di legame per produrre il fluoroforo rosso. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di regolare il PH come descritto o di utilizzare il tampone corretto perché la formazione di fluorofori dipende dal cambiamento indotto dal PH delle conferme proteiche.

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