Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle comunicazioni intercellulari sulle reciproche interazioni paracrine rispetto a quelle juxtacrine tra due tipi di cellule. Il vantaggio principale di questo metodo è che si tratta di una tecnica molto semplice e riproducibile che cattura accuratamente la segnalazione paracrina in condizioni di coltura tipiche, impedendo allo stesso tempo un'efficace segnalazione juxtacrina. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a una migliore comprensione del meccanismo del crosstalk tra le cellule tumorali e il microambiente tumorale.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra le cellule tumorali e lo stroma tumorale, può essere applicato anche ad altri sistemi come la guarigione delle ferite e l'angiogenesi. Iniziare staccando le cellule tumorali ovariche da una miscela confluente all'80% con un millilitro di tripsina allo 0,25% per 40-60 secondi, seguita dalla neutralizzazione della reazione con sei millilitri di terreno di crescita completo. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di coltura fresco completo.

Dopo il conteggio, diluire le cellule a 100.000 cellule di cancro ovarico per millilitro di concentrazione completa del terreno di crescita e posizionare tre inserti di coltura cellulare con membrana in policarbonato con membrana in policarbonato da 0,4 micrometri invertiti per condizione sperimentale in una piastra di coltura tissutale sterile di dimensioni adeguate. Etichettare gli inserti in base alle condizioni sperimentali e pipettare con cura le cellule tumorali sul fondo di ciascun inserto in cerchi concentrici, partendo dal centro della membrana e spostandosi verso l'esterno per formare una cupola da 800 microlitri. Prestare la massima attenzione quando si seminano le cellule sulla superficie inferiore dell'inserto, in modo che la cupola del terreno contenente le cellule non fuoriesca dai bordi dell'inserto durante l'incubazione.

Quando tutti gli inserti sono stati seminati, coprire il piatto e posizionare con cura gli inserti nell'incubatore per colture cellulari. Dopo circa quattro ore, staccare l'HPMC con due millilitri di tripsina allo 0,25% per uno o due minuti, seguiti dalla neutralizzazione della reazione con 12 millilitri di terreno di coltura completo. Raccogliere l'HPMC mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di crescita completo per il conteggio.

Diluire le cellule a 300.000 HPMC per millilitro di terreno di crescita completo e aggiungere 2,5 millilitri di terreno di crescita completo fresco a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti. Utilizzando una pinza sterile, posizionare ciascun inserto con il lato destro rivolto verso l'alto in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti in modo che le superfici attaccate alle cellule di cancro ovarico inferiore siano immerse nel terreno. Quindi seminare 1,5 millilitri di HPMC nel pozzetto di ciascun inserto.

Quindi posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 72 ore. Al termine dell'incubazione, rimuovere con cura gli inserti da ciascun pozzetto e sciacquare entrambi i lati degli inserti con PBS. Posizionare ogni inserto in una nuova piastra a sei pozzetti e aggiungere 0,5 millilitri di tripsina ai pozzetti dell'inserto e due millilitri di tripsina ai pozzetti inferiori.

Dopo due minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere un millilitro di terreno di coltura completo a ciascun inserto e pipettare accuratamente la soluzione alcune volte senza strappare la membrana o versare la sospensione cellulare nel pozzetto sottostante. Durante il pipettaggio, è necessario prestare attenzione per evitare la contaminazione incrociata delle cellule da una camera con le altre. Trasferire le cellule risospese in una provetta di raccolta marcata e neutralizzare ulteriormente la tripsina con altri due millilitri di terreno di crescita completo.

Per raccogliere le cellule sul fondo degli inserti, sciacquare il fondo delle membrane due o tre volte con i due millilitri di tripsina dal pozzetto corrispondente della piastra a sei pozzetti in modo che le cellule staccate vengano catturate nei fondi dei pozzetti appropriati. Quando tutte le cellule sono state staccate, neutralizzare la tripsina in ciascun pozzetto con sei millilitri di terreno di crescita fresco e trasferire le sospensioni cellulari in provette di raccolta etichettate. Quindi raccogliere tutte le cellule mediante centrifugazione e risospendere i pellet in 0,7 millilitri di reagente di lisi a base di fenolo e tiocianato di guanidina per provetta per l'estrazione e l'isolamento dell'RNA secondo i protocolli standard.

La coltura prossimale di HPMC con cellule di carcinoma ovarico determina un aumento dell'espressione di fibronectina e del fattore di crescita trasformante o TGF beta rispetto all'HPMC di controllo seminato su inserti in assenza di cellule tumorali. L'espressione sia della fibronectina che del TGF beta one aumenta significativamente anche nelle cellule di cancro ovarico dopo coltura prossimale con HPMC rispetto alle cellule ovariche di controllo coltivate in assenza di HPMC. Al contrario, le cellule di carcinoma ovarico trattate con terreno condizionato con HPMC dimostrano un'espressione di fibronectina significativamente ridotta senza alcun cambiamento nell'espressione di TGF beta uno.

Il blocco del TGF beta uno con un anticorpo neutralizzante, tuttavia, provoca una significativa diminuzione dell'espressione del TGF beta uno nelle cellule di cancro ovarico in coltura prossimale con HPMC. È interessante notare che un leggero aumento dell'espressione del TGF beta uno è stato osservato nelle cellule di cancro ovarico di controllo non coltivate prossimalmente, probabilmente come risposta compensatoria. La coltura prossimale con cellule di cancro ovarico aumenta leggermente l'espressione di E-caderina nelle HPMC, mentre una marcata diminuzione della E-caderina è osservata nelle cellule di cancro ovarico cresciute in prossimità di HPMC rispetto ai controlli, dimostrando ulteriormente l'efficacia del sistema di coltura prossimale per lo studio della segnalazione paracrina tra le cellule di cancro ovarico e le cellule normali nel sito di metastasi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ottimizzare il numero di cellule seminate e la durata della coltura prossimale. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoblotting possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sui cambiamenti nell'espressione proteica e sull'attivazione delle vie di segnalazione di elaborazione a valle durante la co-coltura di cellule mesoteliali delle cellule tumorali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del microambiente tumorale, dell'immunologia, della biologia dello sviluppo per esplorare le reciproche interazioni paracrine tra le cellule attraverso fattori secreti.