Name: Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Scopri un metodo di coltura prossimale per studiare la segnalazione paracrina tra cellule tumorali ovariche e HPMCs. Questa tecnica riproducibile isola gli effetti paracrini prevenendo il contatto diretto, offrendo approfondimenti sul microambiente tumorale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Siamo grati ai pazienti per la loro partecipazione nella raccolta di tessuto per questi esperimenti. Un DoD OCRP ovarica cancro Academy Award (W81XWH-15-0253) e un pilota premio di Colleen Dream Foundation a Anirban K. Mitra supportato questa ricerca.

Il protocollo segue le linee guida del Consiglio normativo istituzionale dell'Università Indiana.
1. cella preparazione
<ol><li>
Isolamento e coltura di cellule mesoteliali primarie umane
	<ol>
<li>Cellule mesoteliali primarie umane isolate (HPMCs) dall'omento umano come descritto in precedenza17,18 e farle crescere in completano crescita medio [dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino, 1% penicillina-streptomicina, gli aminoacidi non essenziali di 1% e 1% vitamine] a 37 ° C e 5% CO2. Nota: I HPMCs sono in genere cresciuta fino a 100% confluenza (Figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Condizioni di crescita delle cellule tumorali ovariche
	<ol>
<li>Crescere le cellule tumorali ovariche HeyA8 nel mezzo di crescita completa a 37 ° C e 5% CO2. Nota: Uso HeyA8 cellule coltivate a circa 80% confluenza (Figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. coltura cellulare
<ol><li>
Set-up cultura prossimale
	<ol>
<li>Uso Transwell inserti per piastre da 6 pozzetti con una membrana di 10 μm di spessore del tessuto-cultura-trattati in policarbonato con 0,4 μm pori (108 pori/cm2) e una zona di crescita di 4,67 cm2 . Se necessario, ottimizzare per diverse misure ridimensionando il numero delle cellule seminate secondo l'area di superficie di crescita. Medium di crescita completa calda, tripsina e tampone fosfato salino (PBS) a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare gli inserti
	<ol>
<li>Per le cellule di HeyA8 sulla superficie inferiore della membrana dell'inserto del seme, rimuovere l'inserto dalla confezione usando pinze sterili e posizionarlo invertito in una piastra di coltura sterile cm 15.</li>
		<li>Utilizzare un piatto di 15 cm, come ha la profondità di ospitare l'inserto invertito, o sostituirlo con qualsiasi contenitore sterile appropriato. A seconda dell'esperimento, è necessario inserire il numero desiderato di inserti nel piatto 15 cm.</li>
		<li>Etichetta di conseguenza i tre controlli e tre condizioni sperimentali con un pennarello sul bordo degli inserti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare le cellule tumorali
	<ol>
<li>Tripsinizzano le cellule di HeyA8 cresciute alla confluenza di 80% in un pallone da2 di 25 cm (~ 2 x 106 cellule), aggiungere 1 mL di tripsina (0,25%) per 40-60 s e neutralizzare la tripsina con 6 mL di medium di crescita completa.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 500 x g a temperatura ambiente (TA) per 3 min, eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di crescita completa. Contare le celle dal vivo utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semina le cellule tumorali
	<ol>
<li>Sospendere 100.000 cellule/mL di cellule vive HeyA8 nel mezzo di crescita completa. Attentamente seme 80.000 HeyA8 cellule sospese in 800 μL di medium di crescita completa sul fondo dell'inserto (che è ora rivolto verso l'alto, poiché esso è invertito).</li>
		<li>Seme le cellule per formare una forma a cupola, così le cellule rimangono sull'inserto (Figura 1). Iniziare dal centro della membrana e spostare verso l'esterno in cerchi concentrici, mentre lentamente il pipettaggio. Evitare di andare più di 3 mm dal bordo per impedire qualsiasi fuoriuscita del mezzo. Nota: Il numero delle cellule seminate dipenderà il tasso di crescita delle cellule e la durata dell'esperimento. Il numero di cellule HeyA8 seminato per questa cultura prossimale sono stato ottimizzato e le cellule sarà 80 – 90% confluenti alla fine del terzo giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collegamento delle cellule di cancro
	<ol>
<li>Coprire il piatto di 15cm e spostare con cautela il piatto contenente gli inserti per l'incubatrice di CO2 . È fondamentale per non disturbare la goccia di medium e cellule sull'inserto in questa fase. Lasciare le cellule a 37 ° C per 4 h per consentire le cellule tumorali di allegare all'inserto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare le cellule mesoteliali
	<ol>
<li>Dopo circa 4 h, tripsinizzano la HPMCs cresciuta alla confluenza del 100% in un pallone da2 cm 75 (~ 4 x 106 cellule) con 2 mL di tripsina (0,25%) per 1 – 2 min e neutralizzare la tripsina con 12 mL di medium di crescita completa.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 500 x g per 3 min a RT, risospendere il pellet cellulare in 10 mL di medium di crescita completa e contare le celle dal vivo utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu di trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semina le cellule mesoteliali
	<ol>
<li>Sospendere 300.000 cellule/mL di HPMCs live nel mezzo di crescita completa. Aggiungere 2,5 mL di mezzi freschi di sviluppo completo in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Attentamente e portare il piatto di 15cm contenente gli inserti fuori alla cappa di biosicurezza. Utilizzando pinze sterili, capovolgere l'inserto e posizionarlo nel pozzetto della piastra 6 pozzetti in modo che è in posizione verticale, con le cellule di HeyA8 attaccate alla superficie inferiore immersa nel mezzo di crescita completa (Figura 1).</li>
		<li>HPMCs seme 450.000 sospeso in 1,5 mL di terreno di crescita all'interno degli inserti con le cellule di HeyA8 attaccate alla superficie rivolta verso la parte inferiore del pozzo (Figura 1) o agli inserti senza eventuali cellule di HeyA8 per i controlli HPMC. Aggiungere 1,5 mL di terreno di coltura senza cellule ai controlli HeyA8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cresce la cultura prossimale
	<ol>
<li>Lasciate che la cultura prossimale crescere nell'incubatore CO2 a 37 ° C e 5% CO2 per 72 h. Se necessario, le medie possono essere ricostituite come segue.<ol>
<li>Per l'interno dell'inserto, rimuovere µ l 750 e 750 µ l di terreno di coltura fresco completo.</li>
			<li>Per l'esterno dell'inserto (la piastra 6 pozzetti), prelevare 1 mL e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco completo. 1 mL è stato scelto per la comodità di cambiare il mezzo in un unico passaggio. Se lo si desidera, 1,25 mL può essere rimosso e sostituito invece.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccogliendo le cellule
	<ol>
<li>Raccogliere le cellule dopo 72 h della cultura prossimale. Faccia particolare attenzione in questa fase per evitare contaminazioni delle cellule HeyA8 e HPMCs. Trypsinize le cellule, centrifugare li e lisare il pellet invece di fare l'elettrolisi le cellule sulla membrana per evitare una contaminazione incrociata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinizing le cellule
	<ol>
<li>Risciacquare entrambi i lati dell'inserto con PBS 1X.</li>
		<li>Trasferire gli inserti per un nuovo pozzo e aggiungere tripsina. Aggiungere 0,5 mL di tripsina all'interno dell'inserto e aggiungere 2 mL di tripsina alla piastra 6 pozzetti per tripsinizzano le cellule tumorali fissate alla superficie inferiore dell'inserto. Incubare la piastra per 2 min a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neutralizzare la tripsina
	<ol>
<li>Aggiungere 1 mL di medium di crescita completa all'interno dell'inserto per neutralizzare la tripsina, pipettare su e giù e poi prendere le cellule e trasferirli in una provetta di raccolta contrassegnati. Aggiungere un ulteriore 2 mL di medium di crescita completa per una completa neutralizzazione. Dovrebbe prestare attenzione a non forare la membrana durante il pipettaggio per evitare una contaminazione incrociata delle cellule.</li>
		<li>Per raccogliere le cellule sul fondo dell'inserto, dispensare la tripsina 2 mL che è stato aggiunto nel passaggio 12.2 sulla superficie inferiore 2 – 3 x affinché le cellule cadono nella parte inferiore della piastra 6 pozzetti. Neutralizzare la tripsina sul fondo del piatto con 6 mL di terreno di coltura e trasferire il contenuto della piastra in una provetta di raccolta contrassegnati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta e la lisi delle cellule
	<ol>
<li>Centrifugare le cellule a 500 x g per 3 min e aspirare i media. Risospendere e lisare il pellet cellulare con 0,7 mL di fenolo e guanidina tiocianato-basati - reagente di lisi per l'estrazione di RNA. Isolare il RNA usando qualsiasi kit adatto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. quantitativa Real-Time Polymerase Chain Reaction
Nota: I passaggi seguenti descrivono una reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR) per studiare i cambiamenti di espressioni del gene come risultato la cultura prossimale.
<ol><li>Preparare cDNA da campioni di RNA per qPCR. Utilizzare qualsiasi adatto della trascrittasi inversa con un buffer corrispondente e casuale primer per assicurare la trascrizione inversa di tutti gli mRNA (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Valutare i cambiamenti nei livelli di espressione di mRNA di fibronectina (FN1) ed E-caderina (CDH1) e trasformare il fattore di crescita beta 1 (TGFβ1) da qPCR con gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) come controllo interno. È possibile utilizzare standardizzato analisi di espressione genica disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali) o per disegnare primers.</li>
	<li>Confrontare le cellule HeyA8 in coltura prossimale con HPMCs con i controlli di HeyA8 e il HPMCs in coltura prossimale con i controlli HPMC.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
<li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation%2C+Wound+Healing%2C+and+Tissue+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li>
<li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li>
<li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals%3A+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li>
<li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li>
<li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li>
<li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> 43-58 (2016).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
<li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La comprensione del meccanismo di paracrine e juxtacrine segnalazione tra cellule è essenziale per lo sviluppo di una migliore conoscenza del tessuto normale omeostasi e malattia condizioni7,8. Maggior parte paracrine studi vengono condotti attraverso la raccolta di segnalazione condizionata medio da una cella tipo e usarlo per trattare l'altro tipo di cellula. Questo metodo ha un vantaggio nella sua intrinseca semplicità. Tuttavia, esso non accuratamente ricapit...

Il ruolo di produttivi interazioni reciproche tra cellule tumorali e del microambiente tumorale nella progressione del tumore è stata ben stabilito ed è diventato degli obiettivi principali della ricerca nel cancro biologia1. Casi simili di segnalazione bidirezionale sono cruciali durante la guarigione delle ferite, le risposte immunitarie, angiogenesi, nicchie di cellule staminali e durante lo sviluppo2,3,4,5,6 , 7 , 8. un tema comune a tutti questi processi biologici è che le cellule rispondono in vari modi a segnali extracellulari da loro microambiente che determinano il destino delle cellule, la fisiologia del tessuto e progressione della malattia. Pertanto, la messa a fuoco, diventato sempre più verso lo sviluppo di una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in tali comunicazioni cellula-cellula. Una maggioranza di tali interazioni coinvolgono paracrine o juxtacrine segnalazione tra le cellule. Segnalazione di paracrine coinvolge la secrezione di fattori di segnalazione specifici da una cella che sono percepiti da recettori corrispondenti su un'altra cella nelle vicinanze, innescando una risposta in esso9,10, mentre juxtacrine segnalazione richiede un contatto diretto tra componenti cellulari delle due cellule coinvolte11,12.
Tale segnalazione è una componente fondamentale nell'omeostasi del tessuto, così come nel microambiente tumorale. Le cellule tumorali beneficiano di fattori paracrini e juxtacrine dalle cellule nello stroma del tumore, compreso cancro-collegati di fibroblasti (CAFs), cellule immunitarie e adipociti13,14,15,16. Il paracrine segnalazione può essere mediata da citochine, chemochine, fattori di crescita, ecc., mentre la segnalazione di juxtacrine coinvolge giustapposti ligandi e recettori come tacca di segnalazione, o interazioni tra integrine e delle loro rispettive proteine della matrice extracellulare. Abbiamo dimostrato l'importanza delle interazioni reciproche tra cellule tumorali ovariche e CAFs, progressione e la metastasi del tumore14. Allo stesso modo, le interazioni delle cellule di carcinoma ovarico metastatico con le cellule mesoteliali che copre il sito delle metastasi regolano chiavi microRNA e fattori di trascrizione nelle cellule tumorali che promuovono la colonizzazione metastatica17, 18.
Maggior parte degli studi sulla segnalazione di paracrine implicano l'uso di un raccolto da tipo una cella per trattare il secondo tipo di cella con il medium condizionato. Mentre questo approccio è stato ampiamente utilizzato, non vengono replicate in modo efficace i livelli di alta concentrazione localizzati del fattore secernuto nel microambiente della cellula ricevente. Inoltre non riesce a riprodurre la cinetica del flusso continuo del fattore secreto prodotto da una cellula e ricevuto dalla cella vicina. Paracrino segnalazione è efficace su brevi distanze in quanto i fattori secreti sono alle concentrazioni necessarie solo in prossimità della cella di origine e tendono a diffondere e diluire fuori come la distanza aumenta. Questa alta concentrazione localizzata di fattore secernuto è essenziale per innescare una reazione nella cella del ricevitore. Inoltre, la risposta nelle cellule del destinatario è anche dipenda l'equilibrio dei fattori appena secrete e loro svuotamento continuo attraverso la degradazione, l'associazione e interiorizzazione nella cellule recettive e diffusione dalla cella di origine. Il medium condizionato può essere concentrato sul conto per le più alte concentrazioni localizzate presenti nel microambiente, ma che non può replicare con precisione l'esatta concentrazione. Inoltre, esso non può simulare la cinetica naturale della produzione e lo svuotamento del fattore coinvolto. Per maggiore precisione replicare segnalazione paracrina e separarla da juxtacrine meccanismi di segnalazione, abbiamo messo a punto un metodo novello cultura prossimale, che coinvolge coltivare due tipi cellulari su entrambe le superfici di una membrana porosa. I pori sono abbastanza piccoli per evitare interazioni juxtacrine e ancora permettere lo scambio di fattori secreti alle alte concentrazioni localizzate. In questo modo, questo sistema mantiene la cinetica di produzione e lo svuotamento dei fattori paracrini.

<table><tbody><tr><td>Supporto permeabile Transwell da 24 mm con 0,4 &; micro; m Inserto membrana in policarbonato poroso</td><td>Corning (Costar)</td><td>3412</td><td>&bull; 10 &micro; M spessa membrana in policarbonato traslucido & BULL; Trattato per un fissaggio ottimale delle cellule &bull; Confezionato 6 inserti in una piastra a 6 pozzetti, 4 piastre per cassa &bull; La membrana deve essere colorata per garantire la visibilità cellulare & bull; Sterilizzato mediante radiazioni gamma</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>Fondo piatto, trattato TC, sterile, con coperchio</td></tr><tr><td>Piastra di coltura da 15 cm</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>Piastra di coltura cellulare sterile con trattamento TC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Ammino non essenziale acidi</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamine</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td> Atlanta <td>Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td></td><td></td><td>Qualsiasi marca va bene</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td></td><td></td> a CO2 <td>Qualsiasi marca va bene</td></tr><tr>Armadio <td></td><td></td><td>di livello II di biosicurezza</td><td>Qualsiasi marca va bene</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan Gene Expression Saggio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>kit di isolamento del mini RNA miRNeasy</td> Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità <td>Qiagen</td><td>217004 ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>HeyA8 cellule di cancro ovarico</td><td>Ottenuto da Ernst Lengyel Lab, Università di Chicago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; Anticorpi neutralizzanti</td><td>R& Sistemi D</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Le interazioni intercellulari svolgono un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Paracrino o juxtacrine segnalazione media tali interazioni. L'uso di un medium condizionato e coculture studi sono i metodi più comuni di discriminare tra questi due tipi di interazioni. Tuttavia, l'effetto di localizzate elevate concentrazioni di fattori secreti nel microambiente durante le interazioni paracrine con precisione non è ricapitolata dal medium condizionato e, così, può portare a conclusioni imprecise. Per ovviare a questo problema, abbiamo messo a punto un metodo di cultura prossimale per studiare segnalazione paracrina. I due tipi cellulari sono coltivati su entrambe le superfici di una membrana di policarbonato spessore µm 10 con 0,4 µm pori. I pori consentono lo scambio di fattori secreti e, allo stesso tempo, inibiscono la segnalazione di juxtacrine. Le cellule possono essere raccolte e lisate sull'endpoint per determinare gli effetti della segnalazione di paracrine. Oltre a consentire per gradienti di concentrazione localizzate di fattori secreti, questo metodo è favorevole agli esperimenti che coinvolgono periodi prolungati di cultura, così come l'uso di inibitori. Mentre usiamo questo metodo per studiare le interazioni tra cellule tumorali ovariche e le cellule mesoteliali che incontrano nel sito di metastasi, può essere adattato a qualsiasi due tipi di cellule aderenti per i ricercatori a studiare paracrine segnalazione in vari campi, compreso lo sviluppo, immunologia e microambiente tumorale.

Le cellule di cancro ovarico metastatico ritrovarvi con cellule mesoteliali presso il sito di metastasi all'interno della cavità peritoneale19. Interazioni paracrine e juxtacrine produttive con l'aiuto di cellule mesoteliali nell'indurre risposte adattative nelle cellule del cancro ovarico, che consentono di riuscita metastasi17,18,20,21 ...

Interazioni cellulari paracrine e juxtacrine gioca un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Qui, un metodo di coltura prossimale viene utilizzato per studiare segnalazione paracrina dove le concentrazioni localizzate dei fattori secreti sono mantenute, evitando il diretto contatto cellulare.

Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle comunicazioni intercellulari sulle reciproche interazioni paracrine rispetto a quelle juxtacrine tra due tipi di cellule. Il vantaggio principale di questo metodo è che si tratta di una tecnica molto semplice e riproducibile che cattura accuratamente la segnalazione paracrina in condizioni di coltura tipiche, impedendo allo stesso tempo un'efficace segnalazione juxtacrina. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a una migliore comprensione del meccanismo del crosstalk tra le cellule tumorali e il microambiente tumorale.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni tra le cellule tumorali e lo stroma tumorale, può essere applicato anche ad altri sistemi come la guarigione delle ferite e l'angiogenesi. Iniziare staccando le cellule tumorali ovariche da una miscela confluente all'80% con un millilitro di tripsina allo 0,25% per 40-60 secondi, seguita dalla neutralizzazione della reazione con sei millilitri di terreno di crescita completo. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di coltura fresco completo.Dopo il conteggio,

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

In questo video, sviluppiamo un modello di co-coltura prossimale di cellule tumorali ovariche e cellule mesoteliali umane primarie. Questo modello fisiologicamente rilevante consente lo studio della segnalazione paracrina, in cui le concentrazioni localizzate dei fattori secreti vengono mantenute impedendo il contatto cellulare diretto.

Sistema di coltura prossimale: una tecnica di coltura in vitro per studiare la segnalazione paracrina tra le cellule

Abbiamo adattato un inserto di membrana microporosa permeabile per imitare il microambiente tumorale (TME). Il modello è costituito da una coltura cellulare mista, consente la generazione semplificata di singole popolazioni cellulari altamente arricchite senza l'uso di marcature fluorescenti o di smistamento cellulare e consente di studiare la comunicazione intercellulare all'interno del TME in condizioni normali o di stress.

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

È descritto un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza, permettendo per la dissezione delle vie nell'endotelio, muscolo liscio, o tra endotelio e muscolo liscio (bivio myoendothelial) di segnalazione. L'applicazione selettiva di agonisti o isolamento della proteina, microscopia elettronica o immunofluorescenza può essere utilizzata usando questo modello della coltura cellulare.

Un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza

Vi presentiamo un protocollo per studiare il crosstalk tra X-ray-irradiati Caco-2 e cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Il protocollo inizia con irradiazione di Caco-2 e set-up della co-cultura con PBMC; Successivamente, trans-epiteliale resistenza elettrica è misurata regolarmente nel corso di 48 h e occidentale della macchia eseguita in Caco-2 e PBMC.

Un metodo di co-coltura di indagare il Crosstalk tra raggi x irradiati PBMC e cellule Caco-2

Forniamo i protocolli per la valutazione delle cellule staminali mesenchimali isolate da polpa dentale e interazioni delle cellule di carcinoma della prostata basati su metodi diretti e indiretti di co-coltura. Mezzo di condizione e trans-pozzo membrane sono adatte per analizzare attività paracrina indiretta. Seeding differenzialmente macchiato le cellule insieme è un modello appropriato per interazione diretto cellula-cellula.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Qui, presentiamo un metodo utilizzando supporti a membrana permeabili per facilitare lo studio della segnalazione paracrina senza contatto utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Il sistema è suscettibile di studiare il ruolo dei fattori secreti sul tumore nell'smorzamento dell'attivazione dei macrofaci.

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Il presente studio delinea un metodo altamente riproducibile e trattabile per studiare gli eventi di segnalazione Wnt paracrini non canonici in vitro.  Questo protocollo è stato applicato per valutare l'impatto della segnalazione paracrina Wnt5a nelle cellule della cresta neurale murina e nei mioblasti.

Modellazione paracrina non canonica Wnt Signaling In Vitro

In questo articolo, un inserto stampato in 3D di nuova concezione viene presentato come modello di co-coltura e convalidato attraverso lo studio della comunicazione intercellulare paracrina tra cellule endoteliali e cheratinociti.

Un innovativo inserto stampato in 3D progettato per consentire colture cellulari 2D e 3D semplici

Test di sensibilità visiva in lucertole utilizzando un paradigma di condizionamento operante che si avvale di riproduzione video di casuale-puntino kinematograms e generati dal computer invertebrati.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Scopri un metodo di coltura prossimale per studiare la segnalazione paracrina tra cellule tumorali ovariche e HPMCs. Questa tecnica riproducibile isola gli effetti paracrini prevenendo il contatto diretto, offrendo approfondimenti sul microambiente tumorale.

Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Esplora altri video