Modello del polmone acellulare e cellulari per lo studio di metastasi del tumore

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave relative alla progressione del tumore. Il modello acellulare e polmonare cellulare ex vivo permette la formazione di tumore primario che cresce nel tempo e forma cellule tumorali circolanti e lesioni metastatiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di studiare la progressione del cancro in un tempo abbreviato e la crescita di diversi tipi di cellule tumorali.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia personalizzata, in quanto le cellule tumorali dei pazienti possono essere utilizzate nel modello per valutare l'efficacia dei farmaci terapeutici, comprese le cellule immunitarie. Inizia con un ratto profondamente anestetizzato. Radere il torace e l'addome e pulire la pelle con un tampone di clorexidina.

Dopo aver aperto la cavità toracica, eseguire una toracotomia bilaterale tagliando il lato anteriore della gabbia toracica a sinistra nel lato destro del diaframma. Tenere la gabbia toracica sollevata e iniettare due millilitri di eparina da 1000 unità per millilitro nel ventricolo destro del cuore battente utilizzando un ago calibro 27 per prevenire la formazione di coaguli di sangue nel polmone. Dopo aver rimosso la gabbia toracica, posizionare un ago calibro 18 nel ventricolo sinistro come sfiato per consentire l'uscita del sangue, quindi utilizzare un ago calibro 25 per iniettare 15 millilitri di 12,5 unità per millilitro di PBS eparinizzato nel ventricolo destro.

Successivamente, tagliare la trachea alla base della tiroide e rimuovere con cura l'aorta discendente a livello della vena emiazygos e i rami dell'aorta all'arco. Dopo aver rimosso il blocco cuore-polmone dalla cavità toracica, tagliare metà dei ventricoli destro e sinistro e quindi posizionare una cannula ad ago in acciaio inossidabile calibro 18 attraverso il ventricolo destro nell'arteria polmonare principale. Fissare la cannula con la cravatta di seta 2-0 ed esporre con cura il ventricolo destro e l'atrio.

Iniziare facendo scorrere il PBS eparinizzato a una pressione di perfusione fisiologica di 30 millimetri di mercurio fino a quando non fluisce liberamente nel flacone dell'unità di decellularizzazione, quindi collegare il blocco cuore-polmone all'unità di decellularizzazione all'estremità dell'arteria polmonare attraverso la cannula dell'arteria polmonare. Dopo 15 minuti di lavaggio con PBS eparinizzato, sostituire il flacone di PBS eparinizzato con uno contenente 0,15% di dodecil solfato di sodio e acqua deionizzata e perfondere il polmone per due ore per la decellularizzazione. Dopo la decellularizzazione, l'acqua autoclavata deionizzata perfuse attraverso l'impalcatura polmonare per 15 minuti, seguita da un detergente non ionico all'1% in acqua deionizzata per 10 minuti.

Infine, sostituire il flacone con 500 millilitri di PBS autoclavato integrato con antibiotici. Far funzionare la pompa a sei millilitri al minuto e perfondere i polmoni per 72 ore, dopodiché il polmone acellulare è pronto per l'uso immediato. Spruzzare etanolo al 70% sulla cartuccia della pompa e impostare l'ossigenatore collegando l'estremità di uscita dell'ossigenatore al tubo della pompa e l'altra estremità a un tubo da 1,5 piedi nel bioreattore.

Posizionare il flacone del bioreattore in una cabina di biosicurezza in condizioni asettiche. Collegare un rubinetto a tre vie alla testa di un Luer lock femmina per controllare il flusso attraverso l'arteria polmonare, quindi collegare un rubinetto a senso unico a un'altra paratia Luer lock femmina per l'inseminazione cellulare attraverso la trachea. Collegare un tubo da due pollici all'esterno e un tubo da sei pollici all'interno della bottiglia per far circolare il fluido.

Preparare il tubo per collegare la bottiglia del bioreattore all'ossigenatore. Montare un Luer lock maschio su un tubo da due piedi e collegare un Luer femmina stile T per fornire accessibilità, e collegare un Luer lock maschio e un Luer lock femmina a due tubi per piedi. Aggiungere il terreno di coltura cellulare e trasferire il bioreattore nell'incubatore.

Collegare il tubo dell'ossigenatore alle due estremità aperte per renderlo un bioreattore a circuito chiuso. Far funzionare la pompa a sei millilitri al minuto per riempire l'ossigenatore e le provette con terreno di coltura in modo che non esistano bolle d'aria nel tubo. Una volta che i tubi sono stati riempiti con il fluido, chiudere il rubinetto e scollegare gli ossigenatori da entrambe le estremità della bottiglia del bioreattore.

Mettere il flacone del bioreattore nella cabina di biosicurezza, far passare il terreno di coltura attraverso il rubinetto e collegare la cannula polmonare dell'impalcatura polmonare. Se si lavora con il modello polmonare cellulare, saltare la decellularizzazione. Il polmone prelevato può essere posizionato diadicamente nel bioreattore.

Far passare nuovamente il terreno di coltura attraverso il rubinetto unidirezionale per rimuovere l'aria e legare la cannula tracheale con un filo di seta alla trachea, quindi chiudere il tappo del flacone del bioreattore. Trasferire il bioreattore nell'incubatore e avviare la pompa. Eseguire il terreno di coltura per 10-15 minuti per assicurarsi che tutti i lobi si gonfino e che il polmone appaia in buona forma.

Modificare l'impalcatura polmonare acellulare o cellulare come segue per il modello metastatico. Aprire il tappo del bioreattore con l'impalcatura polmonare sospesa e utilizzare una siringa Luer lock per far passare cinque millilitri di terreno di coltura attraverso la trachea. Usa una pinza angolare per far passare 2-0 seta attraverso la trachea nel punto di biforcazione.

Legare la trachea che va al polmone destro nel punto di biforcazione e controllare il libero flusso del terreno attraverso la trachea al polmone sinistro facendo passare il terreno di coltura. Preparare un volume di 50 millilitri di cellule tumorali del polmone come A549 o H1299 in terreni di coltura completi RPMI 1640 a una concentrazione di due o tre milioni di cellule per millilitro. Posizionare una siringa Luer lock da 20 millilitri sopra la cannula tracheale e aggiungere 15 millilitri di cellule alla siringa.

Lasciare che la sospensione cellulare passi attraverso i lobi polmonari per gravità. Aggiungi il resto delle celle prima che passino le bolle d'aria. Una volta seminata, rimuovere la siringa e attendere 15 minuti, quindi aggiungere il terreno fresco al bioreattore.

Rimetterlo nell'incubatrice e, dopo aver rimosso eventuali bolle d'aria, perfondere l'impalcatura polmonare a sei millilitri al minuto. L'istopatologia di un polmone intatto mostra gli alveoli e gli pneumociti. Come si vede qui, la decellularizzazione porta alla completa rimozione delle cellule polmonari e l'istopatologia dei polmoni acellulari rivela una membrana basale intatta.

La colorazione del pentacromo e dell'elastina di Movat di un polmone decellularizzato rivela la presenza di collagene, fibrina ed elastina con vascolarizzazione e bronchi intatti. L'analisi del DNA del polmone decellularizzato mostra una riduzione del contenuto di DNA di oltre il 99%Il polmone acellulare può essere utilizzato direttamente nel bioreattore per la coltura cellulare. Un'analisi istologica mostra la presenza di crescita tumorale.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di iniettare l'eparina nel ventricolo destro del cuore. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro per esplorare le alterazioni genetiche ed epigenetiche che portano alla metastasi delle cellule tumorali nel cancro del polmone.