Name: Multiplex monitoraggio terapeutico del farmaco da diluizione dellisotopo HPLC-MS/MS di antibiotici in malattie critiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Impara il monitoraggio terapeutico degli antibiotici in terapia intensiva con HPLC-MS/MS. Questo metodo quantifica cefepime, meropenem e piperacillin in siero umano per ottimizzare le dosi in 30 minuti.

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Gli autori ringraziano il Dr. Schütze per il suo aiuto con la creazione del metodo presentato e Dr. Zoller per il prezioso contributo per quanto riguarda l'intervallo di calibrazione corretta. Gli autori riconoscono anche lo staff tecnico della struttura di spettrometria di massa.

Nota: Si consiglia di lavorare in una cappa quando si maneggia il solvente organico, come il metanolo. Preparare tutti i buffer e fasi mobili in matracci tarati. Se non diversamente specificato, le soluzioni possono essere conservate a temperatura ambiente per fino a 1 mese dopo la preparazione.
1. preparazione dei calibratori e campioni di controllo di qualità
Nota: Una scheda di analisi di dati corrispondente per la preparazione di soluzioni stock e spike è data nel File supplementare. Per motivi di tracciabilità, inserire il produttore, numero di catalogo e molto numero di ciascun antibiotico nelle colonne corrispondenti. Sciogliere tutti gli antibiotici in una camera frigorifera a 4 ° C e mantenere il tempo di lavoro più breve possibile.
<ol><li>Preparare 100 mL di metanolo al 25% in acqua: prefill un matraccio tarato da 100 mL con 25 mL di metanolo assoluto e riempirlo fino a 100 mL con acqua distillata.</li>
	<li>Preparare 10 mL di acido acetico 200 mM in acqua: prefill un matraccio tarato da 10 mL con 9 mL di acqua di grado HPLC, 115 µ l di acido acetico glaciale (99,5% di purezza, 17,4 M) e aggiungere acqua distillata fino a 10 mL.</li>
	<li>Preparare 25 mL di metanolo al 25% in acqua con acido acetico 20 mM: prefill un matraccio tarato da 25 mL con 2,5 mL di soluzione di acido acetico acquoso 200mm, aggiungere 6,25 mL di metanolo assoluto e riempire il pallone a 25 mL con acqua distillata.</li>
	<li>Utilizzare una scala di precisione per pesare la corretta quantità di antibiotici in provette coniche da 15 mL, come descritto nel File supplementare nella colonna peso iniziale.</li>
	<li>Preparare soluzioni di riserva dei fluorochinoloni, ciprofloxacina e moxifloxacina in 25% metanolo-acqua tra cui l'acido acetico 20 mM. Per effettuare questa operazione, è possibile aggiungere il volume corrispondente ai quantitativi ponderati come descritto nel File supplementare nella colonna "volume finale". Sciogliere rapidamente gli antibiotici di fluoroquinolone in bagno a ultrasuoni per 2 min e intenso nel Vortex.</li>
	<li>Preparare soluzioni di riserva di cefepime, meropenem, linezolid e piperacillina in 25% metanolo-acqua. A tale scopo, aggiungere il volume corrispondente alle quantità ponderata come descritto nel File supplementare nella colonna volume finale e sciogliere rapidamente gli antibiotici intensi nel Vortex. Sciogliere la sostanza Ultima meropenem.</li>
	<li>Combinare le soluzioni di riserva di tutti gli antibiotici come descritto nella tabella corrispondente volume della soluzione di riserva nel File supplementare per produrre dieci volte spike-soluzioni concentrate.</li>
	<li>Spike nove volumi di droga-libero del siero con un unico volume delle soluzioni concentrate spike dieci volte per ottenere i calibratori di siero 0 – 7 e controlli di qualità (QC) – D. Ad esempio, aggiungere 0,5 mL di soluzione di spike a 4,5 mL di siero in una provetta di polipropilene 10 mL e Incubare 15 min in celle frigorifere a 4 ° C su un mixer a rulli a 50 giri/min.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta ripetitiva per generare aliquote di 100 µ l dei calibratori e QCs in provette da 1,5 mL in polipropilene.</li>
	<li>Conservare i calibratori, controlli di qualità e soluzioni antibiotiche stock a-80 ° C fino a sei mesi.</li>
	<li>Per ogni antibiotico, anche preparare una soluzione ordinata che contiene 1.000 mg/L di un singolo antibiotico. Diluire la soluzione di riserva corrispondente con un diluente appropriato (ad esempio, per la ciprofloxacina, uso 25% metanolo-acqua tra cui l'acido acetico 20 mM). Nota: Le soluzioni antibiotiche ordinate sono necessari per la messa a punto dello strumento solo.</li>
</ol>2. preparazione della miscela standard interni
Nota: Standard interni sono etichettati isotopo controparti degli analiti di interesse che vengono aggiunti ad un campione durante la pulitura del campione. Come le altre norme interne hanno proprietà nel complesso fisico-chimiche quasi identiche alle loro controparti senza etichetta, essi compensare gli effetti di matrice di un dato campione.
<ol><li>Preparare 10 mL di metanolo al 50% in acqua aggiungendo 5 mL di metanolo assoluto in un pallone di scossa di 10 mL e riempirlo fino a 10 mL con acqua distillata.</li>
	<li>Preparare 10 mL di metanolo al 50% in acqua tra cui l'acido acetico 20 mM. Per effettuare questa operazione, aggiungere 1 mL di acido acetico 200 mM in una bottiglia da 10 mL, aggiungere 5 mL di metanolo assoluto e riempirlo fino a 10 mL con acqua distillata.</li>
	<li>Generare soluzioni di riserva di standard interni (IS) con 1.000 mg/L direttamente nelle fiale fornite dal produttore. Sciogliere il cefepime -13C12D3 solfato in acqua distillata, meropenem-D6, linezolid-D3e piperacillina-D5 in una soluzione di metanolo-acqua del 50%. Sciogliere il ciprofloxacin-D8 in 50% metanolo-acqua con 20 mM acetato e moxifloxacina cloridrato -13C1D3 in acqua distillata con acetato 20 mM.</li>
	<li>Combinare le soluzioni stock IS in un tubo in polipropilene 1,5 mL per produrre un quintuplo mix concentrato di standard interno. Aggiungere 10 µ l di cefepime -13C12D3, 10 µ l di meropenem-D6, 1 µ l di ciprofloxacina-D8, 2 µ l di moxifloxacina cloridrato -13C1D3, 2 µ l di linezolid-D 3e 10 µ l di piperacillina-D5 a 965 µ l del 25% di metanolo-acqua.</li>
	<li>Memorizzare le soluzioni stock standard interne e il quintuplo mix concentrato di IS a-80 ° C.</li>
</ol>3. campione deposito
Nota: Assicurarsi che il siero si ottiene più velocemente possibile e che venga mantenuta la catena del freddo di campioni congelati.
<ol><li>Raccogliere il sangue intero nelle provette di raccolta del siero.</li>
	<li>Lasciate che il coagulo di sangue per 20 – 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Separare il siero dal sangue mediante centrifugazione a 2.000 x g per 10 min.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una provetta pulita in polipropilene.</li>
	<li>Memorizzare il siero fino a sei mesi a-80 ° C fino a quando esso viene analizzato. In alternativa, conservare i campioni a 3 giorni a-20 ° C.</li>
</ol>4. buffer preparazione per cromatografia
<ol><li>Per preparare il formiato di ammonio 1 M in acqua, sciogliere 6,306 g di formiato di ammonio in 100 mL di acqua di grado HPLC usando un pallone da agitare di 100 mL. Conservare la soluzione a 1 mese a 4 ° C.</li>
	<li>Preparare il mobile fase un [formiato dell'ammonio 10 mM in acqua-formico acido (99.9:0.1 v/v)]. Prefill un matraccio tarato da 1000 mL con circa 500 mL di acqua di grado HPLC, aggiungere 1 mL di acido formico e 10 mL della soluzione di formiato di ammonio 1 M e riempirlo a 1.000 mL di acqua di grado HPLC. Fase mobile A trasferire una bottiglia di vetro pulita e collegarlo al sistema HPLC. Fase mobile archivio fino a 2 settimane a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la fase mobile metanolo assoluto grado HPLC B. trasferimento in una bottiglia di vetro pulita e collegarlo al sistema HPLC.</li>
	<li>Utilizzare metanolo assoluto come l'ago lavare solvente e collegare il tubo corrispondente alla bottiglia di vetro contenente la fase mobile B.</li>
	<li>Generare il sigillo e un solvente di eliminazione dei fogli inceppati di metanolo-acqua-formico acido (7:92.9:0.1, v/v/v). Prefill un matraccio tarato da 1000 mL con circa 500 mL di acqua distillata, aggiungere 70 mL di metanolo assoluto, 1 mL di acido formico e aggiungere acqua distillata 1.000 mL. Trasferire il solvente per una bottiglia di vetro pulita e collegarlo con il sistema HPLC. Nota: Vari sistemi di autocampionatore utilizzano sia un forte e un solvente di lavaggio dell'ago debole. In tal caso, preparare le soluzioni di lavaggio secondo le raccomandazioni del produttore. Ad esempio, il forte lavaggio con metanolo-acqua-isopropylic alcool (70:20:10, v/v/v) e i deboli si lavano con acqua-metanolo (95: 5, v/v).</li>
</ol>5. strumento di ottimizzazione
Nota: Questo passaggio viene eseguita per la messa a punto del metodo su uno spettrometro di massa specifico.
<ol><li>Diluire l'analita ordinato 1.000 mg/L e le soluzioni di standard interno 01:10 o 1: 100 in una miscela di fase mobile A e B (50: 50, v/v), a seconda le intensità di segnale del rivelatore. Ottimizzare lo spettrometro di massa con la funzione autotune o fare una sintonizzazione manuale per i seguenti ioni di padre e figlia transizioni14: cefepime (481.0 &gt; 167.0/395.7), cefepime -13C12D3 (485.1 &gt; 167,1 / 400.0), meropenem (384.1 &gt; 114.0/141.0), meropenem-D6 (390,1 &gt; 114.0/147.2), ciprofloxacina (332.0 &gt; 231.0/245.0), ciprofloxacina-D8 (340.1 &gt; 235.1/249.3), la moxifloxacina (402.0 &gt; 261.0/383.9), la moxifloxacina-13 C1D3 (406,1 &gt; 265.1/388.0), linezolid (338.0 &gt; 235.0/296.0), linezolid-D3 (341.1 &gt; 235.1/297.1), piperacillina (518.0 &gt; 143.0/358.9) e piperacillina-D5 (523.1 &gt; 142.8/364.1).</li>
	<li>Per strumenti con autotuning, utilizzare la funzione autotune per regolare automaticamente le impostazioni dell'ingresso MS e tensione attraverso i rilevatori.</li>
	<li>Per strumenti con sintonizzazione manuale, regolare le impostazioni (ad esempio, la collisione tensione ed energia di collisione) fino a quando l'optimum (solitamente il massimo) l'intensità del segnale è ottenuta al rivelatore per ciascuno ione padre e figlia. Ad esempio, collegare un tee miscelazione, consegnare la fase mobile A e B (50: 50, v/v) a 0,5 mL/min e infondere continuamente lo standard di antibiotico o interno ordinato con una portata di 0,1 mL/min.</li>
</ol>6. set-up HPLC-MS/MS
Nota: Dispone di uno spettrometro di massa, sistema HPLC (tra cui l'autocampionatore) e il software corrispondente dipendono dal produttore. Adattare i parametri di uno spettrometro di massa e la procedura di lavaggio secondo le raccomandazioni del produttore.
<ol><li>Memorizzare i parametri di uno spettrometro di massa in un corrispondente 'MS tune file'. Utilizzare elettrospray in modalità positiva (ESI +) per tutti gli analiti. Adattare le impostazioni dell'origine dello ione per lo strumento utilizzato (ad esempio, una tensione capillare di 1,5 kV, una temperatura di origine di 120 ° C, una temperatura di desolvatazione di 400 ° C, un tasso di flusso del gas di desolvatazione di 600 L/h, una tensione di lente RF di 0,1 V e un tempo di sosta di 80 ms).</li>
	<li>Specificare l'analita e standard interni ottimizzare i parametri (ad es., tensione capillare, energia di collisione) in un 'MS file'.</li>
	<li>Impostare le condizioni di autocampionatore come segue nel 'file di ingresso ': la temperatura del campione a 10 ° C con un limite di ± 5 ° C; la sequenza di lavaggio 1 x spurgo-lavaggio-eliminazione dei fogli inceppati con un 600 µ l eliminazione dei fogli inceppati di sostituzione del volume.</li>
	<li>Nelle suddette 'file di ingresso ', impostare la portata nominale di 0,4 o 0,5 mL/min, la fase di esecuzione per 4 min, il limite di alta pressione a 345 bar e la temperatura della colonna a 30 ° C con un limite di ± 5 ° C. Aggiungere il nome del solvente di fasi mobili A e B e impostarle su 7% B/93% A, rispettivamente.</li>
	<li>Programmare il gradiente cromatografico nella 'file di ingresso ' come segue: 0.00 – 0,10 min con 7% fase mobile A B/93%, 0,11 – 0,60 min con 65% fase mobile A B/35%, 0.61 – 2,10 min con 95% fase mobile A B/5%, 2.11 – 4,00 min con fase mobile 7% B/93% A. Nota: Calcolare il volume extra-colonna, il volume di rapina per la piattaforma strumentale e i fattori di ritenzione dell'analita come descritto nella Guida di riferimento USP &lt; 621 &gt; Cromatografia16.</li>
</ol>7. campione misura Master File
Nota: Con la 'file master di misura campione ', i campioni dei pazienti vengono specificati, l'analisi di HPLC-MS/MS viene avviato e viene eseguita la valutazione dei dati. Vengono generati due file di modello separato, tra cui una coppia di bassa e alta qualità di controllo; un modello include coppia QC A e C, l'altra una coppia QC B e D.
<ol><li>Creare un nuovo 'file master di misura campione '. Selezionare le suddette 'MS tune file', 'file MS'e 'file di ingresso' (sezione 6), inserirli in ogni riga di esempio e specificare il volume di iniezione con 15 µ l.</li>
	<li>In ordine crescente, è necessario aggiungere il "testo di esempio" per calibratori 0 – 7 e controllo qualità (CQ) coppia a/c o QC coppia b/d.</li>
	<li>Specificare il tipo di campione. Selezionare il tipo di campione "standard" per i calibratori e "QC" per le coppie di controllo di qualità.</li>
	<li>Specificare la concentrazione di ogni sostanza antibiotica per la corrispondenti calibratori e controlli di qualità (Vedi il foglio di calcolo, concentrazione [µ g/mL] Cal 7 – Cal 0, QC a/c o b/d,).</li>
	<li>Programma i 'metodo di valutazione di dati '. Utilizzare le transizioni che sono state ottimizzate durante lo strumento Ottimizzazione (sezione 5). Una partita ogni antibiotico con lo standard dell'isotopo-etichetta corrispondente (ad es., meropenem - meropenem-D6).</li>
</ol>8. campione Cleanup e analisi HPLC-MS/MS
Nota: Per ogni batch di esempio, un controllo di qualità accoppiato con una bassa e alta concentrazione di antibiotico (QC a/c o b/d QC) è elaborato ed analizzato. Fra i gruppi differenti, i campioni accoppiati di QC sono utilizzati in una sequenza alternata (ad es., il giorno 1, selezionare il 'file master di misura campione ' tra cui QC coppia a/c; il giorno 2, selezionare la coppia QC compresa un b/d. Il trattamento dei campioni di siero è illustrato nella Figura 1.
<ol><li>Preparare l'agente di precipitazione 10% metil -tert-butil etere in metanolo (10:90, v/v) (ad es., matraccio tarato prefill un 25-mL con 2,5 mL di metil -tert-butil etere e riempirlo a 25 mL con metanolo assoluto).</li>
	<li>Collocare la fase di inversione C8 nella camera di colonna. Collegarlo al HPLC e spettrometro di massa nella direzione del flusso.</li>
	<li>Generare l'elenco di esempio. Aprire il relativo 'file master di misura campione ' modello e aggiungere i campioni dei pazienti significati da elaborare all'elenco. Generare gruppi di fino a 20 campioni dei pazienti e li affiancano con la coppia corrispondente di controllo di qualità.</li>
	<li>Bagnato-prime il sistema HPCL con la 'file di ingresso ' software di controllo: impostare la funzione di "primo bagnato" fase mobile 50% B A/50% e bagnato-prime per 2 min con un flusso di 1 mL/min.</li>
	<li>Aggiornare la siringa. Per effettuare questa operazione, è necessario eseguire 6 tratti di 600 µ l del software di controllo.</li>
	<li>Equilibrare la colonna in fase inversa C8. Utilizzando il software, attivare il flusso nel 'file di ingresso ' e a filo con 7% mobile fase A B/93% per un minimo di 5 min, utilizzando un tasso di flusso di 0,5 mL/min verificare la temperatura della colonna di 30 ° C.</li>
	<li>Scongelare i campioni dei pazienti, un'aliquota di calibratori 0 – 7 e un paio di controllo di qualità (o A / B o C/D).</li>
	<li>Con una pipetta ripetitiva, aggiungere 25 µ l della miscela standard interna per la 100 µ l calibratore, campione QC o siero del paziente in un tubo da 1,5 mL in polipropilene e vortexare il tubo per pochi secondi.</li>
	<li>Incubare la miscela per 5 min a temperatura ambiente in un agitatore del benchtop (ad es., a 1.200 giri/min).</li>
	<li>Con una pipetta ripetitiva, aggiungere 150 µ l di reagente precipitazione per il campione-interni mix standard.</li>
	<li>Ancora una volta, vortice il tubo per pochi secondi e incubare per 5 min a temperatura ambiente in un agitatore del benchtop (ad es., a 1.200 giri/min).</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 20.000 x g in una centrifuga da tavolo per 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Diluire il sopranatante 1:3 con acqua di grado HPLC utilizzando un flaconcino di vetro con un micro-inserto e caricarlo come trasformati campioni per l'autocampionatore.</li>
	<li>Avviare manualmente l'analisi di HPLC-MS/MS 'file di controllo di misura campione '. Nota: Per una conservazione prolungata, lavare bene la colonna analitica secondo la raccomandazione del costruttore [ad esempio, 0,5 mL/min metanolo-acqua (50: 50, v/v)] per evitare il collasso di fase.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig1.jpg"> Figura 1: rappresentazione schematica della pulitura campione. Precipitazione della proteina presso l'elevata forza centrifuga dà un pellet denso e chiaro surnatante, che indica tale precipitazione della proteina è stata completata. L'intero tempo di elaborazione è di circa 30 min, compreso la pulitura di campione, la separazione cromatografica e l'analisi di MS/MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58148/58148fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
9. quantificazione e valutazione della qualità
<ol><li>Per elaborare i campioni, aprire il relativo 'file di controllo di misura campione ', selezionare i calibratori, controlli di qualità e campioni dei pazienti e valutarli con il 'metodo di quantificazione di antibiotici '.
</li>
	<li>Verificare se le cime per un analita specifico sono adeguatamente integrate. Ispezionare le cime per ogni calibratore, QC e campione del paziente e manualmente reintegrarli alla linea di base, se necessario.</li>
	<li>Studiare la curva di taratura ed esaminare se esso soddisfa i seguenti criteri di qualità: a) linearità sopra l'intervallo di calibrazione intero, b) una calibrazione coefficiente r2 &gt; 0.995, c) la deviazione di ogni taratura standard entro ± 15% della valore nominale, fatta eccezione per il limite inferiore di quantificazione (LLOQ), dove occorre ± 20%.</li>
	<li>Rifiutare un standard di calibrazione non conforme ai criteri di cui sopra e rivalutare la curva di taratura, compresa l'analisi di regressione.</li>
	<li>Studiare i controlli di qualità ed esaminare se le deviazioni sono entro ± 15% del valore nominale.</li>
	<li>Se la concentrazione di campione del paziente supera la concentrazione del calibratore più alto, diluire il campione con acqua distillata fino a 1:5 (ad esempio, 100 µ l di siero plus 400 µ l di acqua distillata) prima la pulizia del campione. Unicamente passi 8.8 – 8,14 per quel campione specifico e rielaborare esso.</li>
</ol>

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<li>Meropenem: Highlights of prescribing information. , Available from:
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<li>Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from:
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<li>Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf</a> (2010).</li>
<li>Linezolid: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf</a> (2011).</li>
<li>Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf</a> (2017).</li>
<li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+biobanking+conditions+on+six+antibiotic+substances+in+human+serum+assessed+by+a+novel+evaluation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 54 (2), 265-274 (2016).</li>
<li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+piperacillin%2C+tazobactam%2C+cefepime%2C+meropenem%2C+ciprofloxacin+and+linezolid+in+serum+using+an+isotope+dilution+UHPLC-MS%2FMS+method+with+semi-automated+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 53 (5), 781-791 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo manoscritto, segnaliamo il protocollo per un metodo basati sulla spettrometria di massa tandem semplice e robusto per la quantificazione degli antibiotici utilizzati di frequente in ICU19, vale a dire cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid, e La piperacillina14. Un foglio di calcolo accompagna il manoscritto per la preparazione di soluzioni stock di antibiotici, calibratori e controlli di qualità, tenendo conto la purezza degli antibiotici e...

Anche se gli antibiotici hanno rivoluzionato la pratica della medicina, gravi infezioni batteriche rimangono delle cause principali di morbilità e mortalità in malattie critiche1. A questo proposito, la gestione rapida di un antinfettivo adatto in una dose adeguata è dell'importanza più in alto per controllo di malattia2.
Un corpo crescente di prova dimostra che il trattamento empirico con antibiotici ad ampio spettro sta diventando sempre più problematico con la complessità delle popolazioni di pazienti. Questo è particolarmente vero per le unità di terapia intensiva (ICU), dove un'enorme variabilità inter-individuale dei principali parametri di farmacocinetica (PK) è osservata frequentemente3,4. Di conseguenza, pazienti in terapia intensiva sono a rischio imminente di livelli subterapeutici con il pericolo di un successo terapeutico insufficiente5,6. Poi di nuovo, i pazienti sono inutilmente esposti a eccessivamente alte concentrazioni di antibiotiche che possono causare gravi eventi avversi con nessun benefici clinici7. Sia l'abuso di antibiotici e il dosaggio insufficiente inoltre hanno alimentato la diffusione della resistenza agli Antibiotico, che sta diventando una crescente minaccia alla salute pubblica8.
Per migliorare l'uso di antibiotici e di preservare la loro effectivenessas a lungo possibile, l'organizzazione mondiale della sanità ha lanciato un piano d'azione globale sulla resistenza agli antimicrobici nel 20159. Programmi di stewardship antibiotica costituiscono un caposaldo essenziale dell'uso prudente antimicrobico in sanità pubblica nazionale strategie10, aiutando i medici a migliorare significativamente la qualità di cura del paziente11 e, allo stesso tempo, riducendo la resistenza antibiotica12. Antimicrobica di dosaggio nei singoli pazienti attraverso l'applicazione di farmaci terapeutici monitoraggio (TDM) è uno strumento fondamentale in questo contesto13.
Ad oggi, disponibili in commercio TDM dosaggi distano solo per gli antibiotici glicopeptidi e aminoglicosidi. La quantificazione di sostanze da altre classi comunemente richiede una convalida che può essere ingombrante o lo sviluppo del metodo in-House. Quindi, presentiamo in dettaglio il protocollo per una robusta analisi basati sulla spettrometria di massa che può essere utilizzato per la quantificazione degli antibiotici più rilevanti in terapia intensiva all'interno di loro clinica rilevante concentrazione gamme14. Il metodo è stato recentemente istituito nella nostra struttura di spettrometria di massa ed è stato applicato per la routine TDM in terapia intensiva da allora. La procedura utilizza un'impostazione analitica lineare e semplice con una pulizia uniforme del campione, permettendo la rapida attuazione dell'antibiotico TDM in molti servizi con funzionalità di spettrometria di massa.
Il protocollo descritto qui è stato ottimizzato per la quantificazione di cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid e piperacillina nel siero umano, mediante cromatografia liquida (LC) a diluizione dell'isotopo in combinazione con un tandem massa spettrometria (MS/MS). Per la diluizione dell'isotopo metodologia di LC-MS/MS, composti stabili dell'isotopo-identificati vengono aggiunti ad un campione di interesse con una matrice specifica (ad es., siero). Isotopo-etichetta standard possono essere distinti dalla loro controparte senza etichetta, vale a dire l'analita di interesse, a causa di diversi pesi molecolari della molecola naturale e loro prodotti di frammentazione, definiti una transizione di genitore-ion-a-figlia-ion. Come isotopo-labeled composti hanno un comportamento nel complesso fisico-chimico quasi identico rispetto alla loro controparte senza etichetta, sono standard interni ideale per il MS/MS, che permette una quantificazione quasi indipendente dalla matrice analita con un elevato grado di precisione15. Al giorno d'oggi, molti stabile dell'isotopo-etichetta interno standard che può essere utilizzato per la quantificazione della piccolo-molecola, tra cui il TDM di antimicrobici, sono disponibili in commercio.
La separazione cromatografica degli analiti antibiotici nel protocollo descritto viene eseguita con una colonna di inverso-fase di C8--lunghezza della catena alchilica analitica (100 mm x 2,1 mm, 3 µm granulometria). Durante lo sviluppo del metodo, i fattori interni matrix standard normalizzato per tutti gli analiti era tra 94,6% e 105,4%, con un coefficiente di variazione di ≤8.3%14.

<table><tbody><tr><td>cefepime cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1097636</td><td>USP Standard</td></tr><tr><td>di riferimento meropenem triidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001252</td><td>EP Standard di riferimento</td></tr><tr><td>ciprofloxacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>moxifloxacina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1581</td><td></td></tr><tr><td>linezolid</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td></td><td></td>L466500</tr><tr><td>piperacillina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93129</td><td></td></tr><tr><td>cefepime-13C12D3 solfato</td><td>Alsachim</td><td>C1297</td><td>Standard interno marcato con isotopi per cefepime</td></tr><tr><td>meropenem-D6</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M225617</td><td>Standard interno marcato con isotopi per meropenem</td></tr><tr><td>ciprofloxacina-D8</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>C482501</td><td>Standard interno marcato con isotopo per ciprofloxacina</td></tr><tr><td>moxifloxacina-13C1D3 cloridrato</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M745003</td><td>Standard interno marcato con isotopo per moxifloxacina</td></tr><tr><td>linezolid-D3</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>L466502</td><td>Standard interno marcato con isotopo per linezolid</td></tr><tr><td>piperacillina-D5</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>P479952</td><td>Isotopo marcato interno standard per piperacillina</td></tr><tr><td>, metanolo</td>, <td>JT Baker,</td><td>8402</td><td></td></tr>, <tr><td>acqua di grado HPLC,</td><td>JT Baker</td><td>4218</td><td></td></tr>, <tr><td>acido formico</td><td>Biosolve</td><td>6914132</td><td></td></tr>, <tr><td>acido acetico</td><td>, Biosolve</td><td>1070501</td><td></td></tr><tr><td>formiato di ammonio,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221-25G-F</td><td></td>,</tr><tr><td>etere metilico terz-butilico</td>, <td>Merck</td><td>101845</td><td></td></tr><tr><td>Fortis 3 &mu; m C8 100 * 2,1 mm</td><td>Fortis</td><td>F08-020503</td><td></td></tr><tr><td>Prifilter incassato in Ti-PEEK (2 &mu; m)</td><td>Chromsystems</td><td>15011</td><td></td></tr><tr><td>2795 Alliance HPLC system</td><td>Waters</td><td>176000491</td><td></td></tr><tr><td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td><td>Waters</td><td>720000338</td><td></td></tr><tr><td>QuanLynx 4.1 software</td><td>Waters</td><td>/</td><td>Data evaluation software fornito dal produttore dello spettrometro di massa</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multiplex monitoraggio terapeutico del farmaco da diluizione dell'isotopo hplc-ms/ms di antibiotici in malattie critiche

Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

C'è una domanda sempre crescente per il monitoraggio terapeutico del farmaco di antibiotici in molte strutture cliniche, soprattutto per quanto riguarda l'attuazione di programmi di stewardship antibiotica ospedaliera.
Nel lavoro attuale, presentiamo un protocollo multiplex ad alte prestazioni liquido cromatografia-spettrometria di massa tandem (HPCL-MS/MS) per la quantificazione di cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid e piperacillina, comunemente usato antibiotici in terapia intensiva. Il metodo è stato convalidato in precedenza completamente secondo le linee guida dell'Agenzia europea dei medicinali.
Dopo una pulizia rapida campione, gli analiti sono separati su una colonna HPLC di inverso-fase C8 entro 4 minuti e quantificati con il corrispondente stabile isotopo-etichetta standard interni in spettrometria di massa electrospray ionizzazione (ESI +) nella reazione più tempo di monitoraggio (MRM). Il metodo proposto utilizza una strumentazione semplice impostazione con condizioni cromatografiche uniforme, consentendo il monitoraggio terapeutico del farmaco antibiotico giornaliero e robusto in laboratori clinici. La curva di taratura si estende la gamma di concentrazione farmacocinetiche, compresi quindi gli importi antibiotici vicino la concentrazione inibitoria minima (MIC) di batteri sensibili e le concentrazioni di picco (Cmax) che si ottengono con bolo regimi di somministrazione. Senza la necessità della diluizione del siero prima la pulizia del campione, l'area sotto la curva per un antibiotico somministrato può essere ottenuta attraverso misurazioni multiple.

Utilizzando il protocollo descritto, un tipico cromatogramma è raffigurato in Figura 2. Secondo la farmacopea degli Stati Uniti (USP) cromatografia orientamenti16, il volume morto di colonna nel sistema attuale è stato determinato con ~0.22 mL e il volume extra-colonna (tra cui l'iniettore, tubi e connettori) con ~0.08 mL, dando un volume di hold-up di ~0.30 mL. I fattori di ritenzione calcolato per tutti gli analiti sono stati 2,8 (pe...

Qui presentiamo un protocollo basati sulla spettrometria di massa tandem per la quantificazione degli antibiotici frequentemente utilizzati nelle unità di cura intensiva, cioè cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid e piperacillina.

Multiplex monitoraggio terapeutico del farmaco da diluizione dell'isotopo HPLC-MS/MS di antibiotici in malattie critiche

There is an ever-increasing demand for the therapeutic drug monitoring of antibiotics in many clinical facilities, particularly with regard to the ...

Il monitoraggio terapeutico degli antibiotici è sempre più riconosciuto come un elemento importante per l'attuazione di programmi nazionali e locali di gestione degli antibiotici. Per soddisfare questa crescente domanda di monitoraggio dei farmaci antibiotici terapeutici nelle strutture mediche, presentiamo un protocollo per la quantificazione degli antibiotici in circolazione che mira ad adeguare il dosaggio alla suscettibilità dei patogeni coinvolti. Il protocollo basato sulla spettrometria di massa presentato è stato ottimizzato per la quantificazione degli antibiotici più comunemente usati nelle unità di terapia intensiva, vale a dire cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid e piperacillina.A causa dell'ampio intervallo di calibrazione, il metodo può essere utilizzato anche per calcolare l'area farmacocinetica sotto la curva per un antibiotico somministrato. Con un tempo di risposta totale di circa 30 minuti, il protocollo presentato è adatto per il monitoraggio quotidiano dei farmaci terapeutici antibiotici nei laboratori clinici. Per prima cosa, aggiungere nove volumi di siero senza farmaci con un volume di soluzioni spike concentrate da 10 volte preceden

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Qui, descriviamo un protocollo utilizzando laser capture microdissection accoppiato con analisi LC/MS spazialmente-quantificare distribuzioni di droga all'interno dei granulomi della tubercolosi polmonare. L'approccio ha ampia applicabilità a quantificare le concentrazioni di farmaco all'interno di tessuti ad alto dettaglio spaziale.

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La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) viene utilizzata per identificare la disregolazione dei metaboliti in pazienti con varie malattie. Questa tecnica consente la quantificazione dei metaboliti squilibrati, svelando le intuizioni fisiopatologiche. Qui, descriviamo la procedura passo-passo dell'approccio basato sulla risonanza magnetica magnetica per la caratterizzazione metabolica dei pazienti.

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Impara il monitoraggio terapeutico degli antibiotici in terapia intensiva con HPLC-MS/MS. Questo metodo quantifica cefepime, meropenem e piperacillin in siero umano per ottimizzare le dosi in 30 minuti.

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