Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo dell'efferocitosi, come il ruolo delle molecole di segnalazione nel mediare l'assorbimento delle cellule apoptotiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una chiara quantificazione dell'assorbimento cellulare apoptotico, incluso l'assorbimento cellulare apoptotico parziale o frammentario, che non è sempre evidente con altri metodi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'efferocitosi da parte delle cellule immunitarie, può essere applicato anche ad altri tipi di cellule, come le cellule epiteliali o tumorali.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della difficoltà di ottimizzare le impostazioni di acquisizione del microscopio. Dopo aver preparato i macrofagi umani e le cellule Jurkat apoptotiche, utilizzare un emocitometro per contare le cellule apoptotiche. Quindi trasferire una quantità sufficiente di cellule apoptotiche in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Pellettare le celle Jurkat tramite centrifugazione a 500 volte g per cinque minuti. Quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS. Mentre le cellule Jurkat sono nella centrifuga, aliquotare 10 microlitri di DMSO in una nuova provetta per microcentrifuga.

Successivamente, sciogliere una quantità minima di NHS-Biotina nel DMSO. Successivamente, trasferire 500 microlitri della cellula apoptotica e della sospensione di PBS nella provetta contenente DMSO e NHS-Biotina. Quindi, diluire un colorante appropriato per il tracciamento delle cellule secondo le istruzioni del produttore.

Incubare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Quindi, aggiungere un volume uguale di RPMI 1640 con il 10% di FBS e incubare la sospensione a temperatura ambiente al buio per altri cinque minuti. Successivamente, pellettare le celle tramite centrifugazione a 500 volte g per cinque minuti.

Quindi scartare il surnatante e risospendere le cellule colorate in 100 microlitri di RPMI 1640 con il 10% di FBS. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare colorata goccia a goccia a ciascun pozzetto di macrofagi. Quindi centrifugare la piastra a 200 volte g per un minuto.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 in un incubatore per colture tissutali. Dopo l'adeguato periodo di incubazione, rimuovere le cellule dall'incubatrice. Quindi lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS.

Successivamente, aggiungere la streptavidina diluita coniugata con FITC in ciascun pozzetto. E incubare la piastra per 20 minuti al buio. Lavare le cellule tre volte con un millilitro di PBS e agitare delicatamente i campioni per cinque minuti dopo ogni risciacquo.

Quindi fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare le celle una volta con PBS per rimuovere l'eccesso di PFA. Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino per immagini e trasferire il vetrino su un microscopio a fluorescenza.

Cattura pile Z di un numero sufficiente di celle per la quantificazione. È fondamentale impostare la distanza tra tali sezioni in modo tale da rilevare tutto il materiale apoptotico inghiottito. La distanza massima tra tali sezioni non deve essere maggiore della profondità focale dell'obiettivo, in genere da 0,5 a un micrometro.

Carica uno degli stack Z nel software utilizzando la funzione Importa. Quindi seleziona Densità integrata come opzione di misurazione nel pannello Imposta misure. L'analisi è più facile da eseguire se entrambi i canali del colorante della streptavidina e del tracciamento cellulare sono visualizzati come sovrapposizione.

Qualsiasi oggetto con colorazione di streptavidina in qualsiasi punto lungo una circonferenza dovrebbe essere considerato positivo alla streptavidina e, pertanto, non dovrebbe essere quantificato come negativo alla streptavidina. Una volta caricata l'immagine, utilizzando la streptavidina e lo strumento di selezione a mano libera, o poligono, cerchiare tutti i positivi del colorante di tracciamento delle celle in un unico piano della pila Z. Quindi, misurare l'intensità integrata del colorante di tracciamento cellulare nella regione.

Nella stessa sezione Z utilizzare la colorazione con streptavidina e lo strumento di selezione a mano libera o poligono per cerchiare tutto il materiale positivo per la streptavidina positiva al colorante di tracciamento cellulare. Infine, misura l'intensità integrata di questa regione. Utilizzando questa procedura, oltre il 95% delle cellule Jurkat trattate con Staurosporina è andato incontro ad apoptosi.

Nella maggior parte degli esperimenti, la frazione di cellule apoptotiche efferocitate è aumentata in modo dipendente dal tempo. Quando si ottimizza questo protocollo per diversi tipi di cellule efferocitiche o diversi bersagli di cellule apoptotiche, è importante testare l'intervallo dei rapporti tra cellule apoptotiche e cellule efferocitiche. Di solito i rapporti di 10 a uno o 30 a uno funzionano meglio.

Questa procedura può essere facilmente modificata per tracciare l'attivazione della molecola di segnalazione o il traffico intracellulare esprimendo geni reporter fluorescenti nelle cellule efferocitiche, consentendo così l'imaging di questi processi durante l'efferocitosi.