Preparazione di una cultura di cellula primaria di alta qualità da cadaveri di pesci
28 agosto 2018
Qui descriviamo un protocollo per preparare ed effettuare colture primarie di cellule ipofisarie da medaka (Oryzias latipes). Le condizioni ottimizzate in questo protocollo prendere importanti parametri quali temperatura, osmolarità e pH in considerazione imitando le condizioni fisiologiche del pesce, consentendo in tal modo risultati fisiologicamente più significativi.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'endocrinologia riguardo al funzionamento e all'interazione delle cellule ipofisarie in un ambiente controllato. I principali vantaggi di questa tecnica sono che promuove risultati fisiologicamente significativi per medaka e fornisce una guida di riferimento per la realizzazione di colture cellulari primarie da altre specie. Inizia fissando la testa del medaka alla lastra di cera con un ago sottile inserito sopra la bocca e uno su ciascun lato della testa dietro il cervello.
Metti il pesce sotto un microscopio da dissezione e usa una pinza fine con una punta angolata per raschiare delicatamente le squame dalla sommità della testa. Inserire con cautela la pinza sotto la pelle del lato della testa e muovere lentamente la pinza verso la bocca per rimuovere il tetto del cranio. Tagliare completamente il midollo spinale con il forcipe e capovolgere con cura il cervello verso la bocca per esporre l'ipofisi.
Raccogliere la ghiandola con una pinza pulita con una punta dritta in un tubo di plastica contenente 1,5 millilitri di DPBS modificato su ghiaccio. Quando tutti gli ipofisi sono stati raccolti, centrifugare i tessuti con una microcentrifuga per uno o due secondi a temperatura ambiente e utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere con cura il DPBS facendo attenzione a non disturbare il pellet ipofisario. Lavare il fazzoletto con un millilitro di soluzione di tripsina per altri uno o due secondi nella microcentrifuga e utilizzare la pipetta di vetro per aspirare la maggior parte del surnatante.
Quando tutta la tripsina è stata rimossa, aggiungere un altro millilitro di tripsina al campione e incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 26 gradi Celsius per 30 minuti con un leggero movimento occasionale. Al termine dell'incubazione, centrifugare l'ipofisi per uno o due secondi e utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere la maggior parte della tripsina senza disturbare il tessuto. Quindi, lavare il campione con un millilitro di soluzione di inibitore della tripsina per inattivare la tripsina e centrifugare per uno o due secondi.
Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere un altro millilitro di soluzione di inibitore della tripsina alla provetta e incubare il campione in un bagno d'acqua a 26 gradi Celsius per 20 minuti con flicking. Mentre il tessuto è in incubazione, aggiungere due millilitri di terreno L-15 a una piastra di coltura cellulare codificata in poli-D-lisina da 35 millimetri con fondo centrale in vetro ed equilibrare la piastra a 26 gradi Celsius e all'1% di anidride carbonica per almeno 10 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare l'ipofisi per uno o due secondi e aspirare con cura tutta la soluzione di inibitore della tripsina dalla provetta.
In una cappa a flusso laminare, aggiungere un millilitro di DPBS modificato a freddo ghiacciato ai pezzi di tessuto ipofisario e utilizzare una pipetta di vetro lucidata a fuoco per triturare delicatamente i tessuti da sei a sette volte sul ghiaccio, facendo attenzione a evitare bolle. Dopo un'altra centrifugazione di uno o due secondi, trasferire delicatamente circa un millilitro della cellula dissociata contenente lo strato superiore di DPBS in una nuova provetta da 15 millilitri su ghiaccio. Ripetere la triturazione e la raccolta delle cellule dissociate altre nove volte fino a quando non sono stati utilizzati tutti i 10 millilitri di DPBS, iniziando dal puntale della pipetta con un'apertura di medie dimensioni e passando a un puntale della pipetta con l'apertura più piccola per gli ultimi tre o quattro millilitri di DPBS.
La dissociazione meccanica con una pipetta di vetro è una fase fondamentale di questo protocollo e richiede un po' di formazione per ottenere un buon risultato. Pipettare delicatamente la soluzione cellulare per evitare di danneggiare le fragili cellule dissociate. Dopo la 10a triturazione, segnare il lato di ciascuna provetta in cui si troverà il pellet e centrifugare il campione in una centrifuga pre-raffreddata.
Al termine della centrifugazione, rimuovere con cautela la provetta dalla centrifuga e utilizzare una pipetta di vetro per trasferire immediatamente ma delicatamente il surnatante in una provetta di plastica da 15 millilitri, avendo cura di rimuovere la maggior parte del surnatante senza disturbare il piccolo pellet spesso invisibile, quindi risospendere con cura il pellet in 50-100 microlitri di terreno di coltura L-15. Far gocciolare con cura le cellule dissociate al centro della piastra di coltura cellulare precedentemente preparata e lasciare che le cellule affondino sul fondo della piastra per circa cinque minuti prima di spostare la capsula nell'incubatrice per evitare che le cellule si diffondano al di fuori dell'area infossata del fondo di vetro. Dopo 30 minuti a 26 gradi Celsius e all'1% di anidride carbonica, controllare le cellule al microscopio ottico per confermare che si siano attaccate al fondo del piatto e restituire la coltura di cellule ipofisarie dissociate all'incubatore per non più di sette giorni.
La raccolta di circa 10 ipofisi adulte di medaka di solito si traduce in una densità di circa 50.000-100.000 cellule per piatto dopo la semina. Il numero di cellule morenti è quasi costante nel tempo, con oltre il 95% delle cellule vitali dopo un giorno e oltre il 90% ancora vive dopo tre giorni, con un piccolo calo della vitalità osservato a una settimana di coltura. Le registrazioni elettrofisiologiche delle cellule gonadotrope dell'ormone luteinizzante GFP dimostrano che le cellule ipofisarie dissociate sono in grado di attivare spontaneamente potenziali d'azione dopo quattro giorni in coltura.
Inoltre, dopo la stimolazione dell'ormone di rilascio delle gonadotropine, un'iniziale iperpolarizzazione transitoria della membrana cellulare è seguita da un drammatico aumento della frequenza di attivazione che è concomitante con la depolarizzazione e l'aumento della durata dei potenziali d'azione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di lavorare in modo preciso ed efficiente per mantenere le cellule ipofisarie in uno stato sano. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la qPCR o tecniche di imaging avanzate per rispondere a ulteriori domande su come trattamenti specifici possono alterare la fisiologia delle cellule ipofisarie.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la preparazione e il mantenimento di colture cellulari primarie dell'ipofisi del pesce medaka (Oryzias latipes). Il metodo ottimizza le condizioni considerando temperatura, osmolarità e pH per simulare ambienti fisiologici, facilitando osservazioni significative sulla funzione ipofisaria.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Endocrinologia
- Tecniche di coltura cellulare
- Modellistica fisiologica
Sfondo
- Le colture cellulari primarie di ipofisi provenienti da pesci non sono ampiamente stabilite.
- Il protocollo mira a riprodurre condizioni fisiologiche per ottenere dati più pertinenti.
- Comprendere le interazioni tra le cellule dell'ipofisi è fondamentale per l'endocrinologia.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per lo studio della fisiologia delle cellule pituitarie.
- Stabilire un riferimento per la creazione di colture provenienti da altre specie.
- Facilitare la ricerca sulla regolazione ormonale e sull'interazione cellulare.
Metodi Utilizzati
- Metodologia di coltura cellulare adattata specificamente per il tessuto pituitario di medaka.
- Comprende la dissezione accurata e la dissociazione enzimatica dei tessuti.
- Le cellule vengono mantenute in un ambiente controllato a 26°C e 1% CO2.
- I passaggi critici includono la dissociazione meccanica e una manipolazione accurata per mantenere la vitalità cellulare.
Risultati principali
- I test di vitalità mostrano una viabilità cellulare superiore al 90% fino a tre giorni in coltura.
- Le cellule dissociate dimostrano potenziali d'azione e risposte alla stimolazione ormonale.
- Il metodo consente analisi successive, come la qPCR, per approfondire lo studio della fisiologia cellulare.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un protocollo affidabile per esaminare la funzione pituitaria nell'ovale di medaka.
- La metodologia fornisce informazioni applicabili ad altre specie e utili per lo studio delle funzioni endocrine.
- I risultati supportano l'esplorazione delle azioni ormonali e migliorano la comprensione della dinamica cellulare in endocrinologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La creazione di colture cellulari primarie fisiologicamente rilevanti a partire da specie non mammifere consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione di bersagli endocrini, fornendo un sistema controllato per lo studio delle vie di segnalazione ormonale. Questo approccio aumenta la capacità predittiva nella fase iniziale della scoperta, permettendo una valutazione quantitativa delle risposte cellulari all'ormone liberatore delle gonadotropine e ad altri modulatori. Il protocollo offre un quadro trasferibile per adattare le tecniche di coltura primaria a diversi sistemi modello, migliorando l'estrapolazione interspecie nella ricerca preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione delle cellule pituitarie e della risposta ormonale in un ambiente controllato.
- Valore operativo: Fornisce un sistema riproducibile per valutare i cambiamenti elettrofisiologici indotti da ligandi nelle cellule gonadotrope.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule primarie dissociate adatte ai test di vitalità e alle rilevazioni elettrofisiologiche.
- Valore operativo: Produce densità cellulari costanti (50.000–100.000 cellule/piatto) per la semina standardizzata nei saggi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mantenendo la vitalità cellulare e la funzionalità fino a una settimana.
- Valore operativo: Consente applicazioni successive come la qPCR e l'analisi avanzata delle immagini per valutare gli effetti del trattamento sulla fisiologia pituitaria.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro di scoperta precoce fornendo un modello cellulare biologicamente rilevante per l'analisi dei percorsi endocrini prima delle attività di identificazione dei composti guida.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sui meccanismi di segnalazione cellulare dell'ipofisi e sulla regolazione ormonale.
- Screening: Fornisce output quantitativi, inclusi percentuali di vitalità e misurazioni della frequenza del potenziale d'azione.
- Analisi: Permette letture elettrofisiologiche e molecolari che supportano l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca traslazionale: Mantiene cellule ipofisarie funzionali in coltura prolungata, sostenendo studi preclinici allineati a biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di coltura primaria adattabile, applicabile ad altre specie non mammifere con opportuni aggiustamenti ambientali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli endocrini attraverso modelli cellulari fisiologicamente significativi.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità mediante procedure standardizzate di dissociazione, semina e incubazione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo consentendo una valutazione precoce degli effetti dei composti sulla funzione delle cellule pituitarie.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei bersagli endocrini in base a risposte cellulari validate.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di microdissezione e dissociazione enzimatica dei tessuti.
- È subordinato all'accesso a incubatori con controllo termico regolati a 26°C e 1% di CO2.
- Necessita di una formulazione standardizzata del mezzo, regolata per l'osmolarità e il pH specifici dei pesci.
- Comporta considerazioni di adattamento nel trasferire il protocollo ad altre specie con parametri fisiologici differenti.
- È limitato dalla fragilità delle cellule pituitarie dissociate, che richiedono una manipolazione delicata durante i passaggi di triturazione meccanica.
